Abstract
Meprin-α er en metalloprotease overexpressed i kreftceller, som fører til opphopning av denne protease i en undergruppe av kolorektal tumorer. Virkningen av økt meprin-a nivåer på tumorprogresjon er ikke kjent. Vi undersøkte effekten av denne protease på cellemigrering og angiogenese
in vitro
og studert ekspresjon av meprin-α mRNA, proteiner og proteolytisk aktivitet på primære tumorer ved progressive trinn og i levermetastaser av pasienter med kolorektal kreft, så vel som inhiberende aktivitet overfor meprin-α i sera fra cancerpasient sammenlignet med friske kontroller. Vi fant at den hepatocytt vekstfaktor (HGF) – induserte migrasjonsresponsen til meprin-transfekterte epitelceller ble økt sammenlignet med villtype-celler i nærvær av plasminogen, og at den angiogene responsen i organ-dyrkede rotte-aorta-eksplantater ble forbedret i tilstedeværelsen av eksogene menneskelig meprin-α. Hos pasienter, ble meprin-α mRNA uttrykt i colonic adenomer, primære tumorer UICC (International Union mot kreft) trinn I, II, III og IV, så vel som i levermetastaser. I motsetning til det tilsvarende protein akkumulerte bare i primære tumorer og levermetastaser, men ikke i adenomer. Imidlertid levermetastaser manglet meprin-α aktivitet til tross for øket ekspresjon av det tilsvarende protein, noe som korrelerte med ineffektiv zymogen aktivering. Sera fra kreftpasienter utstilt redusert meprin-α-hemming sammenlignet med friske kontroller. I konklusjonen, er meprin-α aktivitet regulert forskjellig i primærsvulster og metastaser, som fører til høy proteolytisk aktivitet i primærsvulster og lav aktivitet i levermetastaser. I kraft av sin pro-trekkfugl og pro-angiogene aktivitet, kan meprin-α fremme tumorprogresjon hos kolorektalkreft
Citation. Lottaz D, Maurer CA, Noël A, Blacher S, Huguenin M, NIEVERGELT A, et al. (2011) Forbedret aktivitet av Meprin-α, en Pro-trekkende og Pro-angiogen Protease, i tykktarmskreft. PLoS ONE 6 (11): e26450. doi: 10,1371 /journal.pone.0026450
Redaktør: Hang Thi Thu Nguyen, Emory University, USA
mottatt: 06.09.2010; Godkjent: 27 september 2011; Publisert: 11.11.2011
Copyright: © 2011 Lottaz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av den sveitsiske National Foundation (www.snf.ch, gi # 3100A0-100772 til EES), Berner Cancer League (www.bernischekrebsliga.ch, gi til DL) og Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de, DFG BE 4086 /1-1 til CB). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
samordnet ekstracellulære proteolytiske hendelser kan fremme tumorprogresjon ved å forstyrre fysiske barrierer så som basalmembranen, og ved å behandle ekstracellulære matriks, vekstfaktorer og cytokiner i tumoren stroma. Proteaser påvirke celle adhesjon og cellevekst samt individuell og kollektiv celle migrasjon [1], [2]. Den dyptgripende virkninger av proteaser styres ved regulering av protease aktivitet på flere nivåer, inkludert ekspresjonsnivåer, aktivering av zymogen former, inhibitor nivåer, og inaktivering.
Vi tidligere identifiserte meprin-α, en metzincin protease av astacin familie [3], som en ny komponent av protease-nettverket i kolorektal cancer [4]. Det er to homologe isoformer av meprin: meprin-α, kodet av
MEP1A
på kromosom 6, og meprin-β, kodet av
MEP1B
på kromosom 18 [5]. Meprin-α og meprin-β er co-uttrykt i tynntarmen, mens bare meprin-α er uttrykt i tykktarmen [6]. Meprin-β akkumulerer ved den apikale celleoverflaten på enterocyttene i tynntarmen, mens meprin-α utskilles med mindre det bibeholdes på celleoverflaten gjennom ikke-kovalent assosiasjon med meprin-β [6]. Den enkle polypeptidkjeder som er ikke stabile, begge isoformer danne proteinkomplekser av meprin-β dimerer, meprin-a og meprin-p tetramerer, eller multimere komplekser på opp til ti meprin-α subenheter [7], [8]. Meprin-α uttrykkes i epitel-celler i sunn kolon mukosa, så vel som i kolorektal cancer [6]. Men i motsetning til normale intestinale epitelceller, som slipper den protease inn i tarmkanalen, kreftceller utskiller proteasen i et ikke-polarisert måte, som fører til opphopning og aktivering i tumoren stroma [4]. Meprin-a kløyver en rekke forskjellige underlag
in vitro product: [9], inkludert ekstracellulære matrikskomponenter av basalmembraner [9], [10] men noen substrater er beskrevet
in vivo product: [ ,,,0],11], [12], [13], [14], [15]. Tre endogene meprin hemmere er beskrevet, mannan-bindende lektin (MBL) [16], fetuin-A og cystatin C [17].
Meprin-α utskilles fra epitelceller som zymogen [18].
In vitro
, kan propeptidet fjernes ved hjelp av trypsin, noe som ga det aktive enzymet. Trypsin dermed kan aktivere meprin-α i tarmen lumen
in vivo
. En alternativ aktiveringssystem er blitt identifisert i ko-kulturer av colon carcinoma-cellelinjen Caco-2-tarm og fibroblaster. Fibroblast-avledet urokinase-type plasminogen aktivator (uPA) omdanner plasminogen til plasmin, som i sin tur genererer aktiv meprin-α [19]. I huden kallikrein relaterte peptidase 5 kunne identifiseres som en promeprin-α converting enzyme [20].
Her er vi gi bevis for en pro-angiogen og pro-vandrende aktivitet meprin-α og undersøke uttrykket aktivering og hemming av denne protease i primære svulster, levermetastaser og blodet i pasienter med kolorektal kreft. Våre funn viser et komplekst mønster av regulering, som er i samsvar med protease blir innblandet i spredningen av kreftceller fra primære områder.
Resultater
Meprin-α fremmer cellemigrasjon og angiogenese
in vitro
virkningen av meprin-α på cellemigrering ble undersøkt ved anvendelse av den godt karakterisert spredning reaksjon av Madin-Darby hundenyreceller (MDCK) celler i respons til hepatocytt vekstfaktor (HGF ) [21]. Responsen av meprin-transfekterte celler og paren MDCK-celler ble tatt opp med time-lapse videomicroscopy og kvantifisert som beskrevet tidligere (Fig. 1A) [22]. Vi sammenlignet migrering av paren MDCK celler med MDCK-celler transfektert med enten meprin-α alene, meprin-β alene, eller ko-transfektert med både meprin-α og meprin-β. Ubehandlede foreldre og meprin-transfekterte MDCK cellene ikke migrere og vokse som celle klynge som til slutt danner en celle monolayer. En pro-trekkfugl respons ble indusert ved å legge HGF. Meprin-transfekterte og kontroll MDCK-celler migrert på samme måte i nærvær av HGF alene. Bare etter tilsetning av plasminogen som en kilde for å generere plasmin, som i sin tur aktiverer meprin-α [19], migrering hastigheten på meprin-a /p-ko-transfekterte celler ble øket med omtrent 50% sammenlignet med villtype-celler. Denne forskjellen ble opphevet ved tilsetning av meprin inhibitor actinonin. Spesielt, er deling av meprin-α til celleoverflaten gjennom meprin-β vesentlig å forbedre denne pro-vandrende reaksjon i nærvær av HGF og plasminogen, som MDCK-celler transfektert med enten meprin-α eller meprin-β alene overføres på samme måte til foreldre celler.
(A) Foreldre MDCK villtype celler (vekt, åpne søyler) og MDCK celler ko-transfektert med meprin-α og meprin-β (αβ, venstre panel, fylt sorte søyler) eller transfektert med enten meprin-α (α) eller meprin-β (β) alene (høyre panel, fylt grå søyler) ble dyrket på laminin 1-belagte retter og utsatt for HGF (20 nM) for å indusere migrering i fravær eller nærvær av plasminogen så indikert. HGF-indusert migrering ble sporet i 3-4 timer ved hjelp videomicroscopy. Vist er den gjennomsnittlige overføringshastighet, (+/- SEM) av meprin-transfekterte celler i forhold til identisk behandlede villtype-celler. Resultatene er gjennomsnitt fra tre til fire uavhengige eksperimenter for hver tilstand. I nærvær av plasminogen (100 nM), HGF-indusert migrering av meprin-a /p-ko-transfekterte celler, ble betydelig forbedret. Denne effekten ble tilbakestilt i nærvær av det meprin inhibitor actinonin (100 nM). Migrering av celler transfektert med enten meprin subenhet alene var ikke forskjellig fra villtype-celler. (B) Meprin-α fremmer angiogenese. Renset, rekombinant human aktiv meprin-α ble tilsatt til kulturmediet (0,7 ug /ml) i rotte aorta-ring-analysen og utvekst av skip inn i kollagen gelen ble kvantifisert ved bruk av bildeanalyse (se materialer og metoder). N
v: antall fartøy, N
b: antall forgreninger, L
max: maksimal lengde på fartøy. * P 0,05 sammenlignet med ubehandlet organkultur. Resultatene er fra tre uavhengige forsøk med tre paralleller for hver tilstand.
Renset, rekombinant aktive humane meprin-α fremmet angiogene responsen i rotte aorta ring analyse [23] (Fig. 1B). Computer-assistert bildeanalyse av rotte aorta explants i 3-dimensjonal kollagen gel kultur indikerte at meprin-α forbedret utvekst av kapillærer i forhold til å kontrollere kulturer i form av både lengden (økning med 44%, p 0,05) og antall forgreninger (3-dobling, p 0,05)
meprin-α uttrykk i kolorektal kreft på progressive kreft stadier
Variable nivåer av en enkelt 3,5-kb meprin-α mRNA ble oppdaget i. pasientprøver på alle stadier, inkludert adenomer, som ikke korrelerte signifikant med tumorstadier (fig. 2A, B). Alternativ spleising av meprin-β i kreft har tidligere blitt rapportert [24]. Ingen bevis for en alternativt spleiset mRNA isoform av meprin-α ble funnet i tumorer. På immunoblotter meprin-α protein var bare svakt påvises eller fraværende i adenomer, mens en undergruppe av kreftprøver, inkludert primærtumorstadier I til IV og levermetastaser, inneholdt store mengder meprin-α protein (Fig. 2C). Rensede børstegrense membraner fra human tynntarm, som inneholder både meprin-α og meprin-β, ble analysert som en positiv kontroll. Som beskrevet tidligere [4], den molekylære arter av meprin-α i tumorene var 10 til 25 kDa som er mindre enn den fremherskende 100-kDa-protein fra børstegrense membraner. Farging for meprin-α i primære tumorer og levermetastaser avslørte klynger av kreftceller med sterke signaler i tilknytning til negative kreftceller (Fig. 3). All adenomer men en scoret minimumsverdien 1 (fig 4A.), Mens primærsvulster og levermetastaser scoret høyere (p 0,025 for primære svulster stadiene I til IV sammenlignet med levermetastaser og adenomer).
(A ) representant Northern blot for meprin-α på total RNA (12 mikrogram) hentet fra tumorprøver av pasienter med ulike kreft stadier (A adenom, primære svulster iscenesetter UICC jeg til UICC IV, M levermetastaser). Normal kontroll RNA fra sunn kolon mukosa er også vist (felt C). Varierende grad av en enkelt 3,5 kb mRNA arter ble påvist. Mengden av lastede RNA ble bestemt ved reprobing blottet for 7S RNA. (B) Kvantifisering av meprin-α mRNA nivåer i forhold til 7S RNA. Boksplott representasjon av densitometriske verdier hentet fra Northern blot. Box inneholder lavere kvartil, median og øvre kvartil, kinnskjegg tyder 5-95 persentil utvalg (N = 12 i hver gruppe). Ingen signifikante forskjeller mellom ulike grupper. (C) Representant Western blot for meprin-α på proteinekstrakter fra tumorprøver (40 mikrogram). Som en kontroll, ble rensede humane børstegrense membraner fra tynntarmen (20 ug) også analysert (BBM), hvor meprin-α er forbundet med transmembran meprin-β i heterodimere proteinkomplekser. Meprin-α ble påvist i et delsett av tumorer. For å avdekke svake signaler, ble membranen overeksponert i forhold til tumorprøver som viste sterkt uttrykk.
farging for meprin-α på vevssnitt fra formalinfiksert og prøver kolorektal vev parafininnstøpte hjelp et kanin polyklonalt primært antistoff sammen med et peroksidase-koblet sekundært antistoff og diaminobenzidin som kromogent substrat. Counter flekken: hematoxylin. Mål forstørrelse: 40 ×. Bar = 50 mikrometer. (A) I normal tykktarm slimhinne meprin-α er knapt synlig. Av og til, signaler ble detektert på basis av krypten regioner i cytosol av celler med apikalt lokaliserte atomkjerner (skjult). Spesifisiteten til disse signalene og identiteten av cellene ble ikke ytterligere undersøkt. (B) representativt utvalg av en meprin-α positiv primær tumor stadium III. Svulster viser en mosaikk uttrykk mønster. I kreftcellegrupper, blir cellene med sterke signaler for meprin-α (piler) blandet med celler som viser svake signaler eller ikke noe signal i det hele tatt. Celler i stroma uttrykker ikke meprin-α (C) representativt utvalg av meprin-α positiv primær tumor stadium IV viser klynger av meprin-a positive kreftceller (piler). (D) Kreftceller uttrykker meprin-α (piler) i levermetastaser (Met). De omkringliggende normale levervev (Hep) er bare svakt farget.
(A) Semi-kvantitativ vurdering av meprin-α uttrykk i kolorektal karsinom ved hjelp av en immunhistokjemisk score (minimum score ett, maksimum poengsum 16) . + = Medianverdier. (B) Økt proteolytisk aktivitet av meprin-α i grunnskolen svulster etapper I til IV i forhold til adenomer og metastaser. Proteolytisk aktivitet av meprin-α ble målt ved bruk av kunstig substratet N-benzoyl-L-tyrosyl-p-amino-benzosyre (PABA-peptid). Terskelverdien på 2,5 pmol /t /g protein tilsvarer to standardavvik over gjennomsnittsverdien i adenom gruppe. En økning av proteolytiske aktivitet over terskelen ble funnet i 36%, 40%, 44% og 33% av de primære tumorprøver ved trinn UICC I, II, III og IV, henholdsvis, men ikke i levermetastaser. Statistisk analyse ble utført mellom primære svulster etapper jeg til UICC IV som en gruppe og adenomer, eller metastaser (ensidig Wilcoxon rank sum test av uavhengige utvalg). + = Medianverdier.
Meprin-α aktivitet, zymogen aktivering og hemming
Meprin-α aktivitet ble spesielt målt i proteinekstrakter fra vevsprøver i nærvær av et bredt spekter proteasehemmer mot alle protease klasser unntatt metallproteasene. Meprin-α aktiviteten var lav i adenomer, mens betydelig forbedret aktivitet ble målt i en delmengde (33 til 44%) av primære svulster i trinn I til IV (figur 4B, p. 0,01 for trinn I til IV i forhold til adenomer). I levermetastaser, uventet, meprin-a aktivitet var så lave som de som er i adenomer, til tross for signifikant ekspresjon av proteinet (p 0,01 i forhold til primære tumorer trinn I til IV)
Den tilsynelatende uoverensstemmelse mellom lav. aktivitet og høy meprin-α proteinnivåer i levermetastaser (fig. 2C og 3) kan være på grunn av mangel på meprin-α zymogen aktivering, eller en hemmer spesifikt tilstede i levermetastaser. For å fastslå omfanget av zymogen aktivering i tumorprøver vi først immunopresipitert zymogen og aktive former for meprin-α og målte aktiviteten direkte på perlene. Denne verdi, som representerte endogent aktivert protease basseng, ble sammenlignet med aktiviteten i immunopresipitatene etter maksimal zymogen aktivering med begrenset trypsinbehandling [18]. Den zymogen form av meprin-α dominerte i alle prøvene. Imidlertid endogen aktivering av meprin-α var signifikant høyere i primærsvulster enn levermetastaser (fig. 5A). I primærsvulster I-IV, så mye som 20% av total meprin-α ble aktivert endogent, og alle bortsett fra én prøve vises endogen aktivering over 5%. Omvendt, endogen aktivering var under 5% i alle unntatt to prøver fra levermetastaser. I konklusjonen, kan økt zymogen aktivering bidra til økt meprin-α aktivitet ved primærtumor områder i forhold til metastaser i leveren.
Meprin-α ble immunopresipitert fra tumorprøver, delt inn i to porsjoner for å utlede endogene og total aktivitet, som beskrevet i Materialer og Metoder. (A) Forholdet mellom endogen meprin-α aktivitet sammenlignet med total aktivitet på primære tumorer (P, N = 7) og levermetastaser (M, N = 10). Zymogen aktivisering er betydelig forbedret i primære svulster i forhold til levermetastaser. (B) Serumprøver fra pasienter med kolorektal kreft utviser lavere hemmende aktiviteter mot meprin-α. Proteolytisk aktivitet av renset rekombinant human-meprin α (800 ng /ml) ble undersøkt i nærvær av 20% humant serum. Aktivitetene er vist i forhold til referanse analysen med 20% i fosfatbuffret saltoppløsning pH 7,3 (= 1). N: Normale friske kontroller (N = 19), NC: Ikke-kreftpasienter gruppen, som omfatter prøver fra 22 inviduals med inflammatoriske sykdommer i tarmen, CRCI-III: pasienter med kolorektal kreft (N = 15) turer I-III. CRCIV: pasienter med kolorektal kreft (N = 9) stadium IV. Betydelig redusert hemming av meprin-α i serum fra pasienter med kolorektal kreft.
Redusert hemming av meprin-α i sera fra pasienter med kolorektal kreft
Sirkulasjonskreftceller kan støte faktorer i blodet som modulerer meprin-α aktivitet. Faktisk, en aktivitetsanalyse av rekombinant meprin-α i nærvær av 20% humane sera fra friske kontroller og en gruppe av pasienter med tarmbetennelsessykdommer antydet inhibering med 35% (område 5-50%) og 22% (område 0-59 %), henholdsvis. I kontrast, sera fra pasienter med kolorektal kreft (trinn I-IV) inhiberte meprin-α ved en betydelig mindre grad (12% i gjennomsnitt, 0-37%, p = 2.8 * 10
-6 sammenlignet med friske kontroller, p = 0,013 sammenlignet med pasienter med inflammatoriske lidelser) (fig. 5B). Sera fra pasienter med trinn I-III viste en redusert inhibitorisk kapasitet sammenlignet med normale pasienter som ikke var signifikant forskjellig fra pasienter på stadium IV. Hemming i serum var uavhengig av MBL, som MBL serumkonsentrasjon ikke signifikant forskjellig mellom studiegruppene, og heller ikke korrelerer med meprin-α-hemming (ikke vist). I tillegg gjorde rekombinant MBL ikke hemme menneske, mus og rotte meprin i N-benzoyl-L-tyrosyl-p-amino benzosyre (paba-peptid) analysen (tabell S1).
I sammendraget er det er en dynamisk og kompleks regulering mønster for aktiviteten til meprin-α i tykk- og endetarmskreft. Økt zymogen aktivering kan bidra til høyere proteolytisk aktivitet i primærsvulster etapper I-IV, og den hemmende aktivitet mot meprin-α reduseres i blodet i pasienter med kolorektal kreft.
Diskusjoner
Denne studien innebærer at meprin-α er aktiv i overgangen fra godartet vekst (adenomer) til maligne primære svulster. Paba-peptid aktivitet i kreftvev er spesifikk for meprin i vår analyse, som vi tok for å undertrykke noen uspesifikk aktivitet ved å supplere analysen med et bredt spekter proteasehemmer cocktail. Spesielt, kymotrypsinlignende proteaser, som er de eneste kjente enzymer i stand til å spalte paba-peptid bortsett fra meprin [25], er hemmet under disse forholdene. Meprin-α protein og aktiviteten økte i den sistnevnte gruppen, selv om det ikke var noen signifikant forskjell fra tilsvarende mRNA-nivåer mellom forskjellige grupper. Adenomer per definisjon er preget av en økt vekst av celler med normal differensiering og celle polarisering [26]. Derfor er beslektet med den normale tykktarmsslimhinne, meprin-α kan bli utskilt og senere tapt inn i tarmkanalen, mens protease kan beholdes i svulstvev i tykktarmskreft på grunn av avvikende ikke-polarisert sekresjon, en mekanisme beskrevet av oss tidligere [ ,,,0],4]. I tillegg er det bevis for en posttranskripsjonelt regulering av meprin-α fra en tidligere studie, som meprin-α mRNA ble påvises ved
in situ hybridisering
i begge krypten og Haug av regioner, mens proteinet som påvist ved immunfarging var bare til stede i Haug av enterocyttene [6].
i kolorektal kreft, inneholdt primærsvulster øket meprin-α aktivitet og ofte næret en subpopulasjon av kreftceller med sterk meprin-α proteinekspresjon, særlig ved UICC trinn III og IV, dvs. etter progresjon til metastasering til lymfeknuter og fjerne områder (fig. 2 og 3). Spredning av kreft celler korrelerer dermed med økt meprin-α protein og aktivitet. Men ser vi at korrelasjonen mellom Immunoblotanalyse signaler, farging score og meprin-α-aktivitet i gruppene av primære svulster er ikke tett. Den immunofarging stillingen anser hyppigheten og intensiteten av meprin-a signaler som blant kreftceller bare innenfor et lokalt begrenset område av prøven, mens det immunoblot-signalet er et gjennomsnitt av hele prøven inkludert utskilt meprin-α akkumuleres i svulst stroma [4] . Den meprin-α aktivitetsnivå er i tillegg påvirkes av zymogen aktivering og tilstedeværelsen av inhibitorer.
Sera fra pasienter med kolorektal kreft viste signifikant lavere inhiberende aktivitet overfor meprin-α enn friske kontroller og pasienter med tarmbetennelsessykdommer, som indikerer at utvandringen av sirkulerende meprin-α uttrykker kreftceller av blodkar kan gjøres lettere. Den inhiberende aktivitet i serum var ikke på grunn av mannose-bindende lektin, et endogent meprin inhibitor tidligere rapportert [16], og således bidro med ett eller flere ytterligere inhibitor (er). I en nylig rapport, er fetuin-A og cystatin C er rapportert som slike endogene inhibitorer meprin [17]. Faktisk, ved hjelp av rekombinant humant MBL, fant vi ingen hemming av meprin (tabell S1). Dette funnet er i kontrast til den rapport av Hirano et al. [16]. Imidlertid våre data er i samsvar med mangelen på en korrelasjon mellom inhibering av pasientsera og MBL konsentrasjon. For det andre, som Hirano et al. brukte MBL renset fra humant serum for deres inhiberings meprin assays, spekulere vi at avviket mellom vår og deres data er på grunn av forurensende faktorer fra humant serum, slik som fetuin-A og /eller cystatin C.
Det er en dynamisk og komplekst mønster regulering av aktiviteten til meprin-α in colorectal cancer. Økt zymogen aktivering bidrar til høyere proteolytisk aktivitet på primære tumorer trinn I til IV (Fig. 5A), og den hemmende aktiviteten mot meprin-α reduseres i blodet hos pasienter med kolorektal kreft (Fig. 5B). Den ineffektive aktivering i levermetastaser er i overensstemmelse med den tidligere observasjon at den uPA-system, et meprin-α aktivator, er inaktiv i levermetastaser, som følge av mangel på uPA aktivering og over-ekspresjon av plasminogen aktivator inhibitor [27] , [28]. Selv om mange matriks-metallproteaser (MMP) er kjent for å være forhøyet hos invasive primære svulster i kolorektal kreft [29], er det få analyser som inkluderer levermetastaser. I en slik studie, ble MMP-9 vist seg å være økt hos primærsvulster, men ikke levermetastaser [30]. Den studien og våre data peker på signifikante forskjeller mellom protease nettverk i primærsvulster og levermetastaser, som er relevant for terapeutiske tilnærminger som bruker proteasehemmere.
Vi studerte celle migrasjon i MDCK-celler som uttrykker meprin-α på celleoverflaten bundet i heterodimere proteinkomplekser med trans meprin-β [31]. Meprin-uttrykkende celler vandret betydelig raskere på laminin-1 belagt retter i nærvær av plasminogen og HGF. Meprin-α kan bli aktivert på celleoverflaten av plasmin, generert fra plasminogen gjennom aktiviteten av urokinase-type plasminogen aktivator (uPA) bundet til sin reseptor (u-PAR), som begge er kjent for å være oppregulert ved HGF i MDCK-celler [32]. Dette systemet mest sannsynlig også bidrar til aktivering av meprin-α i tumorer
in vivo
, som u-PA og u-PAR blir oppregulert i kolorektal kreft [33], [34], [35] [36]. I vår migrering analysen, er pro-trekkende virkning faktisk på grunn av meprin-α, som plasmin aktiverer meprin-α men ikke meprin-β [7] og fordi actinonin, som reverserer pro-trekkende virkning, gjør hemme meprin-α med omtrent 100 ganger høyere potens (K
i 2 * 10
-8 M) enn meprin-β (K
i 2 * 10
-6 M) [10].
Både laminin-1 og laminin-5 spaltes ved meprin-α
in vitro product: [37], og vi spekulere at meprin-α kan utsette kryptiske pro-trekkende epitoper på en lignende måte som har vært tidligere vist med laminin-5 og laminin-1 for MT1-MMP [38] og elastase [39], respektivt. UPA-plasminogen-systemet er også avgjørende viktig i angiogenese [23], [40], og plasmin i sin tur kan aktivere meprin-α som en nedstrøms angiogen effektor i tykk- og endetarmskreft. I tråd med våre data, har en pro-angiogen effekt av meprin-α også blitt observert i en morfolino knockdown i sebrafisk [14].
Den pro-angiogenetic aktivitet var tydelig med ekstracellulære løselig meprin-α, mens sin pro-trekkende effekten var tydelig på celler med meprin-α på deres celleoverflaten. Derfor kan den pro-angiogenetic virkning av meprin-α utgitt av cancerceller fremmes ved sin proteolytiske aktivitet utenfor og fjernt fra pro-angiogene /vaskulogen celler. Utskilt meprin-α kan således kondisjonere svulsten miljø for å fremme økt angiogenese sammen med andre pro-angiogene faktorer, mens meprin-α tjoret på celleoverflaten kan fremme migrering av kreftcellene. Begge meprin avhengige prosesser forventes å i fellesskap fremme tumorprogresjon.
I konklusjonen, avslører denne studien et komplekst og dynamisk regulering mønster for meprin-α i tumorprogresjon. Overgangen til ondartede stadier i tykktarmssvulster korrelerer med økt meprinα aktivitet ved primære tumor områder, i samsvar med en rolle i invasjonen og metastatisk spredning av kreftceller. En rolle for meprin-α i denne prosessen er videre støttet av sin pro-angiogenic og pro-vandrende aktivitet. Våre data viser også at markedsføringen av migrasjon avhenger av samtidige uttrykk for meprin-β-tilknytning meprin-α på celleoverflaten. Mangel på detekterbar meprin-β mRNA i hele tumoren ikke utelukker dens induksjon i en subpopulasjon av kreftceller. Våre data er i overensstemmelse med det syn at de meprin-α /β ko-uttrykkende kreftceller er sannsynlig å migrere vekk fra tumormassen. Vi har tidligere beskrevet at meprin-β svekker inter veikryss [41]. Fremtidige studier bør fokusere på analyse av rollen meprins i utvandring av disse kreftcellene. Den inhiberende aktivitet overfor meprin-α er lavere i sera fra pasienter med kolorektal kreft, som kan lette spredningen av meprin-uttrykkende kreftceller. Terapeutiske tilnærminger med proteasehemmere rettet mot meprin-α i primærsvulster og i blodet kan motvirke tumorprogresjon. På den annen side er meprin-α aktivitet lav i levermetastaser, og derfor inhibering av denne protease på dette området ikke er forventet å være en effektiv behandling.
Materialer og metoder
Rekombinant human meprin
Rekombinant aktiv meprin-α og meprin-β ble renset fra insektceller som beskrevet tidligere [7], [42]. Ingen gjenværende trypsin-aktivitet var påvisbar i de rensede rekombinante meprins.
Cellemigrering assay
Madin-Darby kaninnyre (MDCK) celler ble dyrket i minimum essensielt medium (MEM) supplert med 5% FCS 100 U /ml penicillin og 100 mikrogram /ml streptomycin (cellekulturmedier og tilskudd fra Invitrogen, Basel, Sveits). Meprin-transfekterte MDCK-celler [31] og villtype foreldre MDCK-celler ble sådd ut på laminin-1-belagte 12-brønners plater i en tetthet på 10’000 celler /brønn (12-brønns plater fra Costar, Cambridge, MA, USA, renset laminin-en fra Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom, Sigma, St. Louis, MO, US A) og inkubert over natten i MEM med 5% FCS. Etter en preinkubasjonstid av 48 timer i serumfritt medium (Avansert DMEM, Invitrogen) inneholder 20 nM hepatocyte vekstfaktor (HGF), ble migrerende celler registrert bruker tid forfalle videomicroscopy for 3-4 timer. Plasminogen (American Diagnostica, Pfungstadt, Tyskland) og actinonin (Sigma) ble begge tilsatt ved 100 nM. Migrasjon låter ble vurdert som rapportert tidligere [22]. HGF indusert migrering av MDCK-celler ved hastigheter mellom 27 og 84 um /time. I fravær av HGF, MDCK celler vokser i klynger og ikke migrere. På grunn av den tekniske begrensning av det eksperimentelle oppsettet som brukes, flere overførings eksperimenter måtte utføres sekvensielt på forskjellige dager. Som gjennomsnittlig vandringshastighet variert betydelig mellom eksperimentelle økter uavhengig av forholdene vurderes. målingene ble normalisert til migrering av villtype-celler ble observert i hver eksperimentell sesjon.
Angiogenese assay (aorta ring assay)
ringer av rotte thorakalaorta (1 mm lengde) ble dyrket i tre-dimensjonale kollagen-geler (rottehale interstitielt kollagen-gel, 1,5 mg /ml, Serva, Heidelberg, Tyskland) [23]. Kulturer ble opprettholdt i 9 dager ved 37 ° C i 6 ml MCDB 131 (Invitrogen) med 25 mM NaHCO3, 1% glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin, i nærvær eller fravær av 0,7 ug /ml renset rekombinant aktive humane meprin-α. Den angiogene responsen ble kvantifisert ved hjelp av bildeanalyse med programvaren Aphelion 3,2 (Adcis) på tre uavhengige forsøk (hver i tre eksemplarer). Følgende geometriske og morfologiske parametere ble bestemt. Antall microvessels (NV), maksimal microvessel lengde (Lmax) og totalt antall filialer i microvessels (Nb) [43]
Pasienter
Innsamling av vevsprøver under kirurgiske inngrep ble godkjent av etisk komité det medisinske fakultet, Universitetet i Bern, Sveits. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter. Karsinom ble iscenesatt i henhold til UICC nomenklatur. Studien inkluderte 72 pasienter (49/23 mann /kvinne, median 64,5 yrs, range 20-90 år), med 12 pasienter i hver av de følgende seks grupper: Adenomer (5/7 m /f, median 68,5 år, range 20 -89 år), primære svulster stadium I (7/5 m /f, median 72,5 år, range 60-90 år), stadium II (7/5 m /f, median 73 år, range 50-82 år), scenen III (10/2 mannlig /kvinnelig, median 64 år, range 48-84 år), stadium IV (9/3 m /f, median 60,5 år, range 43-84 år) og levermetastaser (11/1 m /f median 57,5 år, varierer 31-84 år). Prøvene i denne studien gruppen har blitt analysert ved Northern og Western blotting, immunhistokjemi og utsatt for meprin aktivitetsanalyser. Eksperimenter som er vist på fig. 5A /B inkludert ytterligere åtte prøver fra levermetastaser (6/2 m /f, median 68 år, range 37-82 år).
