Abstract
BPR0L075 [6-metoksy-3- (3 «, 4′, 5»-trimetoksy-benzoyl) -1 H-indol] er en ny anti-mikrotubuli medikament med anti-tumor og anti -angiogenic aktiviteter
in vitro Hotell og
in vivo
. Securin er nødvendig for genomet stabilitet, og uttrykkes rikelig i de fleste kreftceller, fremme celleproliferasjon og tumorigenesis. I denne studien fant vi at BPR0L075 effektivt indusert celledød av HCT116 menneskelige kolorektal kreft celler som har høyere uttrykk nivåer av securin. Den cytotoksisitet av BPR0L075 ble svekket i isogene securin-null HCT116-celler. BPR0L075 indusert DNA skade respons, G
2 /M arrest, og aktivering av spindelenheten sjekkpunkt i HCT116 cellene. Interessant, BPR0L075 indusert fosforylering av securin. BPR0L075 tilbaketrekking førte til nedbrytning av securin, mitotisk exit, og mitotisk katastrofe, som ble svekket i securin-null celler. Hemming av cdc2 redusert securin fosforylering, G
2 /M arrest og celledød indusert av BPR0L075. Videre BPR0L075 forårsaket celledød gjennom en caspase-uavhengig mekanisme og aktivering av JNK og p38 MAPK veier. Disse resultatene gitt bevis for første gang at BPR0L075 behandling er fordelaktig for behandling av humane kolorektale tumorer med høyere nivåer av securin. Derfor foreslår vi at uttrykket nivåer av securin kan være en prediktiv faktor for anvendelse i anti-kreftbehandling med BPR0L075 i humane kreftceller
Citation. Tseng HH, Chuah QY, Yang PM, Chen CT, Chao JC, Lin MD, et al. (2012) Securin Forbedrer kreft Effekter av 6-metoksy-3- (3 «, 4′, 5»-trimetoksy-Benzoyl) -1 H-Indole (BPR0L075) i Human tykktarmskreftceller. PLoS ONE 7 (4): e36006. doi: 10,1371 /journal.pone.0036006
Redaktør: Regine Schneider-Stock, Institutt for patologi, Tyskland
mottatt: 23 desember 2011; Godkjent: 29 mars 2012; Publisert: 26 april 2012
Copyright: © 2012 Tseng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Grant tall : National Science Council, Taiwan (NSC 99-2314-B-320-004-My3). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mikrotubuli er en komponent av cytoskjelettet og er sammensatt av α-tubulin og p-tubulin heterdimers [1]. Mikrotubuli er spesielt viktig i mitose og celledeling, og dette har medført at mikrotubuli har blitt et mål for kreft narkotika [2], [3]. Ifølge ulike tubulin-bindingsseter, er anti-mikrotubulidynamikk narkotika klassifisert i tre klasser: paclitaxel språk, vinkristin nettstedet, og colchicines domene. Anti-mikrotubul medikamenter kan indusere enten mikrotubulus stabilisering, slik som vist med paclitaxel, eller destabilisering, som sett med vinblastin og kolchicin [4]. BPR0L075 [6-metoksy-3- (3 «, 4′, 5»-trimetoksy-benzoyl) -1H-indol], en Combretastatin A-4 (CA-4) analog, som er avledet fra South African treet
combretum caffrum
, er en roman syntetisk anti-microtubule stoff som hemmer tubulinpolymerisering ved binding til kolkisin domene [5], og ble godkjent av amerikanske FDA for fase 1 kliniske studier i 2010. Nyere studier har rapportert at BPR0L075 utøver ikke bare anti-mitotiske og anti-svulst aktiviteter, men også anti-angiogen aktivitet
in vitro Hotell og
in vivo product: [6], [7].
Mitotisk katastrofe er en form for celledød som resulterer fra unormal mitose [8]. Det kan utløses av medikamenter som påvirker mikrotubulus stabilitet, diverse anticancer legemidler, ioniserende stråling og mitotisk svikt indusert av cellesyklus kontrollpunkt defekten [8], [9]. Videre kan mitotisk katastrofe være caspase-avhengige eller-Uavhengig [10]. Biokjemiske funksjoner i mitotisk katastrofe er langvarig spindelenheten sjekkpunkt (SAC) signalering, avvikende nivåer av cyclin B1, og signaliserte via Cdk1 [11]. Celledød forårsaket av mitotisk katastrofe kan oppstå under eller etter mitose [12]. Anti-mikrotubulidynamikk narkotika, for eksempel docetaxel og Combretastatin-A4 prodrug (CA4P), indusere kreft celledød gjennom mitotisk katastrofe [13], [14]. Disse funnene tyder på en mulig rolle BPR0L075 i indusere mitotisk katastrofe i humane kreftceller. Hvorvidt eller ikke mitotiske katastrofe indusert av BPR0L075 behandling bidrar til cancercelledød er verd undersøkelse.
Securin, også kjent som den hypofysetumor transgenet (PTTG1), ble først isolert fra rotte-hypofyse-tumorceller [15] . Securin er et multi-funksjonelt protein som regulerer søster kromatin segregering i mitosen [16], DNA-reparasjons [17], gentranskripsjon [18], metabolisme og organutvikling [19] – [21]. I normalt vev, securin uttrykk er høy i testis og lav i thymus, tykktarm og tynntarm [22]. I motsetning til dette, securin har blitt identifisert som et onkogen, og en markør for invasivitet på grunn av sin overekspresjon i en rekke forskjellige tumorer [23], og er blitt funnet å regulere tumorcelle-proliferasjon og tumorigenesis [24], [25]. I våre tidligere studier, ble anticancermidler slik som oksaliplatin og fisetin vist seg å indusere cancercelledød gjennom nedregulering av ekspresjon securin [26] – [28]. BPR0L075 besitter anti-tumor og anti-angiogeneic aktivitet ved å inhibere funksjonen av mikrotubuli, særlig ved metafase til anaphase overgang i mitosen [6], [7]. Securin er også et protein som er involvert i kontroll av metafase-anaphase overgang og anaphase utbruddet. Imidlertid er fremdeles ukjent effektiviteten av BPR0L075 i pasienter med cancer høyt uttrykkende securin.
I denne studien undersøkte vi rolle securin i forstyrrer følsomhet for BPR0L075 i humane kreftceller, og viste for første gang at fosforylering og destabilisering av securin øker følsomheten til microtubule de-stabilisere forbindelsen BPR0L075 i HCT116 humane kolorektal kreftceller. Vi ytterligere belyst de molekylære mekanismer av celledød indusert av BPR0L075 i HCT116-celler. Våre funn tyder på at securin ser ut til å være et egnet klinisk mål for BPR0L075 behandling.
Resultater
De kreft effekter av BPR0L075 var korrelert med uttrykket nivåer av securin i humane kreftceller
for å undersøke hvilken rolle securin i kreft effekter av BPR0L075, flere humane kreftceller med ulike securin uttrykk nivåer, inkludert lungekreft celler (A549), menneskelige brystkreft celler (MCF-7 og MDA-MB-231), melanom ( MDA-MB-435) og kolorektal kreftceller (HCT116), ble brukt (fig. 1a). Etter behandling med BPR0L075 i 24 timer ble deres celleviabilitet effektivt hemmet. Blant dem, HCT116-celler med det høyeste ekspresjonsnivået av securin utviste den høyeste følsomhet for BPR0L075 (Fig. 1B). For å fastslå rollen til securin i cytotoksisiteten til BPR0L075, ble HCT116-celler behandlet med BPR0L075 og cellelevedyktigheten ble deretter undersøkt ved hjelp av MTT-analyse. Som forventet ble cytotoksisitet av BPR0L075 redusert i securin-null HCT116-celler (Fig. 1C), noe som indikerer at securin uttrykk forbedret kreft effekter av BPR0L075.
(A) Nivåene av securin i A549, MCF- 7, MDA-MB-231, MDA-MB-435 og HCT116-celler ble karakterisert ved Western blot-analyse. (B) Celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av BPR0L075 i 24 timer. Cellelevedyktigheten ble undersøkt ved hjelp av MTT-analyse. (C) Et cellelevedyktighet securin-villtype og -null HCT116-celler ble målt ved MTT-analyse. p 0,01 (**) viser en signifikant forskjell mellom BPR0L075-behandlede og ubehandlede prøver. p 0,01 (##) viser en signifikant forskjell mellom securin-villtype og -null HCT116 cellene
Tap av securin uttrykk svekket cytotoksisiteten til BPR0L075 gjennom reduksjoner på G
2 /. M og apoptose i HCT116 kolorektal kreft celler
for ytterligere å karakterisere rollen securin i BPR0L075-indusert cytotoksisitet, cellecyklusprogresjonen og celledød ble analysert ved flowcytometri. BPR0L075 ble funnet å indusere G
2 /M arrest (Fig. 2A) og apoptose (Fig. 2B) i HCT116 cellene, som ble svekket i securin-null celler. Interessant, kolkisin-indusert G
2 /M arrest ble også redusert i securin-null HCT116-celler (fig. 2A), mens cisplatin indusert lignende fraksjoner av apoptose i securin-villtype og -null HCT116-celler (Fig. 2B ). Disse resultatene antydet at securin er spesielt nødvendig for kreft effekter av mikrotubul-målsøkende medikamenter.
Celler ble behandlet med 5 til 80 nM BPR0L075 i 24 timer. (A) Et cellesyklusfordelingen ble analysert ved flow-cytometri. Prosentene av G
2 /M celler ble kvantifisert. (B) Celle apoptose ble bestemt ved Annexin V-/PI dobbel farging. Apoptotiske celler ble kvantifisert ved begge Annexin-V positive og Annexin-V /PI doble positive celler. p 0,01 (**) indikerer en signifikant forskjell sammenlignet med ubehandlede prøver. p 0,01 (##) viser en signifikant forskjell mellom securin-villtype og -null HCT116 cellene
Securin forbedret BPR0L075-indusert DNA skade respons og spindelenheten sjekkpunkt i HCT116 cellene
.
cytostatika kan føre til DNA-skader av kreftceller og dermed aktivere cellesyklus sjekkpunkter, noe som fører til cellesyklus arrest, og la cellene til å reparere før du går inn mitose. Dersom cellene ikke klarer å reparere, vil celledød ved apoptose passes [29], [30]. γ-H2AX er å anse som en kontrollpost vedlikehold faktor, og dens defosforylering muliggjør gjenopptakelse av cellesyklusen etter DNA-skade blir reparert [31]. For å undersøke hvorvidt BPR0L075 induserte en DNA-skade respons i HCT116-celler, ble proteinnivået i γ-H2AX etter BPR0L075 behandling analysert ved hjelp av western blot. BPR0L075 indusert γ-H2AX ekspresjon i både securin-villtype og -null HCT116-celler (fig. 3A). Som svar på DNA-skader, to forskjellige kinase signaliserer kaskader, ATM /Chk2 og ATR /Chk1 trasé, aktiveres [32]. Nivåene av fosforylering av Chk1 og Chk2 ble forhøyet ved BPR0L075 behandling i både securin-villtype og -null HCT116 cellene. Videre aktivering av Chk1 og Chk2 var høyere i de securin-villtype-celler enn i de securin-null HCT116-celler etter BPR0L075 behandling (Fig. 3A).
Celler ble behandlet med 10~80 nM BPR0L075 i 24 timer. (A) Konsentrasjonene av γ-H2AX, fosfo-chk1, fosfo-chk2, ble total chk1 og chk2 analysert ved hjelp av Western blot i BPR0L075-behandlede securin-villtype og -null HCT116-celler. (B) Nivåene av securin, fosfor-H3 (Ser10), cyclin B1, fosfor-cdc2 (Thr161) og totale cdc2 ble konstatert ved Western blot analyse.
Behandling av celler med mikrotubulidynamikk hemmere fører i aktivering av mitotiske spindelenheten sjekkpunkt (SAC), som fører til mitotisk arrest før anaphase [33]. Dessuten, aktivering av SAC hemmer også anafase-fremme kompleks /cyclosome (APC /C), som fører til stabilisering av securin og cyklin B1 [34]. For å belyse hvorvidt BPR0L075 aktivert SAC ble HCT116-celler behandlet med BPR0L075 og uttrykket nivåer av SAC-relaterte mitotiske markører som fosfor-Histone H3 (Ser10), cyclin B1, og fosfor-cdc2 (Thr161) ble undersøkt. Disse mitotiske markørene ble indusert i begge securin-villtype og -null HCT116-celler (fig. 3B). Imidlertid er omfanget av SAC-aktivering var lavere i securin-null-celler (fig. 3B). I tillegg ble ekspresjon av fosfo-securin indusert av mer enn 10 nM BPR0L075 i villtype HCT116-celler (fig. 3B), som ble korrelert med økningen av G
2 /M arrest (fig. 2A). Securin er beriket i G2 /M fase og degradert etter mitotisk exit [35]. Konsekvent ble securin uttrykket redusert med 10 nM BPR0L075, hvor G2 /M arrest ble ikke forekommet (Fig. 2A og 3B). Derfor BPR0L075 indusert DNA skade og SAC, som kan bli styrket i nærvær av securin i HCT116 cellene.
BPR0L075 indusert securin fosforylering og påvirket stabiliteten mitotiske regulatoriske molekyler i HCT116 cellene
Det ble bemerket at securin tendens til å bli betydelig band-skiftet etter BPR0L075 behandling i HCT116-celler (fig. 3B). For å utforske hvorvidt den bånd forskyvning av securin var et resultat av dets fosforylering, ble BPR0L075-behandlede proteinekstrakter inkubert med alkalisk fosfatase (AP) og deretter analysert ved hjelp av western blot. Bandet skift av securin ble redusert med AP (fig. 4A), noe som tyder på at BPR0L075 indusert securin fosforylering. For ytterligere å bekrefte dette fenomenet, flere anti-mikrotubulidynamikk legemidler, inkludert kolkisin, paclitaxel, og vinblastin, ble brukt til å indusere mitotisk arrest. Som vist på fig. 4B, behandling med anti-mikrotubul medikamenter også ført til band-skift av securin. Intriguingly, ble en mellomliggende migrerende bånd (som antydet med asterisk) av securin observert i BPR0L075-behandlede celler (Fig. 4B). Siden seks fosforyleringsseter på securin er identifisert [36], kan dette bandet representere et forbigående hypofosforylerte form for securin. Faktisk en
in vitro
securin fosforylering analysen viser to lavere migrasjons bånd av fosforylert securin [37].
(A) Celler ble behandlet med 20 nM BPR0L075 i 24 timer. Cellelysater ble utsatt for alkalisk fosfatase analyse, og nivåene av securin ble bestemt ved Western blot. (B) Celler ble behandlet med 0-80 nM BPR0L075, colchicin, paclitaxel og vinblastin i 24 timer. (C og D) Celler ble behandlet med eller uten MG132 /cykloheksimid i 2 til 24 timer etter 24 timer etter BPR0L075 behandling. Cellelysatene ble underkastet Western blot-analyse ved anvendelse av antistoffer som er spesifikke for cyklin B1, fosfo-H3 (Ser10) og securin.
Stabiliteten av securin avhenger av dets fosforylering tilstand. Hyperfosforylisert former er raskt ødelagt via Skp1 /Cul1 /F-box protein kompleks (SCF) E3 ubiquitin ligase [38]. For å undersøke hvorvidt BPR0L075-induserte fosforylering securin påvirket dets proteinstabilitet, ble cellene behandlet med 20 nM BPR0L075 i 12 timer og deretter gjenvinnes i medium inneholdende enten den proteasominhibitor MG132 eller proteinsynteseinhibitor cykloheksimid (CHX) i 2-24 timer. Det ble funnet at, etter BPR0L075 uttak, den fosforylerte form av securin ble raskt forringet, og tilsetning av MG132 blokkert dens degradering (fig. 4C). I motsetning til dette ble den hypofosforylerte form av securin øket i løpet av celle gjenvinning, som kan bli blokkert av CHX behandling (fig. 4D), noe som tyder på at securin er re-syntetisert etter utvinning fra BPR0L075. Nedbrytningshastigheten for securin var lik som andre mitotiske regulatoriske molekyler inkludert cyclin B1 og fosfor-histon H3 i villtype HCT116-celler (fig. 4C og 4D). Interessant, akkumulering av fosfo-histon H3 var høyere i MG132-behandlede securin-null-celler (fig. 4C), og reduksjon av cyklin B1 og fosfo-histon H3 var lavere i CHX-behandlede securin-null-celler (fig. 4D ). Resultatene viste at BPR0L075 behandling indusert ustabilitet av mitotiske regulatoriske molekyler i nærvær av securin.
BPR0L075 indusert mitotisk katastrofe i HCT116 cellene
Mitotisk katastrofe er en form for celledød under eller etter unormal celledeling [8]. Våre resultater antydet at BPR0L075 indusert fosforylering av securin, som kan destabilisere mitotiske regulatoriske molekyler og dermed fremme mitotisk katastrofe i HCT116 cellene. For å løse denne muligheten, securin-villtype og -null HCT116-celler behandlet med 20 nM BPR0L075 i 12 timer ble gjenvunnet i kulturmedium til 12-96 timer, og cellesyklusprogresjon, og apoptose ble deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri. Resultatene indikerte at, etter BPR0L075 fjerning, G
2 /M-fraksjonen ble redusert og cellesyklusprogresjon ble gjenopptatt i securin-villtype og -null HCT116-celler (fig. 5A). Men nedgang i G
2 /M-fraksjonen i securin-wild-type celler var mer betydningsfulle enn de i securin-null-celler, som ble reflektert av økningen i G
0 /G
1 og S-faseceller i villtype-celler (fig. 5A). I tillegg øker i sub-G
en fraksjon var også høyere i securin-villtype-celler (fig. 5A), noe som tyder på at ekspresjon securin fremmet mitotisk katastrofe i HCT116-celler. Videre ble celle apoptose etter BPR0L075 uttak analysert ved hjelp av annexin V /PI dobbel farging. Konsekvent, ble mer celle apoptose i securin-villtype-celler indusert etter celle-gjenvinning i 24 timer (fig. 5B og 5C).
(A) Celler ble behandlet med 20 nM BPR0L075 i 12 timer og BPR0L075 uttak i 12 til 96 timer. Cellesyklusfordelingen ble bestemt ved flow-cytometri. (B og C) Celler ble behandlet med BPR0L075 i 24 timer og BPR0L075 uttak eller intet uttak i 24 timer. Prosenten av døde celler (Annexin positiv og Annexin /PI dobbel positiv) ble bestemt ved Annexin V-/PI farging. p 0,01 (**) viser en signifikant forskjell mellom BPR0L075-behandlede og ubehandlede prøver. p 0,01 (##) viser en signifikant forskjell mellom securin-villtype og -null HCT116 cellene
BPR0L075 indusert fosforylering av securin, G
2 /M arrest og cytotoksisitet gjennom en. cdc2 (CDK1) -avhengig pathway
Securin fosforyleres av cdc2 (CDK1) [39]. For å undersøke om cdc2 signalering er ansvarlig for BPR0L075-indusert fosforylering av securin, ble effekten av cdc2, CDK og cdc25 spesifikke hemmere (alsterpaullone, purvalanol eller NSC 663 284, henholdsvis) på BPR0L075-indusert fosforylering av securin overvåkes. Fosforylering av securin ble delvis redusert med cdc2 /CDK-hemmere (Fig. 6A). I tillegg viste vi også at hemming av cdc2 eller CDK redusert BPR0L075-indusert G
2 /M arrest og cytotoksisitet i securin-villtype HCT116-celler (fig. 6B og 6C). Disse resultatene tyder på at i respons til BPR0L075 behandling, cdc2 fosforylert securin, noe som fører til høyere G
2 /M arrest og dermed legge til rette for cytotoksisitet av BPR0L075 i HCT116 cellene.
Celler ble forbehandlet med NSC663284, alsterpaullone og purvalanol i 2 timer før eksponering til 20 nM BPR0L075 i 24 timer. (A) Nivåene av securin, fosfo-cdc2 (Thr161), fosfo-H3 (Ser10) og total cdc2 ble analysert ved hjelp av Western blot. (B) Et cellesyklusfordelingen ble bestemt ved flow-cytometri. (C) Et cellenes levedyktighet ble analysert ved MTT-analyse. p 0,01 (**) viser en signifikant forskjell mellom alsterpaullone (0,5 uM), Purvalanol (0,5 uM) og BPR075 (20 nM) alene sammenlignet med kontrollen. p 0,01 (##) viser en signifikant forskjell mellom BPR0L075 alene og forbehandling med alsterpaullone og purvalanol
BPR0L075-indusert celledød gjennom aktivering av JNK og p38 MAPK stier og en caspase-. uavhengig mekanisme i HCT116-celler
i respons på ytre påkjenninger eller skader, celler vanligvis aktiverer JNK og p38 MAPK veier, noe som fører til celledød [40], eller den ERK-reaksjonsveien for overlevelse [41]. Det har blitt rapportert at aktivering av p38 MAPK, eller hemning av ERK er involvert i apoptose indusert av anti-mikrotubuli medikament nocodazol alene eller i kombinasjon med paklitaxel [42], [43]. For å løse rolle MAPK baner i BPR0L075-indusert celledød i securin-villtype HCT116-celler, de aktiveringer av p38 MAPK, JNK og ERK ble analysert ved western blot. P38 MAPK, JNK og ERK banene ble aktivert ved BPR0L075 (Fig. 7A). Spesifikke inhibitorer av p38 MAPK, JNK og ERK (SB2021900, SP600125 og U0126, henholdsvis) blokkerte BPR0L075-indusert aktivering (Fig. 7B og 7C). Imidlertid inhibering av p38 MAPK, JNK og ERK trasé påvirket ikke BPR0L075-indusert fosforylering av securin (Fig. 7B og 7C). I tillegg er kun SP600125 hemmet BPR0L075-indusert fosfo-Histone H3 (fig. 7B).
(A) Celler ble behandlet med 0-80 nM BPR0L075 i 24 timer. Nivåene av fosfor-p38, -JNK1 /2, og -ERK1 /2, og total p38, JNK1 /2 og ERK1 /2 ble bestemt ved Western blot. (B og C) Celler ble forbehandlet med SB202190, SP600125 og U0126 i 2 timer før eksponering til 20 nM BPR0L075 i 24 timer. Nivåene av fosfo-p38, -JNK1 /2, -ERK1 /2, -cdc2 (Thr161), og -H3 (Ser10), og total p38, JNK1 /2, ERK1 /2 og cdc2 ble analysert ved hjelp av Western blot. (D) Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse. (E og F) Celler ble forbehandlet med Z-VAD-FMK i 2 timer og deretter utsatt for 20 nM BPR0L075 i 24 timer. Nivåene av fosfo-p38, -ERK1 /2, og -H3 (Ser10), og total p38, ERK1 /2 og securin ble analysert ved hjelp av Western blot. Cellelevedyktigheten ble analysert ved MTT-analyse. p 0,01 (**) viser en signifikant forskjell mellom BPR0L075-behandlede og ubehandlede prøver. p 0,01 (##) viser en signifikant forskjell mellom BPR0L075 alene og forbehandling med SB202190 og SP600125
Vi videre analysert virkningene av MAPK hemmere på BPR0L075-indusert cytotoksisitet av MTT-analyse.. Behandling med SB202190, SP600125 eller U0126 alene påvirket ikke celleoverlevelse i HCT116-celler (fig. 7D). Dessuten, SB202190 og SP600125 var i stand til å redde celler fra BPR0L075-indusert cytotoksisitet (fig. 7D). Disse resultater indikerer at aktivering av p38 MAPK og JNK-reaksjonsveiene er nødvendig for BPR0L075-indusert celledød i HCT116-celler. For ytterligere å undersøke hvorvidt caspaseaktivering er involvert i BPR0L075-indusert celledød, ble cellelevedyktigheten av celler forbehandlet med pan kaspase-inhibitor, z-VAD-FMK, kombinert med BPR0L075 behandling analysert ved MTT-analyse. Vi fant at hemming av caspase ikke påvirke cellenes levedyktighet etter BPR0L075 behandling (fig. 7E). Videre BPR0L075-indusert aktivering av p38 MAPK og ERK veier, samt fosforylering av securin og Histone H3, ikke ble påvirket. Disse resultatene antyder at BPR0L075 indusert celledød gjennom en caspase-uavhengig sti i HCT116 cellene.
Diskusjoner
Securin, et onkogen, er overuttrykt i ulike kreftceller og er ansvarlig for å fremme celledeling og tumorigenesis [24], [25]. Tidligere er det blitt rapportert at securin nivåer er nedregulert i HCT116 celledød indusert av kjemoterapeutiske medikamenter [26], [44], som tyder på at det kan være et mål for cancerterapi. I denne studien fant vi at cytotoksisitet av anti-microtubule narkotika BPR0L075 var positivt korrelert med uttrykket nivåer av securin i ulike kreftceller. Securin ble fosforylert ved behandling med BPR0L075 så vel som andre anti-mikrotubul legemidler innbefattende colchicines, paclitaxel, og vinblastin, i HCT116-celler. Oppbyggingen av fosforylert securin ble ledsaget av høyere G2 /M arrest og cytotoksisitet. Fosforylering av securin videre fører til destabilisering og deretter fremmer mitotisk exit og mitotisk katastrofe av HCT116-celler. Derfor foreslår vi at securin er et viktig mål for kreft effekter av BPR0L075 i menneskelige kolorektal kreftceller.
Mitotisk katastrofe kan være forårsaket av medisiner som er rettet mot mikrotubuli eller påvirke utviklingen av mitose [8], [9 ]. Mange ulike celle skjebner kan være forårsaket av mitotisk katastrofe. Først kan cellene dør uten mitotisk exit. For det andre, etter mitotisk utgang og nådde av G1 fase, cellene gjennomgå celledød eller senescens [12]. Det har blitt rapportert at docetaxel, et mikrotubulus-stabiliserende middel, induserer celledød gjennom mitotisk katastrofe i humane brystcancerceller [14]. Videre, en annen microtubule-stabilisator, combretastatin-A4 prodrug (CA4P) induserer mitotisk katastrofe etter mitotisk arrest i kronisk lymfatisk leukemi celler [13]. Våre resultater viser at BPR0L075 induserte mer omfattende celledød etter medikamenttilbaketrekning i securin-villtype HCT116-celler enn i securin-null-celler. I tillegg fersk studie viste at langvarig mitotisk arrest indusert av anti-mikrotubulidynamikk legemidler kan føre til mer celledød [45]. Videre har vi funnet at BPR0L075 behandling i 12 til 24 timer induserte mer celledød etter uttak av BPR0L075 sammenlignet med behandling i 4 eller 8 timer (data ikke vist). Disse funnene tyder på at BPR0L075 indusert mitotisk katastrofe gjennom induksjon av langvarig mitotisk arrest i menneskelige kolorektal kreftceller.
nocodazol behandling induserer mitotisk arrest og fosforylering av securin i HCT116 og U2OS celler [46]. Konsekvent, i denne studien fant vi at BPR0L075 og andre anti-mikrotubulidynamikk narkotika indusert securin fosforylering i HCT116 cellene. Det har blitt rapportert at securin blir fosforylert av cdc2 (CDK1) [39]. MAPK kinase induserer også securin fosforylering og regulerer trans funksjon [47]. I respons til DNA-skade, er securin fosforylert av DNA-PK (DNA-avhengig protein kinase), som bidrar til blokkering av søster kromatin atskillelse [17], [48]. Som vist av resultatene, BPR0L075-indusert fosforylering av securin var bare delvis inhibert av cdc2 /CDK spesifikk inhibitor. Resultatene viste at BPR0L075 indusert securin fosforylering dels gjennom cdc2 aktivering. Derfor kan det være andre kinaser som induserer fosforylering av securin. Men BPR0L075-indusert aktivering av MAPK kinaser ble ikke involvert i fosforylering av securin. Derfor foreslår vi at BPR0L075 induserer celledød gjennom p38 MAPK og JNK-reaksjonsveiene, som er uavhengig av fosforylering av securin.
Securin har blitt rapportert til å interagere med den DNA-reparasjon protein Ku70. Når cellene lider DNA-skader, phosphorylates DNA-PK securin å utløse cellesyklus arrest. Deretter blir interaksjonen av securin og Ku70 trykt, og dermed frigjøre Ku70 for å fremme DNA-reparasjon [17], [48]. I kontrast, securin overekspresjon kan forsinke mitose progresjon og søsterkromatidutveksling separasjon under DNA-skader gjennom hemming av Ku70 [48]. I vår studie, BPR0L075 indusert høyere G
2 /M arrest i securin-villtype HCT116-celler enn i securin-null-celler, noe som tyder på at en større reparasjon evne og forhøyet sjekkpunkt aktivering ble utløst i nærvær av securin, som kan resultatet fra fosforylering og destabilisering av securin ved BPR0L075.
Ekspresjon av securin har blitt funnet i forskjellige cancere å være korrelert med en dårlig klinisk resultat [49], [50]. I denne studien fant vi at BPR0L075 indusert DNA skade og modulert mitotiske regulatoriske molekyler for å aktivere spindelenheten sjekkpunkt i HCT116 cellene. Etter BPR0L075 uttak, celler av G
2 /M-fraksjon gikk mitotisk katastrofe, som ble forsterket av fosforylering og destabilisering av securin. Videre BPR0L075 forårsaket celledød gjennom en caspase-uavhengig mekanisme og aktivering av JNK og p38 MAPK banene (fig. 8). Disse resultatene gitt bevis for første gang at BPR0L075 behandling er fordelaktig for behandling av humane kolorektale tumorer med høyere nivåer av securin. Som BPR0L075 ble godkjent av det amerikanske FDA for fase en klinisk studie i 2010, kunne uttrykket nivåer av securin være en prediktiv faktor for å avgjøre prioritering av anti-kreft behandling ved hjelp BPR0L075 i humane kreftceller. Våre resultater viser også at targeting securin kan være en egnet strategi for å utvide klinisk bruk av BPR0L075 for ulike kreftformer overekspresjon securin.
BPR0L075 indusert DNA skade, som fører til Chk1 /Chk2 aktivering, hemming av Cdk1 aktivitet og G2 arrest . Det er også modulert Cdk1-avhengig fosforylering av mitotiske regulatoriske molekyler for å aktivere spindelenheten sjekkpunktet, som ble svekket i nærvær av securin. Etter BPR0L075 uttak, celler av G
2 /M-fraksjon gikk mitotisk katastrofe, som ble forsterket av fosforylering og destabilisering av securin. Videre BPR0L075 forårsaket celledød gjennom en caspase-uavhengig mekanisme og aktivering av JNK og p38 MAPK trasé.
Materialer og metoder
Material
Forbindelsen BPR0L075 var syntetisert ved Divisjon for bioteknologi og farmasøytisk forskning, National Health Research Institutes, Zhuman, Taiwan, ROC. BPR0L075, et hvitt faststoff, ble erholdt i et 72% utbytte fra 6-metoksyindol og 3,4,5-trimetoksybenzoylklorid og ble oppløst i dimetylsulfoksyd. Propidiumjodid (PI, p4170), 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5- difenyltetrazoliumbromid (MTT; M5655), colchicines (C9754) og purvalanol (P4484) ble kjøpt fra Sigma Chemical Co. antistoffer som er spesifikke til ERK (C14), p38a (C-20) og JNK (C-17) ble anskaffet fra Santa Cruz Biotechnology. Anti-fosfor-Histone H2A.X (Ser139) (# 05-636) og fosfor-Histone H3 (Ser10) (# 05-806) antistoffer ble kjøpt fra Upstate. Anti-securin (ab-3305) antistoff ble kjøpt fra Abcam. Anti-cdc2 (Ab-1) antistoff ble kjøpt fra onkogen Sciences Products. Anti-aktin (MAB1501) antistoff ble kjøpt fra Chemicon International. Fosfor-cdc2 (Thr161) (# 9114), fosfor-chk1 (Ser345) (# 2341), fosfor-chk2 (Thr68) (# 2661), fosfor-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) (# 9251), fosfo ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) (# 9106), fosfor-p38 MAP kinase (Thr180 /Tyr182) (# 9211), chk1 (# 2345), og chk2 (# 2662) antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology. Cyklin B1 (Ab-2) og p21 (Ab-1) antistoff, NSC663284 (# 217692), alsterpaullone (# 126870), MG132 (# 474790), cykloheksimid (CHX; # 2379763), SB202190 (# 559388), SP600125 ( # 420119) og U0126 (# 662005) ble kjøpt fra Calbiochem.
Cell kultur
Securin-villtype og securin-null menneskelige HCT116 kolorektal kreft cellelinjer [27], MCF-7 og MDA-MB-231 humane brystkreftcellelinjer [51], og MDA-MD-435 humane melanoma cellelinjer [52] var gaver fra Dr. Ji-Hshiung Chen (Institutt for molekylærbiologi og human Genetics, Tzu Chiu University, Taiwan). Securin-villtype og securin-null menneskelige HCT116 kolorektal kreft celler ble rutinemessig opprettholdt i McCoy’5A medium (Sigma, M4892). MCF-7 og MDA-MB-231 humane brystcancerceller ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM; GIBCO, 12800-058). A549 human lungekreft cellelinje [53] (gaver fra Dr. Lih-Yuan Lin, Institutt for Life Science, National Tsing Hua University, Taiwan) ble opprettholdt i RPMI 1640 medium (GIBCO, 23400-021). Den komplette medium ble supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS). Usynkroniserte celler ble anvendt i denne studien.
Celleviabilitet assay
Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT kolorimetrisk analyse. I korthet ble cellene sådd ut ved en tetthet på 5000-10000 celler per brønn i 96-brønners plater i 16-24 timer. Ved slutten av BPR0L075 behandling ble cellene vasket med fosfatbufret saltløsning (PBS) og ble re-dyrket i kulturmedium i 2-3 dager. Deretter ble mediet erstattet med et nytt medium supplert med 0,5 mg /ml MTT og inkubert i 4 timer.
