Abstract
Bakgrunn
Det er en stor klinisk utfordring å forutsi hvilke pasienter med avansert stadium hode og hals plateepitelkarsinom, vil ikke vise en reduksjon i tumorstørrelse etter kjemoterapien for å unngå toksiske effekter av ineffektiv kjemoterapi og forsinkelser for å iverksette andre behandlingsalternativer. Videre er det av interesse å vite i hvilken grad et gen signatur som identifiserer pasienter med svulster som ikke vil svare på en bestemt induksjonskjemoterapi, gjelder når flere kjemoterapeutika er lagt til diett.
Metodikk /hovedfunnene
for å identifisere gener som predikerer svulst motstand mot induksjon med cisplatin /5-fluorouracil (PF) eller PF og et taxan, vi analyserte pasient tumor biopsier med hele genomet mikromatriser og kvantitativ revers transkriptase-PCR (TLDA) kort. En permisjon en ut kryssvalidering prosedyre tillatt evaluering av prediksjon verktøyet. En ti-genet microarray signatur riktig klassifisert 12/13 respondere og 7/10 ikke-respondere til PF (92% spesifisitet, 82,6% nøyaktighet). TLDA analyse (med samme klassifikator) av pasientene korrekt klassifisert 12/12 respondere og 8/10 ikke-respondere (100% spesifisitet 90,9% nøyaktighet). Videre TLDA analyse korrekt spådd responsen av 5 nye pasienter og totalt 12/12 respondere og 13/15 ikke-respondere (100% spesifisitet 92,6% nøyaktighet). Protein produktene av genene som utgjør signaturen fysisk kan assosiere med 27 andre proteiner, som er involvert i reguleringen av genekspresjon, som utgjør en interaksjon nettverk. I kontrast, TLDA-basert prediksjon (med samme genet signatur) av svar til induksjon med PF og en av to taxaner var dårlig (0% spesifisitet, 25% nøyaktighet og 33,3% spesifisitet, 25% nøyaktighet).
Konklusjon /Betydning
vellykket overføring av microarray-baserte gen signatur til en uavhengig, PCR-basert teknologi antyder at TLDA-baserte signaturer kan være et nyttig sykehus-basert teknologi for å bestemme behandlingsalternativer. Selv om meget spesifikt for tumorrespons til PF induksjon, er genet signatur mislykket når taxaner tilsettes. Resultatene illustrerer finesse i å utvikle «personlig medisin»
Citation. Tomkiewicz C, Hans S, Mucchielli MH, AGIER N, Delacroix H, Marisa L, et al. (2012) En hode og nakke kreft Tumor Response-Specific Gene Signatur for Cisplatin, 5-fluorouracil induksjonskjemoterapi Svikter med Lagd taxaner. PLoS ONE 7 (10): e47170. doi: 10,1371 /journal.pone.0047170
Redaktør: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 12. mai 2012; Godkjent: 10 september 2012; Publisert: 09.10.2012
Copyright: © Tomkiewicz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av CNRS (The Centre National de la Recherche Scientifique), INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE), Assitance Publique-Hôpitaux de Paris (CRC03017), Paris Descartes University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) er den sjette hyppigste kreft hele verden [1]. I Frankrike ble over 20.000 nye tilfeller og ca 6000 dødsfall rapportert i 2003 og fem-års overlevelse er fortsatt lav (50%). Behandlingsstrategier for avansert hode- og nakkekreft har endret seg de siste 30 årene. Strategier i dag, spesielt for strupehodet, Oro- og hypopharyngeal kreft, er fokusert på kirurgiske og ikke-kirurgiske prosedyrer som bevarer en funksjonell organ. [2].
Historisk to kliniske studier, fra Department of Veterans Affairs (DVA) Strupekreft Study Group [3] og strålebehandling Oncology Group (RTOG) 91-11 [4], har påvirket behandling av avansert strupekreft. Den DVA studien [3] var den første til å fremme organ vernestrategi og for å bevise at pasienten overlevelse etter neoadjuvant eller induksjonskjemoterapi (cisplatin og 5-fluoruracil) etterfulgt av strålebehandling var nesten identisk med den etter total laryngectomy og postoperativ strålebehandling.
Men bruken og nytten av kjemoterapi forble gjenstand for debatt etter en meta-analyse i 2000 av 63 studier mellom 1965 og 1993, som viste at kjemoterapi på ikke-metastatisk hode og hals plateepitelkarsinom i 10,741 pasienter med karsinom i orofarynx, munnhule, svelg eller hypopharynx ga bare en liten signifikant overlevelsesgevinst ved samtidig chemoradiation terapi [5].
i 2007, en Eastern Cooperative Oncology Group fase II multisenterstudie [6] rapportert en høy organ bevaring hastighet med taxan-basert kjemoterapi i munnhule og svelg kreft, men ikke for strupekreft. To kliniske studier [7], [8] ble utgitt i 2007, som sammenlignet en mer intensiv induksjons kjemoterapi; docetaxel ble tilsatt til den konvensjonelle cisplatin /5-fluoruracil diett. Sekvensiell behandling med induksjon docetaxel, cisplatin og 5-fluoruracil (TPF) betydelig forbedret overlevelse og progresjonsfri overlevelse versus cisplatin og 5-fluoruracil (PF) i lokalt avansert strupehodet, Oro- og hypopharyngeal kreft [7] antyder bruk av sekvensiell TPF etterfulgt av karboplatin chemo-stråling som et behandlingsalternativ for organbevaring og for å bedre overlevelse i lokalt avansert strupehodet, Oro- og hypopharyngeal kreft. Den europeiske TAX 323 studiegruppen [8] sammenlignet TPF med PF som induksjonskjemoterapi hos pasienter med locoregionally avansert, inoperabel sykdom og viste at median progresjonsfri overlevelse var 11,0 måneder i TPF gruppe i forhold til 8,2 måneder i PF-gruppen. Selv tillegg av taxan docetaxol til cisplatin /5-fluorouracil induksjonskjemoterapi forbedrer klinisk respons og overlevelse sammenlignet med cisplatin /5-fluorouracil alene eller cisplatin /5-fluorouracil kombinert med strålebehandling, kan det ha en høyere forekomst av uønskede hematologiske hendelser (nøytropeni og relaterte komplikasjoner) [9]. Likevel, om lag 30% av pasientene viser enten ingen forbedring eller forverring av sin tilstand etter induksjon. Det er derfor en stor klinisk utfordring å forutsi hvilke pasienter som ikke kan benytte seg av induksjonskjemoterapi i) for å unngå toksiske effekter av ineffektiv kjemoterapi; ii) for å unngå forsinkelser for andre terapeutiske muligheter, og iii) for å minimalisere kostnadene ved behandlingen.
Tidligere undersøkelser av responsen til induksjons kjemoterapi i HNSCC viste at forskjeller i de genotyper av forskjellige enzymer er assosiert med variasjoner i respons til cisplatin-basert induksjonskjemoterapi [10]. Cyklin A-ekspresjon i HNSCC spådd en bedre respons på cisplatin /5-fluorouracil kjemoterapi [11]. Dessuten ble bedre overlevelsesindekser for pasienter funnet når ekspresjonen av laminin og syndecan-1 endres i respons på kjemoterapi [12]. Men alle disse studier fokuserer på bare en eller noen få gener. Microarray-baserte genuttrykk profilering av hode og nakke kreft har blitt brukt hovedsakelig for klassifisering av svulster eller å forutsi fjernmetastaser eller utfall [13] – [15]. Selv om gen-uttrykk analyser har vurdert respons på preoperativ kjemoterapi-stråling [16] eller kjemoterapien med 5-fluorouracil, cisplatin og adriamycin [17] i hode- og halskreft, har ingen genome-wide mikromatrisestudie adressert cisplatin /5-fluorouracil induksjonsbehandling. I denne studien bruker genome-wide microarray analyse, forsøkte vi å identifisere gener som var prediktiv av en svulst respons på kjemoterapien med cisplatin /5-fluorouracil. Vi videre søkt å finne ut i hvilken grad dette genet signaturen var aktuelt når flere kjemoterapeutika (cisplatin /5-fluorouracil og et taxan-docetaxel eller paklitaxel) ble lagt til behandlingsregime.
Metoder
pasienter og induksjonskjemoterapi
Mellom 2002 og 2007, pasienter med histologisk påvist i munnhule og svelg carcinoma uten tidligere historie med kreft eller flere kreft steder og mangler kontraindikasjon for cisplatin-basert kjemoterapi var inkludert i studien på Georges Pompidou European Hospital (HEGP), Paris. Pasientene, som alle hadde avansert (stadium 3 eller 4) kreft, fikk enten PF (100 mg /m
2 cisplatin Day (D) 1 og 1 g /m
2 5-FU D1-D5) eller TPF (enten carboplatine (paraplatine) -AUC5 D1 (der AUC er arealet under kurven, en formel som tillater beregning av dosen ved å tilpasse det til verdien av kreatinin clearance) og 175 mg /m
2 paclitaxel D1 (T1PF) eller PF pluss docetaxel: 75 mg /m
2 cisplatin D1, 75 mg /m
2 docetaxel D1, og 750 mg /m
2 5-FU som en kontinuerlig perfusjon D1-D5 ( T2PF) induksjonskjemoterapi. Et gjennomsnitt på 3 kurs (range 2-5) ble gitt med 14-21 dagers mellomrom mellom kurs og doseringen ble justert for å ta hensyn til individuell toleranse og respons. pasientene ble evaluert av Head and Neck tumor styret i HEGP (sammensatt av hode og nakke spesialister, radiologer og patologer). Vi studerte pasientene i to av de fire gruppene i ECOG klassifiseringen [18], for å ha to grupper som var den mest «klinisk» annerledes . Responsen ble definert av både klinisk og radiologisk undersøkelse; fullstendige kliniske respondere (CCR) viste mer enn 90% reduksjon av tumorstørrelsen, mens den ikke-responder gruppe (NR) viste mindre enn 50% reduksjon i tumorstørrelse eller progresjon av sykdommen.
HMS-NR og HMS CCR tilsvarer hematoxylin-eosin-safran farging av representative non-responder og komplette kliniske responder personer, henholdsvis, og IHC-p16 og HIS-onkogene HPV tilsvarer representant positiv immunhistokjemi for p16 antigen (brune flekker ) og hybridisering
in situ
for onkogene HPV DNA (blå punktat nukleær farging), henholdsvis. Baren representerer 40 mikrometer i øvre paneler og 20 mikrometer i de nedre panelene.
Etikk
Studiet ble godkjent av etisk komité (CCPPRB Paris-Broussais-HEGP N ° 2002-035) og adlød fransk biomedisinsk forskning lovgivning. Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle deltakerne.
Prøvetaking, histologi og virologi
For diagnostiske formål, ble tumorprøver innhentet under endoskopi i narkose før eventuell behandling. Hver tumorbiopsi ble umiddelbart satt i RNAlater (Ambion) for å unngå degradering av RNA. Biopsi ble kuttet i 2 deler, en for patologisk undersøkelse, og den andre ble umiddelbart frosset ved -80 ° C inntil videre prosessering for RNA-ekstraksjon. Formalinfiksert, ble parafininnstøpte vevsblokker anvendt for fremstilling av objektglass for 1) hematoxylin-eosin-safran (HES) farging for vurdering av tumorstatus og prosent av tumorceller i biopsi, 2) immunhistokjemisk farging for p16-antigenet og 3)
in situ-hybridisering ved anvendelse av
INFORM HPV (human papillomavirus) III Familie 16 Probe (B) kit for å detektere hoved HPV DNA-onkogene typer 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 (Roche Diagnostics, Frankrike). Farging ble utført ved hjelp av referanse Clyde ULTRA Ventana Roche apparat. Produsentenes protokollene ble brukt. HPV-status kan ikke fastslås for en CCR enkelte av PF behandlede gruppen. Histologisk analyser fastslått at alle svulstene var plateepitelkarsinom (Figur 1 viser representative HMS farging av biopsier fra NR og CCR personer). NR og CCR grupper utstilt lignende samlede omfang av tumor differensiering og prosent av svulst cellularity.
10-genet klassifiserer klart skiller medlemmer av NR (blå kuler) og CCR (røde kuler) grupper. 82-83 prosent av variasjonen som finnes i disse tre første dimensjonene.
Utarbeidelse og vurdering av RNA Quality
«Tripure isolasjon reagent» (Roche) ble brukt til å trekke RNA fra biopsi. I korte trekk ble biopsi (mindre enn 100 mg) ble homogenisert i 1 ml Tripure med 3 sterile wolfram perler i en Retsch MM20 Mixer Mill (3 min sliping ved hastighet 29, 3 ganger). Etter tilsetning av to hundre ul av kloroform, ble røret ristet kraftig ved romtemperatur i minst 5 min og tillatt å stå i ytterligere 5 minutter før sentrifugering (15 minutter, 12500 rpm, 4 ° C). Det vandige øvre lag, inneholdende RNA ble oppsamlet. Etter tilsetning av 500 ul isopropanol, og inkubering ved -20 ° C i 10 minutter, ble RNA-pelletert ved sentrifugering (15 minutter, 12500 rpm, 4 ° C). Pelleten ble vasket med 1 ml 75% etanol, sentrifugert som beskrevet ovenfor og tørket ved romtemperatur i 10 min. Total RNA ble resuspendert i 40 ul RNase-fritt vann. RNA ble ytterligere renset med RNase-fri DNase sett (Qiagen) og RNeasy minielute opprydding (Qiagen) ifølge produsentens protokoll. RNA ble kvantifisert ved hjelp av en Nanodrop ND-1000 spektrofotometer og kvaliteten ble vurdert ved elektroforese ved hjelp av en BioAnalyzer (Agilent).
Merking og rensing av sonder
For microarray studier, totalt 23 prøver og en universell RNA referanse, bestående av RNA fra 10 forskjellige humane vev (Clontech), ble brukt til å syntetisere merket cRNA. Kort, 200-300 ng total RNA ekstrahert fra biopsier eller fra RNA referansen ble merket ved hjelp cyanine3-CTP eller cyanine5-CTP og «Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification Kit» (Agilent), i henhold til produsentens instruksjoner. De fluorescerende prober ble renset (Rensing RNeasy Mini Kit, Qiagen), og konsentrasjonen av sondene og nivået av inkorporering av farvestoffene i de probene ble målt (Nanodrop D-1000 spektrofotometer). Agaroseelektroforese av de merkede prober (1,2% agarosegel i 0,5 x TBE) utført på et objektglass sammen med DNA-markører (100 bp, Biolabs) ble utført, og fluorescensen av gelen ble vurdert i en Genetac IV scanner (Perkin-Elmer ). Både intensiteten av signalet og profilen av prøvene indikerte kvaliteten på merking.
Hybridisering og vasking av mikromatriser
Probene (1 pg hver av en biopsiprøve og av referanse , direkte design) ble deretter hybridisert til en pan-genomisk human 44K mikromatriser (Agilent) som inneholder 41.000 prober, tilsvarende gener eller uttrykt sekvens koder ved hjelp av Agilent 60-mer oligo microarray behandling protokollen (Agilent). Hybridisering ble utført i 17 timer ved 60 ° C med rotasjon i en ovn hybridisering (Agilent) som beskrevet av fabrikanten. De mikromatriser ble vasket som beskrevet i produsentens protokoll og tørkes umiddelbart i en speed-vac sentrifuger i 2 minutter.
Array Scanning og bildebehandling
mikromatriser ble skannet med en Axon 4000B scanner ( Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) ved 5 mikrometer oppløsning. PMT-spenninger ble automatisk justert for å balansere fordelingen av de røde og grønne intensiteter og å optimere dynamikken i bildet kvantifisering. Hastigheten av mettede bildeelementer var begrenset til 0,01%. De resulterende 16 bits bilder ble analysert og kvantifisering av signalene på arrays ble utført ved hjelp GenePix Pro 6.0-programvare (Axon Instruments, Union City, CA). Segmentering ble beregnet med den «adaptive krets» metode for behandling. Bakgrunn ble ikke trukket, og ikke funnet, mettet og dårlige flekker ble forkastet. Intra-matrise normalisering (unntatt kontrollplasser, 2.615 prober) ble utført ved hjelp av løss metoden med en 0,5 span parameter.
Statistical Analysis
gener differensielt uttrykt mellom SKR og NR i microarray studien var identifisert av en mutivariable permutasjon test kontrollere den falske funnrate (en moderert t-test med justering av p-verdier [19] med mango programvare [20]. Gener ble valgt som signifikant forskjellig uttrykt når p-verdien var mindre enn 0,025 , den midlere ganger endring (folden endringen mellom hjelp av normaliserte signaler på de 13 fullstendige kliniske respondere og av de 10 ikke-respondere) som er større enn 1,3 i absolutt verdi og midlere intensitet (log
2 (Cy5 * Cy3) /2) som er større enn 7. Hvert gen har minst en verdi mellom de to middelverdier av log
2 (NR /ref) og log
2 (CCR /ref) er større enn 0,4 i absolutt verdi, og i det minste en verdi mellom de to standardavvik av log
2 (NR /ref) og logg
2 (CCR /ref) mindre enn 0,5. Videre er det minimal bedring mellom CCR og NR (|mean(log
2(NR/ref))–mean(log
2(CCR/ref))|–[SD(log
2(NR/ref))+SD(log
2(CCR/ref))]) −0.55.
A klassifikator, å forutsi respons på kjemoterapi av fremtidige pasienter fra de utvalgte som uttrykt forskjellig gener, ble utviklet med en veiledet prediksjonsmetode (Support Vector Machines med lineær kjerne, SVM) [21], [22] med BRB Array Tools versjon 4.1. 0 utviklet av Dr. Richard Simon og BRB Array Tools Development team [23]. Klassifikator ble evaluert [23], [24] ved å bruke en leave-one-out kryssvalidering (LOOCV) prosedyre. Flerdimensjonal skalering (euklidske avstander) ble utført med SMACOF algoritme [25] og Kruskal stresset formel [26]. Den kryssvalidering trinnet kan også betegnelsen, blant genene valgt, av de som gir de beste scorene til prediksjon. Det er disse gener hvis signaturen vil bli brukt til å bestemme respons på kjemoterapi. ROC kurven analyse ble utført med data analyse og grafer programvarepakke Sigma Plot 11. Sammenligning av de kliniske biologiske karakteristika av NR og CCR-grupper ble gjort ved hjelp av t-test eller Mann-Whitney-statistikken når det passer.
revers transkripsjon av RNA for PCR-analyse
cDNA ble fremstillet fra 200 ng RNA med høy kapasitet cDNA Arkiv kit (Applied Biosystems). For å sammenligne nivået av mRNA i de ulike biopsier, ble de samme universelle RNA referansen som brukes som at i de mikromatriser.
Taqman Low Density Array (TLDA) -quantitative RT-PCR
førti-tre biopsier fra pasienter behandlet med PF (22 av de 23 biopsier som ble analysert med mikromatriser (det var utilstrekkelig RNA fra en av de opprinnelige pasientene som skal brukes i den TLDA studien), pluss fem ytterligere biopsier fra pasienter som har mottatt den samme PF induksjonsbehandling), ble 8 biopsier fra pasienter behandlet med T1PF og 8 biopsier fra pasienter behandlet med T2PF brukt i TLDA studien. Kvantitativ RT-PCR ble utført med TaqMan lav tetthet array-kort. Pre-designet Taqman sonde og primersett for klassifikator målgener (basert på microarray resultater) var fabrikk lastet inn i 384 godt utvalg. Matrisen formatet ble tilpasset på linje med 2 gjentak per klassifiserer target genet. CDNA-prøvene ble analysert ved bruk av en ABI Prism 7900HT apparat i henhold til produsentens instruksjoner. Kort beskrevet, ble hver prøve cDNA (100 ng i 25 mL) kombinert med 25 mL vann og tilsatt til et likt volum 2X Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Blandingene (100 ul) ble injisert inn i en lastehavn av TLDA. For hver TLDA, ble cDNA fra Clontech universell referanse brukes parallelt med syv av prøvene for å evaluere reproduserbarheten av forsøkene. Matrisen ble sentrifugert to ganger for å fordele prøvene i brønnene. Kortet ble forseglet og amplifikasjon ble utført som følger: 2 minutter ved 50 ° C (aktivering av uracil-DNA-glykosylase), 10 min ved 94,5 ° C (aktivering), 40 sykluser med denaturering ved 97 ° C i 30 sekunder og ett min ved 59,7 ° C (annealing og forlengelse). Genekspresjon verdier ble beregnet basert på terskelen syklus (Ct) -metoden, som bruker formel 2
-ΔΔCt å beregne ekspresjon av målgener normalisert til en kalibrator (Clontech universal referanse). I korte trekk ble den C
t data for alle de mål gener og GAPDH-genet i hver prøve som brukes for å lage A C
t. Deretter ΔΔC
t-verdier ble beregnet ved å trekke den A C
t av kalibrator fra A C
t av prøven. De relative mengder (RQ) ble bestemt ved hjelp av ligningen RQ = 2
-ΔΔCt. Prøve verdier ble uttrykt i forhold til kalibratoren prøven
Analyse av Protein-protein interaksjoner
Manuell avhør av databaser (PSIQUIC View:. https://www.ebi.ac.uk/Tools /webservices/psicquic/view/main.html, MINT: https://www.mint.bio.uniroma2.it/mint/; InnateDB: https://ww.innatedb.com; intakt: http: //www. ebi.ac.uk/Databases; BioGrid: https://www.thebiogrid.org og Biolink Explorer: https://www.diatomsoftware.com/biolink/) ble utført for å identifisere protein interactors som for som var det eksperimentelle bevis for direkte fysisk tilknytning til proteiner kodet av gener av signaturen. Deretter ble eksperimentelle bevis søkes i samme databaser for tegn på en direkte sammenheng mellom interactors. Den resulterende nettverket ble visualisert i Cytoscape. https://www.cytoscape.org/
Resultater
Kliniske Kjennetegn og Response to induksjonskjemoterapi
Totalt 44 mann pasienter ble inkludert (tabell 1). Kvinner ble ekskludert fordi etiologi for HNSCC kan være forskjellig fra den som hos menn. Blant de kliniske karakteristika (tabell 1 og 2) av pasientene som ble behandlet med bare PF i mikromatrise studien, bare HPV-status og sigaretter per dag var signifikant forskjellig (p = 0,03 og 0,05, henholdsvis) mellom de to gruppene (CCR gruppe utstilt mer HPV positivitet og røkt mer). Blant pasientene i TLDA studien, var det ingen signifikante forskjeller i kliniske kjennetegn ved NR og CCR. NR og CCR ble jevnt fordelt blant de 8 pasienter behandlet med PF og paclitaxel (T1PF), mens 6 av de 8 pasientene som ble behandlet med PF og docetaxel (T2PF) var CCR (tabell 3). Diskriminant analyse av ensemblet av pasientene med alder, tumorstadium, forbruk av sigaretter og alkohol, og nivåer av hemoglobin ikke forutsi respons på kjemoterapi (prediktiv scorer mindre enn 70%).
En Gene Signatur for Response til Cisplatin /5-fluorouracil Induksjon
Ved hjelp av microarray resultater fra biopsier av de 23 pasientene som ble behandlet med PF (GEO database: GSE32877), en ti-gen signatur (tabell 4) for respons på behandlingen var utledet. Receiver Operating karakteristiske kurver (ROC kurver) for hver av de ti gener viste sin betydning for klassifisering av ikke-respons på kjemoterapi (Tall S1 og S2). Dette klassifiserings korrekt klassifisert tolv av tretten CCR og 7 av de 10 NR (92% spesifisitet, 70% sensitivitet, total nøyaktighet på 82,6%, tabell 5). Klassifikator ble brukt, da, for å designe TaqMan Low Density Arrays (TLDA), teknisk lettere tilpasses sykehusbaserte analyser enn mikromatriseteknologi.
TLDA som inneholder 10-genet microarray-avledet klassifikator ble brukt å utføre kvantitativ RT-PCR på totalt 43 biopsier (tabell 1 og 3 og Tabell S1). Av de 22 pasientene som ble behandlet med PF bare, som var i microarray studien, 12 av 12 CCR og 8 av 10 NR ble riktig klassifisert av TLDA hjelp av klassifiserings (100% spesifisitet 80% sensitivitet og 90,9% samlet nøyaktighet og figur S2) . TLDA analyse også korrekt spådd responsen av alle 5 nye pasienter behandlet med PF og yttertøy (for de 27 pasientene som ble behandlet med PF bare), korrekt klassifisert 12 av 12 CCR og 13 av 15 NR (100% spesifisitet 86,7% sensitivitet og 92,6 % totalt nøyaktighet) (tabell 5 og figur S2). Flerdimensjonal skalering (3D) viser at beskrivelsene av sorter klart skille kontrollrom og NR personer i to grupper basert på microarray (MA) og TLDA data (figur 2). Selv om HPV status av individer ble funnet å være forskjellig mellom kontrollrom og NR-grupper (22 pasienter), tilsetning av HPV status til den 10-genet signaturen forbedret ikke prediksjoner for TLDA analyse og faktisk feilidentifisert en av de 5 nye pasienter ( ROC-kurven er vist i figur S2). Det var ingen signifikant forskjell i HPV status av individer i 27 pasienten CCR og NR-grupper. Interessant nok var eksperimentelle bevis finnes i flere databaser for direkte fysisk interaksjon mellom proteinprodukter av genene til den 10-genet signatur og andre Interactor proteiner som danner et nettverk (Figur S3 og tabell S2).
The Signature er spesielt for induksjon kjemoterapi
for å bestemme sin spesifisitet til stoffet diett, undersøkte vi resultatene av klassifikator i 16 flere pasienter som ble behandlet med enten paclitaxel eller docetaxel pluss PF (T1PF og T2PF henholdsvis tabell 1 og 3). Ved hjelp av TLDA resultatene oppnådd med biopsier fra pasienter behandlet med enten T1PF eller T2PF, klassifikator dårlig forutsagte responsen på kjemoterapeutiske induksjon (0% spesifisitet, 50% sensitivitet, 25% nøyaktighet og 33,3% spesifisitet, 0% sensitivitet, 25% nøyaktighet, henholdsvis tabell 5). For T1PF induksjon, klassifikator identifisert bare 2 av 4 NR riktig og 0 av 4 CCR. Ingen av de to NR ble korrekt identifisert i tilfelle av T2PF induksjon og bare 2 av 6 CCR ble identifisert.
Diskusjon
Orofaryngeal plateepitelkarsinom (spesielt på undersiden av tungen og mandel) representerer 35-40% av hode og nakke kreft i Frankrike (4000 saker /år) og deres forekomst har økt i vestlige land i løpet av det siste tiåret. Her studerte vi avansert stadium kreft i orofarynx fordi de er de mest hyppige og tillater rekruttering av et tilstrekkelig antall pasienter for å sammenligne fullstendige kliniske reagerer med ikke-respondere for induksjonskjemoterapi.
Siden ingen sammenheng ble funnet mellom de kliniske egenskaper og respons på kjemoterapi, er et gen signatur relevant. Denne studien er den første til å ansette hele genomet transkriptomet analyse av tumor biopsier for å identifisere et sett av gener prediktiv spesielt for tumorrespons til PF induksjonskjemoterapi for HNSCC pasienter og for å transponere det genet signatur til en teknologi (TLDA) som kan være egnet for sykehusbasert bruk. Bestemmelse av denne signaturen var betinget av bruken av en homogen undergruppe av mannlige pasienter som hadde identiske lokaliseringer av deres kreft og som tilhørte den ene eller den andre av de to ekstreme grupper av NR og CCR. Den microarray-baserte klassifikator er svært spesifikk for NR.
Vi har også utviklet og testet en Taqman Low-Density Array for i) å sammenligne med de samme pasientene, sensitivitet, spesifisitet og nøyaktighet av microarray- basert klassifikator med en uavhengig teknologi (kvantitativ RT-PCR) mer lett tilpasses for sykehusbaserte analyser; ii) å evaluere nøyaktigheten av signaturen for pasienter som ikke var i mikromatrisestudie.
Den microarray teknologi-avledet klassifikator ble vellykket transponert til en PCR-basert teknologi (TLDA kort) og ga lignende prediktiv resultater. Videre, ved hjelp av TLDA teknologi, klassifikator korrekt klassifisert alle de nye pasienter. Samlet for TLDA analysen, ingen av de 12 CCR ble feilklassifisert som NR og 13 av 15 NR ble korrekt identifisert. Disse resultater antyder at en microarray klassifikator kan transponeres til en teknologi som er mer passende for sykehusbasert bruk, og hvis det ytterligere validert, kan teknikken være potensielt nyttige for spesifikke kjemoterapirelatert beslutninger. Sett fra et terapeutisk synspunkt, siden alle de antatt ikke-respondere var sanne non-respondere og kun to av de antatte respondere ble faktisk ikke-respondere, indikerer dette, potensielt, som på den ene siden, et minimum av enkeltpersoner ville gjennomgå induksjonsbehandling som de ikke vil gagne positivt og som vil forsinke alternative terapeutiske muligheter, og på den annen side, ville terapi ikke holdes tilbake fra personer som kan ha nytte. Men signaturen rapporteres her er hensiktsmessig verken for klassifisering eller diagnostisering av HNSCC eller for prediksjon av metastaser, prognose eller overlevelse og den har få eller ingen gener felles med studier av HNSCC ha disse målene.
funksjonell Betydningen av genene i Signatur
det var ikke mulig, og heller ikke var det målet med denne studien, for å avgjøre om et gen i sorter er årsakssammenheng eller bare en markør for frafallet. De fleste av genene i sortereren (8/10) ble overuttrykt i NR tumorer. Tre av oppregulert gener i NR (TCP1alpha, TXNDC9 og DNAJA1) koder for proteiner som deltar i proteinfolding og mobilenheten og organisasjon. TCP1alpha /CCT1 er en del av chaperonin TCP1 ringkompleks [27], [28]. I flere kreftformer, er TCP1 protein familiemedlemmer overexpressed [29] og chemoresistance har vært knyttet til økt anstand protein uttrykk [30] tyder på at hurtigvoksende svulster trenger økt maskiner for riktig folding av proteiner [31]. TXNDC9, også kalt APACD (ATP-bindende protein assosiert med celledifferensiering), har blitt rapportert å redusere chaperonin TCP1 kompleks ATPase-aktivitet og således en negativ innvirkning på proteinfolding [32]. Dessuten blir genet oppregulert i oksaliplatin motstandsdyktig ovarial og hode- og hals-karsinom-cellelinjer [33], i henhold til våre funn. DNAJA1 (HSP40), med HSP70 og co-anstand, utgjør et proteostasis vedlikeholdssystem. Øket ekspresjon av HSP er funnet i HSP70 og malignitet, med hvilken DNAJA1 medarbeidere, kan være involvert i resistens mot kjemoterapi [34].
To andre oppregulert gener (DLL1 og ODZ2) kode for proteiner som er involvert i ulike signalprosesser. DLL1 (Delta-aktig 1) er et hakk ligand [35]. Nylig, mutasjoner i Notch1,2,3 har blitt beskrevet i hode og nakke kreft [
