Abstract
metastaser er en viktig årsak til dødelighet hos kreftpasienter. Invadopodia er ansett for å være viktige strukturer som tillater kreftceller til å trenge inn i hele den ekstracellulære matriks (ECM) ved hjelp av matriks-metalloproteinaser (MMP). Tidligere isolert vi en meget inngripende A431-III underlinjen fra foreldre A431 celler ved Boyden kammeret analysen. De A431-III celler ha høyere invasive og trekk evner, forhøyede nivåer av MMP-9 og en forbedret epitelial-mesenchymale overgang (EMT) fenotype. I denne studien, oppdaget vi at A431-III-celler hadde en økt potensial til å danne invadopodia og en forbedret evne til å nedbryte ECM sammenlignet med de opprinnelige A431-celler. Vi har også observert forbedrede fosforylering nivåer av cortactin og Src i A431-III celler; disse fosforylerte proteiner har blitt rapportert å være den viktigste regulatorer av invadopodia formasjon. Flavonoider, nesten overalt fordelt i matplanter og plante matvarer, har blitt dokumentert å stille ut anti-tumor egenskaper. Derfor var det av stor interesse å undersøke effekten av flavonoid antioksidanter på metastatisk aktivitet av A431-III celler. Eksponering av A431-III celler til to potente kosttilskudd flavonoider, nemlig luteolin (Lu) og quercetin (Sandsvær), forårsaket hemming av invadopodia dannelse og minsk i ECM degradering. Vi konkluderer med at Lu og Qu dempe fosforylering av cortactin og Src i A431-III celler. Som en konsekvens, er det oppstår en forstyrrelse av invadopodia generering og undertrykkelse av MMP sekresjon. Disse endringene, på konsert, få til en reduksjon i metastase
Citation. Lin Y-C, Tsai P-H, Lin C-Y, Cheng C-H, Lin T-H, Lee KPH, et al. (2013) Effekt av flavonoider på matriksmetalloproteinase sekresjon og Invadopodia Dannelse i meget inngripende A431-III kreftceller. PLoS ONE åtte (8): e71903. doi: 10,1371 /journal.pone.0071903
Redaktør: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge
mottatt: 6 april 2013; Godkjent: 04.07.2013; Publisert: 21 august 2013
Copyright: © 2013 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Taiwan Academia Sinica Tematisk Project (AS-96-TP-B06 til MTL). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:. Dr. Chithan C. Kandaswami er ansatt i Castle Hills Health. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
metastaser, spredning av kreft fra opprinnelsessted til distale vev i kroppen , er ansett å være den viktigste bidragsyter til dødelighet i et flertall av krefttyper [1]. Over 90% av kreftassosiert dødsfall som følge av metastase og likevel mekanismene som kontrollerer metastasering gjenstår å bli ytterligere belyst [2]. MMP’er er de best dokumenterte kritiske proteolytiske enzymer som er forbundet med tumormetastase [3]. For å lette metastase, tumorceller er avhengig av aktiviteten av mer enn ett MMP og andre mer generelle nedbrytende enzymer for å sette dem i stand til å krysse vev barrierene de møter under prosessen av invasjon. Det antas at MMP degradere ECM, og at denne virkning gjør det mulig for tumorceller til å migrere, invadere og spre seg til diverse sekundære steder i kroppen hvor de danner metastaser. MMP’er regulere svulsten mikromiljøet, og deres ekspresjon og aktivering øker i nesten alle humane kreftformer sammenlignet med de i normalt vev ekvivalent med kreft [4]. Et vell av nylig påløpt informasjon tyder på at MMP rekrutteres til unike overflatestrukturer, som betegnes invadopodia, og at de er da i stand til å gjennomgå sekresjon [5], [6].
Invadopodia ble først oppdaget i fibroblaster forvandlet av v-src onkogen, som koder for et konstitutivt aktiv ikke-reseptor tyrosin kinase v-src [7], og begrepet ble skapt i 1989 [8]. Invadopodia er spesialisert aktin-basert membran fremspring som finnes i kreftceller som forringer ECM via lokalisering av proteaser [9]. Deres evne til å formidle ECM degradering antyder en avgjørende rolle for invadopodia i kreft invasjon og metastasering. Invadopodia bestå av mange actin regulatoriske proteiner slik som cortactin, N-veps, Arp2 /3 og cofilin [10]. Selv om disse aktin regulatoriske proteiner er også deler av andre aktin basert membran fremspring, står matrise-nedbrytningsevne ut som en stor, viktig og forutsigbar indeks over invadopodia identifikasjon. Tre MMP, MMP-2, MMP-9 og MT1-MMP [11], er rapportert å bli rekruttert til invadopodia for å få deres nedbrytningsevne. Men de detaljerte mekanismer som MMP transporteres og målrettet mot invadopodia, og videre skilles fortsatt i stor grad ukjent.
I de senere årene har flere molekylære spillere operative i invadopodia har blitt definert av mutasjonsstudier, RNA interferens undersøkelser eller av distribusjon av hemmende antistoffer. Blant disse har den sentrale rollen for Src ikke-reseptor-tyrosinkinase i invadopodia regel blitt utledes; senere undersøkelser har vist at Src-kinase-aktivitet er essensiell for invadopodia dannelse og fungerer [12], [13]. Faktisk denne aktiviteten av Src kinase i seg selv førte til oppdagelsen av invadopodia. Fosforylering av komponent proteiner er avgjørende for invadopodia regulering og dette innebærer i hovedsak tyrosinfosforylering av Src kinase. En rekke Src underlag, som cortactin, Tks5, dynamin2, AMAP1 /ASAP1 og N-WASP, har blitt lokalisert til invadopodia og kreves av dem for å være aktiv [10], [14], [15]. Når Src kinase aktiveres ved oppstrøms-integrin-signalering eller vekstfaktor stimulering, disse proteiner undergå tyrosin-fosforylering; Dette regulerer da deres funksjon som adaptere eller tillater dem å kommunisere med hverandre under montering av aktin nettverk [12], [16]. Mutasjon av tyrosin fosforyleringsseter på disse proteinene hemmer invadopodia dannelse og fungerer [15], [17], noe som ytterligere understøtter viktigheten av tyrosinfosforylering til invadopodia formasjonen. I tillegg til tyrosinfosforylering av Src, har protein kinase C også blitt rapportert å synergize med Src og til å delta i reguleringen av invadopodia ved fosforylering serin eller treonin [16].
Cortactin, en aktin regulatorisk protein som fungerer både under aktivering og stabilisering trinn på aktin forgrening, har nylig blitt tegning fremtredende oppmerksomhet på grunn av sin rolle i invadopodia formasjon [18]. Cortactin ble først identifisert som et Src tyrosinkinase substrat [19]. Den ble oppkalt cortactin fordi den er lokalisert til kortikale aktin strukturer. Menneskelig cortactin kodes av
CTTN plakater (tidligere
EMS 1
) på kromosom 11q13, som ofte forsterkes i ulike kreftformer, som brystkreft, hode og nakke [20]. Genamplifikasjon som resulterer i en overekspresjon av cortactin har blitt funnet å være assosiert med høyere metastaser /invasjon og en dårlig prognose [21]. I overensstemmelse med sin aktinbinding evne, har cortactin blitt funnet å lokalisere til perifere cellestrukturer, som for eksempel lamellipodia og invadopodia. Nyere studier som tar sikte på å utforske de molekylære mekanismene som regulerer aktin polymerisasjon før MMP rekruttering har antydet at cortactin fosforylering er avgjørende for invadopodia dannelse og modning [22] .Disse funn tyder på at Src tyrosin kinase og underlaget cortactin sammen spille svært viktige roller i kreft invasjon og migrasjon [23].
for å bestemme hvordan cellene styrer invadopodia formasjon, har flere forskere vist en samling av farmakologisk aktive forbindelser med sikte på å finne kjemikalier som er i stand til å hemme prosessen. Plant flavonoider har blitt anerkjent i noen tid som besitter anti-tumor og anti-differensiering effekter [24] – [27]. Tidligere identifiserte vi to kosttilskudd flavonoid bestanddeler, Lu, en flavone, og Sandsvær, en flavonol, som noen av de mest potente plante flavonoider i forhold til deres
in vitro
biologiske aktiviteter. De fremviser en rekke anticancer-effekter, slik som dempningen av cellevekst og kinase aktivitet, induksjon av apoptose, en svekkelse av differensiering, undertrykkelse av MMP sekresjon, reduksjon i tumorcelle adhesjon, inhibering av metastase og reduksjonen i angiogenese [28] – [31]. Selv om disse to flavonoider er potensielt effektive som anti-invasive forbindelser, til dags dato ingen studie har vurdert påvirkning av Lu og Qu på invadopodia dannelse og funksjon. I tidligere studier har vi dokumentert at både Lu og Qu er i stand til å dempe tyrosinkinase-aktivitet og i stor grad undertrykke sekresjon av MMP i tumorceller [26]. Vurdering av relevans og betydning av hemming av kinase aktivitet og av MMP sekresjon av disse flavonoider har bedt oss om å evaluere deres innvirkning på hendelsene rundt invadopodia formasjon og fungerende.
Materialer og metoder
Material
A431 human epidermal kreftcellelinjen ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). De sterkt invasive A431-III celler ble isolert i vårt laboratorium fra foreldre A431-tumorceller (A431-P) [32]. Føtalt bovint serum (FBS) og RPMI-1640 ble oppnådd fra GIBCO (Grand Island, NY). MMP-9 siRNA ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California). PCR-primere ble kjøpt fra Purigo Biotech (Taipei, Taiwan). Quercetin ble kjøpt fra Nacalai Tesque (Kyoto, Japan). Luteolin ble hentet fra Extrasynthese (Genay, Frankrike). Anti-cortactin antistoff ble oppnådd fra Epitomic (Burlingame, CA). Anti-fosfor-cortactin (Y421) antistoff ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Anti-Src-antistoff ble kjøpt fra Upstate Bioteknologi (Lake Placid, New York). Anti-fosfor-Src (Y418) antistoff ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, MA). Anti-Tks5 antistoff og GM6001 ble oppnådd fra Millipore (Billarica, MA). Anti-MT1-MMP, TIMP1, TIMP2 antistoffer ble kjøpt fra Genetex (Irvine, California).
Utarbeidelse av Cell Lysates
Celler ble dyrket til 80% konfluens og deretter vasket med PBS. Cellene ble lysert med gull lyseringsbuffer som tidligere beskrevet [26]. Uoppløselig materiale ble oppsamlet ved sentrifugering ved 14000 x
g
i 20 minutter ved 4 ° C. Proteinkonsentrasjonen kvantifisert ved anvendelse av Bio-Rad proteinanalyse (Hercules, CA). Prøvene ble deretter oppdelt i 50 pl aliquoter og lagret ved -80 ° C for videre studier.
Transfeksjon av Lie interferens RNA
A431-III-celler (2,5 x 10
5) ble sådd ut i 60 mm kulturskåler og lov til å følge over natten. 6 ul Lipofektamin 2000 (Invitrogen) ble tilsatt til 300 ul serumfritt medium, omhyggelig blandet og inkubert i 5 minutter ved romtemperatur. Parallelt ble 12 ul siRNA lager (10 uM) tilsatt for å separere 300 ul serumfritt medium, blandet grundig. Den fortynnede siRNA og Lipofectamine 2000 ble deretter slått sammen og inkubert i 20 minutter ved romtemperatur. Til slutt ble siRNA /Lipofectamine kompleks tilsettes til 60 mm skål inneholdende 2,4 ml serumfritt medium som gir en sluttkonsentrasjon på 40 nM. Etter 24 timer ble medium inneholdende transfeksjon komplekset ble endret, og friskt medium inneholdende 10% FBS ble tilsatt; cellene ble deretter inkubert i ytterligere 24 timer. Alle analyser ble utført 48 timer etter transfeksjon.
Kvantitativ Real Time PCR
Total RNA ble isolert ved hjelp av høy Pure RNA Isolation Kit (Roche, Basel, Sveits), og revers transkribert ved hjelp av MMLV High Performance revers transkriptase kit (Epicentre, Madison, WI). Kvantifisering av transkripsjonsnivåer av målgener ble utført i LightCycler system (Roche) med en kommersiell SYBR Premiks Ex Taq (Takara Bio, Shiga, Japan) og spesifikke primersett.
Gene Expression microarray analyse
prosedyren av genekspresjon microarray analyse ble gitt av produsenten Welgene Biotech (Taipei, Taiwan). I korte trekk, både A431-P og A431-III-celler (1 x 10
6) ble sådd ut på 100 mm skåler og fikk vokse i fullstendig medium. Etter 24 timer ble den total RNA fra begge celler hentet av 3 ml Trizol reagens. Genuttrykket microarray analyse av A431-P og A431-III celler ble utført av Welgene Biotech. Dataene som er omtalt i denne publikasjonen er deponert i NCBI Gene Expression Omnibus og er tilgjengelig gjennom GEO-serien sjonsnummer GSE47996 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE47996) .
gelatin Zymografi
Det kondisjonerte mediet ble samlet og atskilt med 8% SDS-PAGE inneholder 0,1% gelatin. Etter elektroforese ble gelen vasket i 2,5% Triton X-100 i 20 min, to ganger, for å renaturere de gelatinaser og deretter inkubert i reaksjonsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, inneholdende 5 mM CaCl
2, 0,02 % NaN
3) ved 37 ° C i 24 til 48 timer. Gelen ble så farget med Coomassie-blått og avfarget med avfarging buffer som tidligere beskrevet [33]. Den gelatinase aktivitet var synlig som klare soner innenfor gelen.
Western blotting
cellelysatet prøvene ble blandet med 5 x prøvebuffer og kokt i 5 minutter ble separert på 10% SDS-polyakrylamid- gels (side), og deretter overført til nitrocellulose membran (Millipore). Membranblottene ble blokkert i PBS inneholdende 5% BSA i 1 time ved romtemperatur, og inkubert med primært antistoff over natten ved 4 ° C. Etter vasking med TBST som inneholdt 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 0,8% (vekt /volum) NaCl og 0,25% Tween-20, ble blottene inkubert med sekundært antistoff konjugert med pepperrot peroksidase (Millipore). Membranene ble deretter vasket med TBST, og immunologisk bånd ble påvist med ECL-reagenser og eksponert på Fujifilm.
In Vitro Assay Invasion
filter av en 24-brønners Transwell enhet ble belagt med 0.1 ml 0,6 mg /ml EHS Matrigel. Det nedre kammer inneholdt RPMI-1640 med 10% FCS som et kjemotiltrekkende. Cellene ble plassert i det øvre kammeret (10
5 celler /0,5 ml RPMI-1640 inneholdende 0,1% BSA) i 24 timer. Etter inkubasjon ble filtrene fiksert med 3% glutaraldehyd i PBS og farget med krystallfiolett. Celler på den øvre overflaten av filteret ble forsiktig skrapet av, og de som penetrert gjennom Matrigel til den nedre overflate av filteret ble tellet under et mikroskop (20 x).
Immunofluorescence
cellene ble platet på seks-brønns plate som inneholder 18 mm gelatin-belagt dekkglass for 18-24 timer for å overholde. Mediet ble deretter fjernet, og cellene ble fiksert med 4% paraformaldehyd i 15 minutter, vasket med PBS og permeabilisert med 0,1% Triton X-100 i 10 min. Etter vasking med PBS, ble objektglassene blokkert med 1% BSA i PBS i 30 min. Cellene ble deretter inkubert med anti-cortactin eller anti-Tks5 antistoffer, som ble fortynnet i 1% BSA blokkeringsbuffer i 1 time. Dette ble etterfulgt av inkubasjon med det passende sekundære antistoff konjugert med Alexa fluro 555 (Invitrogen) i 1,5 timer. De samme cellene ble også farget med Alexa 488 fluor-konjugert phalloidin og DAPI å detektere F-aktin og cellekjerner, respektivt. Objektglassene ble så montert i 50% glycerol i PBS og analysert ved confocol bilde mikroskopi.
matriksdegradering Assay
matriksdegradering Analysen ble utført i henhold til en tidligere beskrevet prosedyre [34], og hele prosedyren for matriksdegradering assayet ble utført i mørket. I korte trekk ble 18 mm dekk først belagt med 0,2 mg /ml Oregon Green® 488-konjugert gelatin (Molecular Probe). Objektglassene hadde 200 ul av 0,5% iskald glutaraldehyd i PBS lagt inn på dem, og blandingene ble deretter inkubert i 15 minutter ved 4 ° C. Etter vasking med PBS, ble objektglassene inkubert med frisk 5 mg /ml NaBH
4 i PBS i 3 min ved romtemperatur. Deretter ble objektglassene vasket med PBS og sterilisert i 70% etanol. Etter stopping med serumfritt medium i 1 time, 1 x 10
5-celler ble sådd på dekkglass i 5 timer, og snittene ble behandlet for immunofluorescensanalyse ved hjelp phalloidin å detektere F-aktin og DAPI for å detektere cellekjerner. Bildene ble visualisert ved konfokal mikroskopi. For å kvantifisere invadopodia dannelse og funksjon, ble invadopodia manuelt kvantifisert ved å telle det totale antall celler som produserer invadopodia i minst fem individuelle feltene ( 300 celler). Arealet av matrisen rundt cellene som var blitt degradert ble også målt ved anvendelse av et identisk signal terskel for Oregon Green® 488-gelatin fluorescens for hvert bilde. Den nedbrutte arealet målt var det området hvor fluorescens-signalet var under terskelen som målt ved ImageJ. Den kvantifiserte området var så normalisert mot antall celler.
Konfokalmikroskopi
Fluorescent bildene ble tatt med en Zeiss LSM510 konfokal mikroskop med en 63 × olje nedsenking linse, en NA 1,25 objektiv og pin hull på 0,1 luftig enhet. Bildeanalyse ble utført ved anvendelse ImageJ programvare.
Statistical Analysis
Kvantitative data fra minst tre uavhengige eksperimenter er uttrykt som middel (± SEM). Uparede Students t-tester ble benyttet for å sammenligne forskjellene mellom gruppene. En
p
av. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
A431-III cellene danner mer Invadopodia og degradere ECM Effektivt
Vi har tidligere vist at A431-III celler utvise større invasive og trekkende kapasiteter sammen med forhøyede nivåer av MMP-9 [32]. Dette gir en pålitelig modell for å studere mekanismen for metastase /invasjon ved å sammenligne A431-III-celler med foreldreceller (A431-P). For å avgjøre om A431-P og A431-III celler er i stand til å danne invadopodia, vi urfremført immunfluorescens å oppdage og sammenligne dannelsen av invadopodia av A431-P og A431-III celler. A431-P og A431-III celler ble utsådd på gelatinbelagt 6-brønns plater i 4 timer. Invadopodia kunne observeres som cortactin og aktin-positive punkter ligger på ventral side av celler. Som vist i figur 1A, ble invadopodia lett finnes i A431-III celler. Det var få eller ingen påviselig invadopodia synlig i A431-P-celler. Deretter ble matriksdegradering-målingen ble utført for å evaluere ECM degradering kapasitet av invadopodia i A431-P og III celler. A431-III celler ble funnet å ha høyere gelatin-nedbrytningsevne sammenlignet med A431-P-celler (Fig. 1A). Disse dataene tyder på at jo større gelatin-nedbrytningsevne funnet å være assosiert med A431-III celler parallell til deres større evne til å danne invadopodia
A, Øvre panel:. A431-P og A431-III celler ble farget med cortactin ( rød), F-aktin (grønn), og DAPI (blå). Pilspisser, eksempler på invadopodia som er identifisert som cortactin og aktin-positive punkter. Representative bilder tatt av både celler. Nedre panel: Begge cellene ble sådd ut på Oregon Green® 488-konjugert gelatin. Degradert ECM ble identifisert som et mørkt område på gelatin. B, Øvre panel: Kvantifisering av celler assosiert med matrise degradering. Nedre panel: Kvantifisering av degradering området normalisert mot cellenummer. C, Invasion analyser ble utført. *
p
0,05. Feilstolper presentere standard feil av gjennomsnittet. Scale bar er 22 mikrometer. P (A431-P); III (A431-III).
For å kvantifisere dannelse av invadopodia og deres evne til å degradere ECM, vi beregnet andelen celler med invadopodia puncta som var knyttet til forringet gelatin patcher. Som vist i figur 1B, ble over 35% av A431-III-celler funnet til å danne invadopodia og å degradere gelatin. Dette skiller seg med resultatene for A431-P, der kun 5% av A431-P-celler ble funnet å danne invadopodia. Vi kvantifisert også området for de degraderte plaster og normalisert denne mot celletall. A431-III celler oppviste en 10 ganger høyere evne til å nedbryte gelatinen enn gjorde A431-P-celler. Dette større evne til invadopodia dannelse og nedverdigende funksjon korresponderte med invaderende evnen til disse cellene (Fig. 1C). Oppsummert disse funnene antyder at, sammenlignet med A431-P-celler, sterkt invasive A431-III-celler oppviser en meget større evne til å danne invadopodia og at dette fører til mer nedbrytning av ECM og økt invasive egenskaper.
Cortactin Fosforylering Fremmer invadopodia dannelse og Matrix Nedbrytning
Nylig, flere rapporter har godkjent at overekspresjon av invadopodia regulatorer eller invadopodia komponent proteiner er i stand til å forbedre invadopodia formasjon. For ytterligere å bekrefte om disse regulatorer er oppregulert i A431-III celler, utførte vi mikromatriser og qPCR analyser for å belyse denne hendelsen. Til vår overraskelse var det ingen signifikant økning av noen kjent invadopodia regulator eller komponent protein (Fig 2A . 2B). Disse dataene tyder på at forskjellen mellom A431-P og A431-III, i form av invadopodia, vil trolig være på signaltransduksjon nivå snarere enn på protein uttrykk nivå.
a, uttrykk for invadopodia regulatorer, kjernekomponenter og MMP /TIMPs i A431-P og A431-III ble analysert ved microarray. B, Expression of invadopodia regulatorer, komponenter og MMP /TIMPs ble validert av qPCR. C, totalt cellelysater ble utsatt for immunblotanalyse. Den aktive statusen Src kinase og fosforylering av cortactin ble bestemt.
Src kinase spiller en fundamental rolle i reguleringen av invadopodia formasjon [12], [13]. Flere komponentproteiner er kjent for å gjennomgå tyrosinfosforylering i løpet av invadopodia genese, inkludert cortactin [9], [35]. Fosforylering av cortactin av Src-kinase er en nøkkelbryter som gjør det mulig ombygging av aktin filamenter og aktivering av invadopodia dannelse og fungerer [17], [22]. For å teste hvilken rolle Src i invadopodia dannelse og funksjon, undersøkte vi Src kinase aktivitet ved anti-fosforylert Src-antistoff i A431-P og III celler. Som vist i figur 2C, har vi funnet at Src-kinase var signifikant aktivert i A431-III-celler, og etterfulgt av en økning i fosforylering av nedstrøms målet, cortactin. Disse funnene tyder på at Src kinase aktivitet, snarere enn transkripsjons induksjon av Src eller noen annen invadopodia regulator /komponent, vil trolig være ansvarlig for økt invadopodia dannelse av A431-III celler, i samsvar med vår slutning om microarray data.
for å bekrefte rollen Src kinase og cortactin fosforylering i invadopodia formasjonen i A431-III celler videre, vi deretter behandlet celler med SU6656, en selektiv Src kinase inhibitor. Resultatet viste at invadopodia dannelsen ble dramatisk undertrykkes ved behandling med SU6656 (fig. 3A), som var den invaderende egenskaper som detekteres av invasjons-analyser (fig. 3D). Kvantifisering av prosentandelen av invadopodia-positive celler og relative nedbrytningsområde er vist i figur 3B. Disse resultatene viser at en reduksjon i fosforylering av Src et resultat av inhibering av Src-kinase-aktivitet ved SU6656, mens også ledsaget av en lavere grad av fosforylering cortactin (Fig. 3C). Disse dataene tyder på at Src-kinase-aktivitet er nødvendig for invadopodia formasjonen og invasive potensial.
A, A431-III celler ble sådd ut på gelatin eller Oregon Green® 488-konjugert gelatin og behandles med DMSO eller 5 uM for SU6656 5 h for å undersøke dannelsen av invadopodia og matrise degradering. B, Kvantifisering av celler assosiert med matrise nedbrytning (øvre panel). Kvantifisering av degradering området normalisert mot celle nummer (nedre panel). C, totalt cellelysater var forberedt på immunblotanalyse. Aktiv Src og nedstrøms mål cortactin (Y421) ble analysert. D, Invasion analyser ble utført. *
p
0,05. P-verdier blir sammenlignet med kontroll A431-III. Feilstolper presentere standard feil av gjennomsnittet. Scale bar er 22 mikrometer.
MMP aktivitet er nødvendig for Invadopodia Dannelse og Matrix Nedbrytning
For å metastasere, kreftceller stole på invadopodia dannelse og MMP å oppnå fordøyelsen av ECM, som letter celle penetrasjon over ECM barriere. Involvering av MMP i invadopodia aktivitet er viktig hvis proteolyse skulle inntreffe. For å bestemme korrelasjonen av MMP’er og invadopodia dannelse i A431-III, vi først målte evnen til A431-III-celler til å danne invadopodia og nedbryter ECM i nærvær av GM6001, et bredspektret MMP-inhibitor. Vår studie brukt Tks5 som en markør for å oppdage invadopodia dannelse og funksjon. Behandling A431-III celler med 25 mikrometer GM6001 fullstendig avskaffet gelatin degradering (fig. 4A). Ingen påvisbare invadepodia punktlignende strukturer i A431-III celler ble observert etter behandling med GM6001. Denne effekten kan være på grunn av invadopodia manglende evne til å danne en stabil struktur ved MMP-aktivitet er hemmet. Kvantifisering av prosentandelen av invadopodia-positive celler og av de relative nedbrytningsområdene er presentert i figur 4B. Effekten av GM6001 på MMP aktivitet og TIMPs ble målt ved Western blot og zymografi (Fig. 4C). Sammen våre funn viser den kritiske viktigheten av MMP aktivitet i nedverdigende evnen til A431-III celler, og hvordan MMP aktivitet påvirker dannelsen av invadopodia struktur.
A, A431-III celler ble sådd ut på gelatin eller Oregon Green® 488-konjugert gelatin og behandles med DMSO eller 25 uM GM6001 i 5 timer for å observere dannelsen av invadopodia og matrisen nedbrytende evne. Tks5, invadopodia komponent protein, ble anvendt som en markør. B, Kvantifisering av celler assosiert med matrise nedbrytning (venstre panel). Kvantifisering av degradering området normalisert mot cellenummer (høyre panel). C, Effekt av GM6001 på MMP aktiviteter og TIMPs «uttrykk ble målt ved zymografi og western blot. D, Cellene ble behandlet med 40 nM MMP-9 siRNA eller kontrollere siRNA. Knockdown Effektiviteten ble målt ved qPCR (venstre) eller gelatin zymografi (til høyre). E, A431-III-celler (som uttrykker kontroll eller MMP-9 knockdown siRNA) ble sådd ut på gelatin eller Oregon Green® 488-konjugert gelatin for å undersøke dannelsen av invadopodia og matrisen nedbrytende evne. . F, Kvantifisering av celler assosiert med matrise nedbrytning (venstre panel) og degradering område normalisert mot (høyre panel) celle nummer *
p
0,05. Feilstolper presentere standard feil av gjennomsnittet. Scale bar er 22 mikrometer.
Tre MMP, MT1-MMP (MMP14), MMP-2 og MMP-9, har blitt rapportert å være assosiert med invadopodia fungerer i ulike cellelinjer [13], [36], [37]. Vi har vist at MMP-9 aktivitet er nøkkelen MMP som markert øker i A431-III-celler (figur 2A 0,05. P-verdier blir sammenlignet med kontroll A431-III. Feilstolper presentere standard feil av gjennomsnittet. Scale bar er 22 mikrometer.
For ytterligere å undersøke effekten av Lu og Qu behandling på invadopodia dannelsesprosessen, vurderte vi muligheten for A431-III celler til å danne invadopodia og degradere gelatin i nærvær av Lu eller Qu.
