Abstract
microRNAs (mirnas) er små (~22 nukleotid) ikke-kodende RNA som regulerer en myriade av biologiske prosesser og er ofte feilregulert i kreft. Kreft-assosiert microRNAs er påvist i serum og plasma og holde løftet som minimal invasiv kreft biomarkører, potensielt for å vurdere sykdomskarakteristika hos pasienter med metastatisk sykdom som er vanskelig å biopsi. Her brukte vi miRNA profilering for å identifisere kreftassosiert mirnas som er forskjellig uttrykt i serum fra pasienter med metastatisk kastrering resistent prostatakreft (mCRPC) sammenlignet med friske kontroller. Av 365 mirnas profilerte identifiserte vi fem serum mirnas (MIR-141, MIR-200A, MIR-200c, MIR-210 og MIR-375) som ble forhøyet i saker sammenlignet med kontroller på tvers av to uavhengige kohorter. En av disse, MIR-210, er en kjent transkripsjonen mål av den hypoksi-responsive HIF-1α signalveien. Eksponering av dyrkede prostata kreft celler til hypoksi førte til induksjon av MIR-210 og det ble lansert i det ekstracellulære miljøet. Videre fant vi at serum MIR-210 nivåer varierte sterkt blant mCRPC pasienter i terapi, og korrelert med behandlingsrespons vurdert av endring i Ptil. Våre resultater tyder på at (i) kreft-assosiert hypoksi er en hyppig, tidligere under-verdsatt karakteristisk for mCRPC, og (ii) serum MIR-210 kan videreutvikles som en prediktiv biomarkør hos pasienter med dette spesifikt sykdomsbiologi.
Citation: Cheng HH, Mitchell PS, Kroh EM, Dowell AE, Chéry L, Siddiqui J et al. (2013) Sirkulasjons mikroRNA Profilering Identifiserer et delsett med prostatakreft pasienter med tegn på kreft-Associated hypoksi. PLoS ONE 8 (7): e69239. doi: 10,1371 /journal.pone.0069239
Redaktør: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, USA
mottatt: 23 april 2013; Godkjent: 06.06.2013; Publisert: 30.07.2013
Copyright: © 2013 Cheng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding var levert av Canary Foundation (MT), Damon Runyon-Rachleff Innovation Award (MT), DOD Prostate Cancer New Investigator Award (MT), National Institutes of Health (NIH) CA093900 (til KJP), NIH CA143055 (til KJP) , NIH PO1 CA085859 (til RLV), NIH SPORE P50 CA69568 (til KJP og AMC), NIH SPORE P50 CA97186 (til PSN, MT, og RLV), NIH TR01 5R01DK085714 (MT), NIH T32CA009515-28 (til HHC) , Prostate Cancer Foundation Kreativitet Award (MT), og Richard M. Lucas Foundation (til RLV). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Muneesh Tewari er en navngitt oppfinner på patentsøknad med tittelen «Bruk av ekstracellulær RNA måle sykdom, «# 12/993828. H.H.C., P.S.M., E.M.K., A.E.D., L.C., J.S., P.S.N., B.S.K., R.L.V., A.M.C., K.J.P., og C.M. erklærer ingen konkurrerende interesser. Forfatterne bekrefter at dette ikke endrer sin tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Den naturlige historie av pasienter med metastatisk kastrering resistent prostatakreft (mCRPC) varierer allment, noe som tyder på en heterogen sykdom biologi i denne pasientgruppen. Men lite er kjent om biologisk heterogenitet i mCRPC og tilnærminger for klinisk stratifisering av pasienter er begrenset, i stor grad fordi metastatisk vev er ikke rutinemessig tilgjengelig for studien. Minimal invasiv (f.eks blod-basert) tilnærminger som kan hjelpe stratifisere pasienter på grunnlag av distinkte tumorbiologi kunne bidra til å informere behandlingsvalg, som er spesielt relevant med den nylige lanseringen av flere nye effektive behandlinger for mCRPC.
Sirkulasjons microRNAs (mirnas) er en voksende klasse av blodbaserte biomarkører med potensial til å gi informasjon om tydelig tumorbiologi hos enkelte pasienter [1]. mirnas er små (~22 nucleotide), ikke-kodende RNA-molekyler som etter transcriptionally regulerer genuttrykk ved translasjonsforskning undertrykkelse eller degradering av målrettede transkripsjoner [2]. Spesifikke mirnas har blitt funnet å regulere en rekke kritiske prosesser i tumor fysiologi, inkludert angiogenese [3], epitelial-til-mesenchymale overgang [4], metastase [5] og tumorrespons til hypoksi [6]. mirnas har vist seg å være effektive vev baserte kreft biomarkører-i diagnostisering av kreft i vev ukjent opprinnelse og i forutsi klinisk utfall [7] – [9]. Vi og andre har vist at sirkulerende, cellefrie, tumor-avledet mirnas er meget stabil og detekterbar i serum hos kreftpasienter [1]. I tidligere arbeid, brukte vi en kandidat miRNA tilnærming til å identifisere betydelig heving av MIR-141 i serum fra pasienter med metastatisk kastrering resistent prostatakreft (mCRPC) [1].
For å kunne mer omfattende identifisere prostatakreft -associated sirkulerende mirnas, i denne studien vi profilert serum mirnas fra pasienter med mCRPC. Vi identifiserte fem serum mirnas som ble betydelig forhøyet i saker sammenlignet med friske kontroller, inkludert den hypoksi-assosiert MIR-210. For å avgjøre om prostata kreft celler kan slippe MIR-210 som svar på hypoksi, utsettes vi prostata kreft cellelinjer til hypoksiske forhold og funnet ut at MIR-210 ble indusert og sluppet ut i ekstracellulære miljøet. I analysen av kliniske prøver og resultater, fant vi bevis for at en undergruppe av mCRPC pasienter har økt MIR-210 nivåer, og at dette korrelerer med behandlingsrespons, noe som tyder på at økt hypoksi er en funksjon av mCRPC som kan definere en undergruppe av pasienter med en distinkt sykdom biologi.
Materialer og metoder
Cell Culture
LNCaP (ATCC® CRL-1740 ™) og Vcap [10] menneskelige prostata kreft cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 og DMEM, henholdsvis hver supplert med 10% FBS (eller under serumfrie betingelser, som angitt), ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator. Hypoksiske forhold (1% O
2) ble etablert i en Thermo Scientific 3595 Inkubator (ThermoFisher), med celler holdt under normoksisk forhold (20% O
2) i parallell.
RNA Isolation fra dyrkede celler og Kondisjonert media
Kondisjonert medium ble fjernet fra celler dyrket i 24, 48 eller 72 timer under normoksiske og hypoksiske betingelser. Cellene ble vasket med 5 ml PBS og lysert på is direkte i kulturen fatet med 600 mL Lysis /Binding buffer fra
mir
Vana miRNA isolasjon kit (Ambion). Lysater ble høstet manuelt med en steril celleskraper og overført til en RNase- /DNase-fri 2 ml mikrosentrifugerør. RNA ble ekstrahert fra cellelysater følge produsentens anbefalte protokoll for total RNA isolasjon. Celleavfall ble fjernet fra en 500 ul alikvot av kondisjonert medium (10 ml totalt volum) ved filtrering gjennom en 0,2 um NanoSep filtreringsenhet (Millipore) ved 14.000 x
g
, 5 min, ved romtemperatur. 400 pl filtrerte prøven ble kombinert med 400 ul 2X denaturerende løsning (Ambion) og virvles.
C. elegans
nagler i oligonukleotider ble innført (som en blanding av 25 fmol av hvert oligonukleotid i 5 pl totalt volum per væskeprøve) etter denaturering og anvendt for å normalisere variasjonen i RNA isolert på tvers av prøvene som beskrevet tidligere [1]. RNA ble ekstrahert fra klimaanlegg medielysatene med
mir
Vana PARIS kit (Ambion) etter produsentens anbefalte protokoll for total RNA isolasjon.
Etikk erklæringen
Alle kliniske prøvene var innhentet fra personer som gitt skriftlig informert samtykke. Studiene ble utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen retningslinjer og med etikk godkjennelse fra Institutional Review Boards ved University of Washington, Fred Hutchinson Cancer Research Center og University of Michigan.
Blood Behandling og Isolering av Serum fra Clinical prøver
Alle kliniske prøver tatt ved University of Washington og University of Michigan ble samlet inn og behandlet som tidligere beskrevet [1], [11].
RNA Isolation fra kliniske Serumprøver prøver~~POS=HEADCOMP
Total RNA ble isolert fra 400 ul serum oppsamlet ved University of Washington hjelp av Mirvana PARIS sett (Ambion) som tidligere beskrevet [1]. Like volumer av hver prøvetype ble slått sammen for å skape mCRPC og sunne donor serum bassenger (n = 25 for hvert basseng) for TLDA profilering. Total RNA ble isolert fra serumprøver innsamlet ved University of Michigan hjelp av miRNeasy RNA isolering kit (Qiagen) som følger: 400 ul serum ble delt i fire, 100 ul alikvoter. Hver prøve ble denaturert ved bruk av 10X volum (1 ml) Qiazol, som ble vortex-blandet og inkubert ved romtemperatur i 10 min.
C. elegans
nagler i oligonukleotider ble innført (som en blanding av 25 fmol av hvert oligonukleotid i 5 pl totalt volum per væskeprøve) etter denaturering, som ble anvendt for å normalisere variasjonen i RNA isolert på tvers av prøvene som beskrevet tidligere [1] . RNA ble ekstrahert ved bruk av 0,2X volum kloroform (220 pl), og total RNA ble isolert følge produsentens protokoll. For en gitt prøve, ble RNA isolert fra hver 100 ul alikvot oppsamlet og konsentrert til 100 ul volum over mikrokon YM-3 filterenheter (Millipore) ved 14.000 x
g
, 1,5 time, 4 ° C, som var lastet invertert inn i pre-veide 1,5 ml mikrosentrifugerør og eluert ved 1000 x
g
, 3 min, 4 ° C. Rør pluss Eluatet ble veid på en analytisk skala og brakt til 100 pl med elueringsbuffer. RNA ble lagret ved -80 ° C.
innsamling og behandling av kliniske vevssnitt
Laser-fangst mikro-disseksjon (LCM) av frossen-vevssnitt.
Avsnitt av flash-frosset prostata og lymfeknute oppnådd fra radikal prostatektomi og hurtig obduksjon, respektivt, ble undersøkt av en patolog for å definere regioner av tumor epitelceller. For laser capture mikrodisseksjon 5 mikrometer deler av fryst vev ble gjort på en Leica ™ CM3050S cryostat ved -20 ° C (Leica, Wetzlar, Tyskland) som er lagt inn på PEN Membran Ramme Slides (MDS Inc., Ontario, Canada) så farget og faste henhold til HistoGene ™ LCM Frozen § Farging Kit-protokollen (MDS Inc.). For hver prøve ca. 2000 celler ble laser fanget på 200x forstørrelse (Veritas, Arcturus MDS Inc., Ontario, Canada). Det innfangede prøve ble plassert i 300 ul lyseringsbuffer fra RNAqueous® RNA Isolation Kit (Ambion, Austin, Texas), inkubert i 30 minutter ved 42 ° C og lagret ved -80 ° C inntil RNA isolasjon ble utført. miRNA ble så isolert ved hjelp av RNAqueous® RNA Isolation Kit (Ambion).
RNA isolert fra LCM vevsprøver.
Total RNA ble isolert fra LCM vevsprøver ved hjelp av RNAqueous-Micro RNA isolering kit (Ambion) som følger: Frosne lysater ble tint på is, virvles og sentrifugert ved 16 100 x g, 30 sek, romtemperatur.
C. elegans
tilsatt-i oligonukleotider ble innført (som en blanding av 25 fmol av hvert oligonukleotid i 5 pl totalt volum per væskeprøve) og anvendt for å normalisere variasjonen i RNA isolert på tvers av prøvene som beskrevet tidligere [1], etterfulgt av tilsetning av 3 ul LCM Additiv. RNA ble utfelt fra lysatet blanding med 1,25 volumer 100% molekyl grad EtOH, og ble deretter bundet til mikroFilterPatron sammenstilling (prewet med 30 pl Lysis oppløsningen i 5 minutter) ved sentrifugering ved 10 000 x g, 1 min. Filteret ble vasket (180 mL vaskeløsning 1, 10000 ×
g
, 1 min, 2 x 180 mL vaskeløsning 2/3, 16 100 ×
g
, 30 sek, luft bare, 16,100 ×
g
, 30 sek). RNA ble eluert fra kolonnen to ganger med 10 ul 95 ° C elueringsbuffer inn i pre-veid rør. Eluatene ble veid på en analytisk skala og bragt til 20 pl med elueringsbuffer. RNA ble lagret ved -80 ° C.
mikroRNA Profilering bruker TaqMan Low-Density Array miRNA QRT-PCR og Biomarker Candidate Selection
RNA fra sammenslått serum fra mCRPC pasienter eller friske kontroller (bestående av lik RNA volum fra hver av 25 prøver per pool) ble revers-transkribert i like reaksjoner fra 2 mL av samle RNA bruker TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit og TaqMan miRNA Multiplex RT Analyser (menneskelig pool Set). En samleprøve tilnærming ble valgt for kostnadseffektiv funn av miRNA biomarkører. miRNA ekspresjon ble profilert fra hver RT-reaksjon gjengivelse ved hjelp av TaqMan Low-Density Array (TLDA, v1.0) som tidligere beskrevet [1]. Multiplex revers-transkripsjon TLDA QRT-PCR ble utført på en Applied Biosystems 7900HT termo bruke produsentens anbefalte sykkelforhold. Data ble analysert med SDS Relativ Kvantifisering Software versjon 2.2.2 (Applied BioSystems), med en automatisk tildelt minimum terskel, som var over grunnlinjen for alle analyser som viser målbar forsterkning over bakgrunnen. Verdier som var under minstekravet ble vilkårlig tildelt en syklus terskel (CT) verdien av 40.
P
-verdier ble tildelt av t-test evaluering replikere profilering data fra hver å bestemme signifikante forskjeller i miRNA uttrykket mellom mCRPC basseng og sunne kontroll basseng RNA prøver. Fold-endring (FC) verdiene ble utledet ved å beregne 2
∧ (AveCT
mCRPC pool-AveCT
sunt kontroll basseng). MikroRNA kandidat biomarkører ble valgt av kriteriet for FC 5 og
P
. 0,05
Måling av miRNA og mRNA nivåer av private TaqMan kvantitativ revers-transkripsjon PCR (QRT-PCR)
miRNA-avledet fra serumprøver ble revers-transkribert ved bruk av TaqMan miRNA Reverse Transcription kit (Applied BioSystems) og kvantifisert ved TaqMan miRNA QRT-PCR ved hjelp av miRNA-spesifikke primer /probe sett (Applied BioSystems) som tidligere beskrevet [ ,,,0],1]. En fullstendig beskrivelse av TaqMan analyser brukt i denne studien er gitt i tabell S4.
mirnas stammer fra serumprøver hentet fra University of Michigan ble kvantifisert ved TaqMan miRNA QRT-PCR bruke syntetiske miRNA standardkurver for absolutt kvantifisering identisk den som er beskrevet for den University of Washington prøvesett [1] med unntak av at pre-forsterkningstrinn ble utelukket fra all miRNA kvantifisering annet enn MIR-210 (dette var basert på empirisk bevis på at pre-amplifikasjon ikke øker den absolutte kopien antall miRNA påvises for andre TaqMan miRNA analyser som brukes her, data ikke vist)
Gene utfoldelse ble kvantifisert ved TaqMan QRT-PCR som følger:. innspill RNA ble revers transkribert ved bruk av TaqMan Gene-Expression Reverse Transcription Kit (Applied BioSystems) i en liten skala RT reaksjon [består av 0,5 mL av 10X Reverse-transkripsjon buffer, 0,5 ul 10X Tilfeldige Grunning, 0,2 mL 100 mM dNTP med dTTP, 0,25 mL Multiscribe omvendt transkriptase og 3,55 mL innspill RNA; andre enn inngangs RNA komponenter ble fremstilt som et større volum konsentrat-blanding] under anvendelse av en Tetrad2 Peltier Thermal Cycler (BioRad) ved 50 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 30 sykluser av 95 ° C i 10 min, 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 60 sek. Resulterende cDNA ble kombinert med 3,75 mL pre-forsterkning assayreagenser [bestående av 2,5 mL TaqMan PreAmp Master Mix og 1,25 mL TaqMan Gene-Expression analyse (GUSB eller KRT18) fortynnet 1:100 i TE; andre enn inngangs cDNA komponenter ble fremstilt som et større volum konsentrat-blanding for å generere et 5,0 pl totalt volum PCR-reaksjon] under anvendelse av en Tetrad2 Peltier Thermal Cycler (BioRad) ved 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 14 sykluser på 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 4 min. GUSB eller KRT18 pre-forsterkning reaksjonsprodukter ble kombinert med 2,75 mL av PCR assayreagenser [bestående av 2,5 mL TaqMan 2X Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG og 0,25 mL 20X TaqMan Gene-Expression analyse) for å generere en 5,0 mL totalvolum PCR reaksjonen for GUSB eller KRT18, respektivt. Sanntids-PCR ble utført på en Applied BioSystems 7900HT termo ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 min. Data ble analysert med SDS Relativ Kvantifisering Software versjon 2.2.2 (Applied BioSystems), med automatisk CT innstilling for tildeling baseline og terskelen for CT bestemmelse (se tabell S3 for resultatene av messenger RNA målinger).
Resultater og diskusjon
for å effektivt oppdage serum mirnas som er forskjellig rikelig mellom krefttilfellene vs kontroller, vi brukte real-time PCR-basert miRNA TaqMan Low-Density Arrays (TLDA) for å screene for differensial overflod av 365 miRNAs i serum RNA samlet fra mCRPC pasienter (
n =
25) versus alder-matchet kontroller (
n =
25; alle kontroller hadde normal PSA og normale digitale endetarms eksamen funn). Etter normalisering av data ved hjelp av spike-in kontroll mirnas og sammenligning av samlet serum RNA fra mCRPC saker som for kontroller (Fig. 1
A Hotell og
innfelt
), identifiserte vi ni mirnas demonstrere en større enn fem ganger endring i overflod (ujustert
P
0,05, t-test). Vi neste individuelt målt disse ni mirnas fra serum RNA av enkelt mCRPC saker og kontroller ved hjelp av miRNA-spesifikke Taqman QRT-PCR-analyser. Serumnivåer av fem mirnas ble bekreftet å være signifikant forhøyet i mCRPC tilfeller sammenlignet med kontroller (MIR-141:
P
0,0001, MIR-200a:
P =
0,007, MIR-200C :
P =
0,017, MIR-375:
P =
0,009, og MIR-210:
P =
0,022, Wilcoxon signed-rank analyse). Den gjennomsnittlige fold-forskjell mellom saker og kontroller varierte fra 4,6 (MIR-375) til 27,9 (MIR-141) (Fig. 1
B
,
øvre Hotell og tabell S1). I tillegg mottaker-drift karakteristiske (ROC) tomter demonstrere kapasiteten på disse miRNAs å skille mellom de to gruppene (MIR-141 arealet under kurven (AUC) = 0,899; MIR-200a AUC = 0,699; MIR-375 AUC = 0,773 ; MIR-200c AUC = 0,721 og MIR-210 AUC = 0,678) (fig 1
B
,
lavere
).. Viktigere, bekreftet vi at kontroll mirnas ble ikke uttrykt forskjellig mellom de to populasjonene (Fig. S1).
(
A)
Måling av sirkulerende miRNAs i sera samlet fra pasienter med avansert prostatakreft som sammenlignet med friske donorer (som omfatter en Discovery Set) av TLDA profilering. Blå- og brun fylte sirkler representerer serum mirnas økt eller redusert (med ujustert p-verdi 0,05), henholdsvis i mCRPC pasienter sammenlignet med friske kontroller.
Innfelt:
Ni mirnas demonstrert 5 ganger endring (ujustert
P
0,05, t-test). FC, fold-endring. (
B)
Bekreftelse på mCRPC-forbundet serum mirnas i enkeltprøver fra Discovery Set fra University of Washington prøver.
Øvre
: miRNA biomarkør kandidater ble målt i enkeltprøver av TaqMan miRNA QRT-PCR (
P
verdi tilordnet av Wilcoxon signed-rank test), hvor miRNA overflod er gitt i form av miRNA kopier /ul serum. Røde barer, mener +/- SEM av miRNA kopier /mL serum for hver gruppe.
Nedre product:: Receiver Operating karakteristiske (ROC) kurver plotte sensitivitet vs. (1 – spesifisitet) for å vurdere muligheten for hver miRNA biomarkør å skille saker fra kontroller.
(C)
Validering av mCRPC-forbundet serum mirnas i en uavhengig validering Set.
Øvre
: Serumkonsentrasjonen (kopier /mikroliter) av MIR-141, MIR-375, MIR-200c, MIR-200A og MIR-210 ble målt ved TaqMan miRNA QRT-PCR. Dot-plot forbundet
P
verdier ble tildelt av Wilcoxon signed-rank test. Prikkplott og ROC kurver ble generert som beskrevet for fig. 1.
Nedre
:
Red
, resultatene fra valideringen prøvesett hentet fra University of Michigan.
Svart
, resultater fra den primære prøvesett hentet fra University of Washington gjengitt fra fig. 1
B
, lavere
. AUC, arealet under kurven; mCRPC, prostatakreft pasientserum; FC, fold-endring; CTL, kontrollsera (fra alderstilpassede mannlige personer med normal PSA og negativ digital endetarms eksamen).
For å validere disse funnene i en uavhengig prøve sett samlet på en annen institusjon, målte vi MIR-141 , MIR-200A, MIR-200c, MIR-375 og MIR-210 fra sera av ytterligere 21 mCRPC pasienter og 20 alderstilpassede friske kontroller innsamlet ved University of Michigan. Alle fem mirnas ble forhøyet i sera fra mCRPC tilfeller i forhold til kontrollene i dette uavhengig validering sett. MiR-141, MIR-375 og MIR-210 var signifikant på
P
-verdi terskel 0,01 i andre kohort (
P =
0,001,
P =
0,021,
P =
0,022, henholdsvis) og Mir-200A og MIR-200c tendens mot betydning (
P =
0,073,
P =
0.055, henholdsvis) (fig. 1
C
,
øvre
). ROC-kurver var generelt konkordant mellom prøveeksemplarer fra de to institusjonene (Fig. 1
C
,
lavere
). Analyse av serum miRNA markører i ulike kombinasjoner viste at å legge til flere mirnas til serum MIR-141 (som hadde den beste ytelsen alene) ikke forbedre evnen til å skille mellom saker og kontroller (data ikke vist). I samsvar med denne observasjonen, fant vi at blant krefttilfeller der uttrykk for MIR-141, MIR-200A, MIR-200c, og MIR-375 var høyere enn alle friske kontroller ble disse mirnas også signifikant korrelert med hverandre og med serum PSA (tabell S2). I kontrast, gjorde MIR-210 ikke viser signifikant sammenheng med noen av disse fire mirnas (Tabell S3) eller med serum PSA, noe som tyder på at den gir tydelig informasjon om sykdommen biologi.
For å avgjøre om de fem serum miRNA markører av mCRPC er uttrykt i prostata cancer vev og kan derfor være troverdig kreftcelle-avledet, målte vi deres ekspresjon i epitelceller som hadde vært laser fange mikro dissekert fra primær prostata kreftvev (
n =
8) og lymfeknutemetastaser (
n =
8). Vi oppdaget MIR-141, MIR-200A, MIR-200c, MIR-375 og MIR-210 i alle vevstyper evaluert (tabell S3), noe som tyder på at disse fem mirnas, når de blir funnet i omløp, kan stamme fra prostatakreft, selv om andre flere kilder kan ikke utelukkes.
Tre av serum prostata kreft-assosiert mirnas identifisert (MIR-141, MIR-200A og MIR-200c) er epitelial-spesifikke, svært knyttet i rekkefølge og har kjente roller i opprettholdelse av epiteliale tilstand ved undertrykkelse av de epiteliale-til-mesenchymale overgang [4]. Vi hypotese at forhøyede sirkulerende nivåer av MIR-141, MIR-200A og MIR-200c reflektere epithelial opprinnelsen til prostatakreftceller.
Tilstedeværelsen av forhøyede sirkulerende MIR-141 og MIR-375 i mCRPC pasienter har også blitt observert i nyere mCRPC sirkulerende miRNA biomarkør studier [12] – [16]. Interessant, forhøyet MIR-210 ble ikke rapportert i disse andre studier, til tross for at vi har observert dette i uavhengige prøvesett fra to ulike institusjoner. Dette kan være på grunn av forskjellige sammenligningsgrupper som brukes (for eksempel prostatakreft snarere enn friske kontroller som komparator for å mCRPC), anvendelsen av plasma i stedet for serum, forskjeller i data analytisk tilnærming brukes til å identifisere differensielt uttrykte mirnas, samt eventuelle forskjeller i de kliniske karakteristika for de mCRPC pasienter på tvers av forskjellige studier.
forhøyede nivåer av MIR-210 i serum fra pasienter med mCRPC var spesielt interessant fordi dette miRNA er godt kjent for å være transkripsjonelt aktiveres ved hypoksi -inducible faktor 1 alfa (HIF-1α) [17], [18], og kan bidra til tilpasning til hypoksi i tumorer [19], [20]. Dette øker muligheten for at MIR-210 produsert og frigjort av hypoksiske celler i prostata kreft (og /eller av svulsten mikro), en potensiell forklaring på forhøyede nivåer av MIR-210 vi observert i serum fra en undergruppe av pasienter med mCRPC.
for å teste om hypoksi kan stimulere produksjon og frigjøring av MIR-210 i prostatakreftceller, preget vi MIR-210 overflod i LNCaP og Vcap prostatakreftcellelinjer (samt i filtrert betinget media) under normoksiske (20% O
2) og hypoksisk (1% O
2) forhold over en 72-timers kurs (fig. 2). MIR-210-nivåene ble øket ved hypoksi sammenlignet med normoxia med en første induksjons i LNCaP-celler etterfulgt av en påfølgende økt nivå i det kondisjonerte mediet (Fig. 2). I Vcap celler, gjorde vi ikke observere den samme økningen i MIR-210 kopier /ng av RNA og nivåene falt på 72 timer. Vi spekulere i at dette kan skyldes celledød eller, alternativt, at reguleringen av MIR-210 som reaksjon på hypoksi i VCap celler kan være primært forekommer på nivå med frigivelse. Men vi observere en trinnvis, tidsavhengig økning i nivået av ekstracellulært MIR-210 i den betingede media av Vcap celler (fig. 2). Til sammen tyder resultatene på at forhøyede nivåer av MIR-210 påvist i serum kunne reflektere svulsten hypoksi.
Venstre kolonne, etter MIR-210 kopier /ng RNA i LNCaP og Vcap menneskelige prostata kreft cellelinjer dyrket i normoksiske (20% O
2) (hvite søyler) eller hypoksisk (1% O
2) (blå søyler) forhold for 24, 48 eller 72 timer.
Høyre kolonne, etter MIR-210 kopier /mikroliter i filtrert betinget media tilsvarende celleprøver. *,
P
verdi 0,05; **
P
verdi 0,01; ***,
P
verdi. 0,001 (t-test)
Tumor hypoksi er en godt karakterisert prosess som bidrar til kreft progresjon og metastaser i mange humane kreftformer [21]. Evaluering av svulsten hypoksi i mCRPC har vært begrenset til dato på grunn av sjeldne prøvetaking av metastaser for rutinemessig klinisk arbeid. I en immunhistokjemi studie av HIF-1α uttrykk som innlemmet et lite sett med prostata kreft metastaser, ble HIF-1α uttrykk observert å variere mye i metastatiske lesjoner [22]. Her viser vi at en undergruppe av pasienter med metastatisk prostatakreft har økt nivå av serum MIR-210, som gir bevis for tidligere under-verdsatt hypoksi i mCRPC. Selv om ikke-svulstvev kilder til Mir-210 ikke kan utelukkes, er det faktum at systemisk hypoxemia er ikke et typisk trekk ved mCRPC er konsistent med en modell der svulstvev hypoksi er opprinnelsen av det overskytende serum MIR-210. Spesielt, forhøyet sirkulerende MIR-210 har også blitt observert hos pasienter med bukspyttkjertel adenokarsinom [23], en sykdom hvor svulsten hypoksi er godt anerkjent og skyldes høyt interstitielt trykk på grunn av verten desmoplastic respons.
En veldokumentert fenomen forbundet med svulst hypoksi er foreningen med resistens mot behandling med strålebehandling, kjemoterapi og andre behandlinger [21]. For å avgjøre om observerte serum MIR-210 nivåer var assosiert med behandling motstand, vi retrospektivt vurdert om pasienter ble reagere eller resistent mot pågående behandlingen ved å beregne% PSA endring /dag ved hjelp av tilgjengelige kliniske PSA-verdier målt sist før og samtidig med serum MIR-210 uavgjort. Terapi varierte mellom pasienter i denne retrospektive befolkningen, men vanligvis er involvert androgen deprivasjon ved hjelp av en GnRH-agonist i kombinasjon med et kjemoterapeutisk middel (f.eks, docetaxel, mitoxantron). Vi fant at serum MIR-210 nivåer var signifikant korrelert med% PSA endring /dag i løpet av behandlingen (Fig. 3
En
, Pearson r = 0,46,
P =
0,029). For å redusere potensielle støy fra pasienter som er mindre informativ på grunn av lave nivåer av kreftrelatert serum mirnas, vi også analysert en undergruppe av pasienter med høye nivåer av mCRPC-forbundet serum mirnas (dvs. «miRNA-høy undergruppe», definert som pasienter hvis serum MIR-141, MIR-200A, MIR-200c og /eller MIR-375 nivåer var høyere enn den høyeste verdien observert i noen av de 25 friske kontroller). I denne gruppen korrelasjonen mellom serum MIR-210 og% PSA endring /dag var enda sterkere (Fig. 3
En
, Pearson r = 0,61,
P
= 0,029). Videre er serumnivået av MIR-210 var påfallende lavere hos pasienter med sykdom var å svare på behandling (PSA stabil eller synkende), sammenlignet med de som sykdommen var resistent mot behandling (PSA øker med ≥25%) (Fig. 3
B, etter
P
=
0,001). Viktigere, vi ikke observere dette sammen med de fire andre serum mirnas identifisert i vår studie (Fig. 3
C
). Våre data tyder på en modell der økt hypoksi respons signalering er til stede i en undergruppe av mCRPC pasienter, som fører til økt serum MIR-210 og terapi motstand
Øvre.
MIR-210 kopier /mL serum versus% PSA endring /dag. % Endring PSA /dag representerer et mål på respons på behandling, og ble beregnet ved hjelp av tilgjengelige kliniske PSA-verdiene, målt før sist, og ved tidspunktet for serum MIR-210 trekning. Gjennomsnittlig tid gått mellom de to blodprøver var 30 dager. Lukkede sirkler representerer undergruppe av pasienter som er definert som «miRNA-high», basert på høyere overflod av mCRPC-forbundet serum mirnas forhold til alle kontrollpersoner (som beskrevet i Resultater og Diskusjon). Åpne sirkler representerer pasienter med mCRPC som ikke oppfyller definisjonen for «miRNA-high». Heltrukket linje representerer trendlinjen av miRNA-høy pasient delsett representerer stiplet linje trendlinjen for alle pasienter.
Middle:
MIR-210 kopier /ul serum hos pasienter med en PSA Response (R) eller Nei PSA Response (NR). PSA Response er definert som et synkende eller stabil PSA (noen endring mindre enn en 25% økning), og ingen PSA Response er definert som en PSA økning på 25% eller mer, ligner på prostatakreft Working Group kriterier.
Nedre:.
Kopier /ul serum fra MIR-141, MIR-200A, MIR-200c og MIR-375 pasienter, R og NR
Så vidt vi vet, er dette den første rapporten av sirkulerende MIR-210 i forbindelse med mCRPC. Våre resultater øke muligheten for at serum MIR-210 nivåer kan brukes til å identifisere en biologisk distinkt, undergruppe av mCRPC pasienter med tumorassosierte hypoksi for hvem utvikling av alternative terapeutiske metoder kunne bli vurdert. For eksempel, har plasma MIR-210 nivåer blitt rapportert å være høyere hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen, og som en indikator på hypoksi [23], [24], så vel som korrelert med respons på trastuzumab i brystkreftpasienter [25]. I tillegg er mTOR inhibitorer blir studert i prostata cancer og pre-kliniske studier har vist at mTOR-hemming kan føre til AKT aktivering og HIF-1α transkripsjonen aktivering [26].
