Abstract
Som representerer en fornybar kilde for celle erstatning, har nevrale stamceller fått betydelig oppmerksomhet de siste årene. Neurosfærene analyse representerer en metode for å oppdage tilstedeværelsen av nevrale stamceller, men på grunn av en mangel på bestemte og definitive markører for å identifisere dem, deres kvantifisering og den hastighet de utvider fremdeles er ubestemt. Her foreslår en matematisk tolkning av neurosfærene analysen tillater faktisk måling av nevrale stamceller symmetrisk divisjon frekvens. Algoritmen av modeller demonstrerer en direkte sammenheng mellom den totale celle gangers utvidelse over tid målt i sfæren analysen og hastigheten stamceller utvide via symmetrisk divisjon. Modellen gir en metode for å evaluere spesielt virkningen av sykdommer og behandlinger på neural stamcelle aktivitet og funksjon. Ikke bare tilveiebringe ny innsikt i evalueringen av de kinetiske egenskaper av nevrale stamceller, vår modellering vedrører videre kreft biologi som kreft stilk-lignende celler er blitt foreslått for å opprettholde tumorvekst som somatiske stamceller opprettholde homeostase vev. Faktisk svulst stamcelle motstand mot terapi gjør disse cellene et nødvendig mål for effektiv behandling. Neurosfærene analysen matematiske modellen som presenteres her gjør vurderingen av prisen ondartede stilk-lignende celler utvide via symmetrisk divisjon og evaluering av effektene av therapeutics på selvfornyelse og proliferativ aktivitet av denne klinisk relevant befolkning som kjører tumorvekst og gjentakelse.
Citation: Deleyrolle LP, Ericksson G, Morrison BJ, Lopez JA, Burrage K, Burrage P, et al. (2011) Fastsettelse av somatisk og kreft Stem Cell Selv Fornye Symmetric Division Ranger hjelp Sphere analysene. PLoS ONE 6 (1): e15844. doi: 10,1371 /journal.pone.0015844
Redaktør: Mike O. Karl, CRT Dresden, Tyskland
mottatt: 04.08.2010; Godkjent: 25 november 2010; Publisert: 05.01.2011
Copyright: © 2011 Deleyrolle et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) og National Health and Medical Research Council (NHMRC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tradisjonelt ble stamceller antatt å være lokalisert kun i vev hvor differensierte celler var mest utsatt for tap og behovet for utskifting great, som for eksempel huden [1], intestinale epitel [2] og blod [ ,,,0],3]. Ettersom voksne sentralnervesystemet (CNS) ble ansett å mangle en betydelig mengde av neuronal død, og har ingen evne til reproduksjon, eksistensen av nevrale stamceller (NSC) virket både usannsynlig, og unødvendig. Imidlertid, i 1992 eksistensen av NSCs innenfor den voksne pattedyr-CNS med evne til å gi opphav til nye nerveceller ble demonstrert [4]. Som stamceller som finnes i andre vev, NSCs (hvilken linje hele ventrikulære neuroaxis av den voksne pattedyr CNS [4], [5]) utvise den definerende
in vitro
stamcelleegenskaper [2], [6] av spredning, omfattende selvfornyelse, generering av et stort antall avkom, og multilineær differensiering potensial, så vel som den
in vivo
karakteristisk for regenerering av vev etter skade [4], [7], [8 ]. Voksne stamceller representerer en relativt stille reservoar av iverksatte celler. Disse celler har evnen til å dele gjennom hele levetiden av organismen for å gi opphav til mer forpliktede stamceller genererer et stort antall udifferensierte celler. Disse stamfedre til slutt differensiere til avstamning begrenset funksjonelle celler. På grunn av deres evne til å gi opphav til nye celler, hvilke faktorer som regulerer fordelingen av stamceller og forløperceller, og differensiering av deres avkom er av stor interesse ved behandling av CNS-lidelser som skyldes tap eller upassende funksjon av celler. Derfor er utvikling av verktøy som gjør det mulig stamcellespesifikke studien representerer en formidabel utfordring. Stamceller er vanskelig å visuelt definere, da det ikke finnes noen godt akseptert positiv markør. Som et resultat av disse cellene er definert basert på en funksjonell definisjon. Mens ved anvendelse av en funksjonell avlesing har gjort det mulig å identifisere tilstedeværelse (eller fravær) av stamceller i en befolkning, er det dessverre tillater direkte isolering eller diskriminering av stamceller fra ikke-stamceller derved utelukker noen menings kvantitative data som gjelder deres frekvens og /eller ekspansjonsrate.
en voksende mengde bevis støtter hypotesen om at en befolkning på tumor initiere celler (tics), som viser biologiske egenskaper som ligner på vanlige somatiske stamceller, opprettholder ondartede svulster. Tics er postulert til å ligge i akutt myeloid leukemi [9], samt i bryst [10], [11], prostata [12], lunge og mesenkymale tumorer [13]. Viktigere, har nevrale tics også blitt isolert og funnet å vise svært like funksjonelle egenskaper til nevrale stamceller [14], [15], [16], [17]. Den såkalte kreftstamcelle modellen tyder på at det er disse stamcelleegenskaper som gjør tics motstandsdyktig mot behandling og driver tumorresidiv. Som et resultat av disse cellene representerer et viktig mål for effektiv anticancerterapi. Derfor er utvikling av fremgangsmåter som undersøker sin biologi og kinetisk oppførsel er relevant for utforming av innovative behandlinger rettet mot denne bestemte cellepopulasjon.
i CNS, en av metodene for å isolere og utvide somatiske og kreft stamceller er neurosfærene assay (NSA) [4], [14], [15], [18]. Av interesse og attesterer til sin robusthet, er frittflytende sfære kultur system også brukes til å studere blant annet brystkreft stamceller [11], [19]. Men mens NSA er en egnet metode for å identifisere stamcelle aktivitet, hevder vi at opptellingen av kuler er ikke hensiktsmessig å måle stamcelle frekvens eller ekspansjonsrate som gjør dette resulterer i en overvurdering [20], [21].
den aktuelle studien presenterer utvikling, validering og anvendelse av en metode som gjør det mulig spesifikt kvantifisering av somatiske og kreft stamcelle symmetrisk divisjon hastighet ved hjelp av frittflytende sfære analysen.
Resultater
tankeeksperiment
i motsetning til dyrkning og aging av de fleste linjene der flertallet av celler overlever disaggregation og går på å spre seg til kulturen blir sammenflytende, under aging i NSA, de fleste ( 90%) av cellene dør eller ikke lenger sprer. Dette understøttes av det faktum at i løpet av en passasje flertallet av delende celler gi opphav til minst 256 progenies ved å gjennomgå minst åtte celledelinger (data ikke vist). Dette ville resultere i en 256-gangers utvidelse ved hver passasje hvis hvert enkelt belagt celle var vekstfaktor-responsive og delt 8 ganger. Imidlertid våre eksperimenter som er beskrevet nedenfor viser et celledelt gangers ekspansjon mellom 1 og 20 med de forskjellige celletyper vi brukte. Disse dataene, sammen med publiserte klonalitet data [20], [21], [22] viser at mindre enn 10% av cellene belagt i NSA bidra til den generelle befolkningen ekspansjon. Derfor bare den gjenlevende brøkdel av vekstfaktor-responsive sfæren dannende celler deler, skjema sfærer, og fornye grunnleggelsen befolkningen. Celledød tross, i løpet av hver passasje, er det en geometrisk økning i antall celler som blir generert. Vanligvis når 100.000 celler blir sådd, er større enn 90 000 av cellene dør i løpet av de første 24-48 timer, og etterlater 10.000 celler til å spre seg, danner kuler og til slutt generere ca 500 000 celler. Dette 5-gangers ekspansjon har en tendens til å være ganske konsekvent ved passering av celler over tid og aldri viser en tidsavhengig opptrapping i gangers ekspansjon (dvs. 5-fold, 7-fold, 8-fold etc.) [23]. Dessuten er i det vesentlige unik med hensyn til de sammenleggbare økningen i antall celler generert fra passasje til passasje (enkelte linjer kan vise en 5-gangers ekspansjon, mens andre en 6 eller 4 ganger utvidelse), men konsekvent innenfor hver enkelt neurosfære linje den aktuelle linjen.
evnen til ubestemt tid serielt passert NSCs [23] og det faktum at de fleste av cellene dør eller stoppe formerer ved hver passering, viser at befolkningen må vedlikeholdes av en langsiktig prolifererende celle (e) (per definisjon en celle med stamcelle funksjoner). Vi innhold at frekvensen av langsiktig prolifererende (LTP) celler (aka NSC) vil bli reflektert i den hastighet med hvilken populasjonen ekspanderer (dvs. ganger økning fra passasje til passasje), og dette gjenspeiles i helningen av vekstkurven. For å forstå hvordan selvfornyende symmetriske divisjoner av LTP celler påvirke vekstkurve, bør du vurdere følgende tankeeksperiment (figur 1)
(a). Numerisk simulering av stilk /stamceller vekst. Ettersom antallet stamceller (dvs. LTP-celler) som genereres i en klonalt avledet sfære blir øket, blir den samlede fold ekspansjon og helningen av vekstkurven økes i tillegg. (B): Dersom antallet av stammen (LTP) celler i løpet av en kule holdes konstant, og det totale antall celler i en sfære dobles (ii) eller firedoblet (iii), verken folden utvidelse eller helningen på vekstkurven endres imidlertid kurven er forhøyet. LTP, langsiktig voksende celler; STP, kortsiktige voksende celler; ND, ikke-delende celler.
(figur 1a) I tilfelle av en LTP celle som genererer en sfære av 1000 celler uten å gjennomgå noen symmetriske celledelinger, den resulterende kulen vil inneholde kun et enkelt LTP celle. Ved en etterfølgende passasje, vil alle cellene igjen dør eller ikke delta til kulturen utvidelse med unntak av den eneste LTP cellen, som overlever, deler, og danner en ny sfære. Som vi fortsetter å passasje denne sfæren (eller populasjon av celler) på denne måten ville vi observere en 1-fold ekspansjon, som er representert med en flat vekst kurve som vist i Figur 1a (i).
Nå vurdere at en enkelt LTP celle gjennomgår en selvfornyende symmetrisk celledeling som den genererer en kule med 1000 celler. I dette tilfelle er kulen ville ha 2 LTP-celler. Ved en etterfølgende passasje, vil 998 av cellene dør, og hver av de to LTP cellene ville gi opphav til en kule med 1000 celler. Dette dobling av det totale antall sfærer (og dermed celler) vil fortsette, noe som gir en vekstkurve som ser ut som Figur 1a (ii).
Til slutt, hvis vi tenker på at LTP celle gjennomgår 3 symmetriske divisjoner gir opphav 4 LTP-celler og 996 ikke-LTP-celler, ville dette gi et 4-gangers utvidelse ved hver passasje og en vekstkurve som ville bli uttrykt som i figur 1a (iii).
(figur 1b ) Hvis vi nå holde antallet av LTP-celler i en sfære konstant (eksempel 4) og med hver iterasjon endre totale celler generert pr sfære fra 1000 (i) til 2000 (ii) til 4000 (iii), finner vi at den heving av vekstkurven blir påvirket, men ikke dens helning (som vist ved en uendret gangers ekspansjon). Dette indikerer at det totale antall celler som genereres gjør innflytelse grafen men ikke helningen av vekstkurven.
Derfor cellen fold utvidelse, representert ved helningen av vekstkurven, reflekterer den hastighet med hvilken LTP celler utvide. Gitt at LTP cellen ekspansjonsrate er en direkte indikasjon på antall av selv-fornyende symmetriske celledelinger, følger det at den synlige delen av utvidelse eller helning kan brukes til å forutsi LTP (eller stamme) celle selv-fornyende symmetrisk divisjon.
matematisk modellering
forutsetninger.
Her foreslår vi en matematisk modell som gjør det mulig å kvantifisere selvfornyende symmetrisk stamcelle divisjon i vevskultur.
Vi bryte klasse av alle mulige celler i to typer (i) delende celler og (ii) ikke-skille (ND) celler. Eksempler på ND celler er celler som har fullt differensierte eller celler som har dødd. Vi bryter ytterligere klassen dele celler i to undergrupper, langsiktige prolifererende (LTP) celler og kortsiktige prolifererende (STP) celler. Levetiden for LTP-celler er definert til å være uendelig, og i sammenheng med en eksperimentell innstilling, betyr at levetiden er lenger enn for eksperimentet. Produktene av en LTP celledeling, antas å være enten to LTP-celler (symmetrisk selvfornyende divisjon) eller en LTP-celle og en celle STP (asymmetrisk celledeling). Vi antar at LTP cellen differensierende symmetrisk divisjon frekvens (LTP → STP + STP) for å være null i de opprinnelige vekstforhold for analysen. Vi antar videre at i løpet av eksperimentet tid overlevelse og selvpolerende egenskaper av de LTP-cellene er klar og stabil (definert ved en stabil tilstand som diskutert nedenfor).
Levetiden av STP-celler er definert til å være endelig, som i forbindelse med en eksperimentell innstilling, betyr at levetiden er vesentlig kortere enn den for forsøket. Produktene av en STP-celledeling er antatt å være en hvilken som helst binær kombinasjon av STP-celler og ND celler. Det bør understrekes at dette spesielt utelukker STP celledeling fra å produsere en LTP celle. Vi antar videre at dele celle, når den plasseres i riktig miljø, vil fortsette gjennom cellecyklusen og etter hvert deles, på en måte som er uavhengig av tilstedeværelsen av andre celler. Produktene av celledeling vil feste seg og cellesyklusen fortsetter for alle delende celler. Etter tid, en klynge av celler, heretter referert til som en sfære, vil ha utviklet. Viktigere, disse forutsetningene innebærer at en sfære som stammer fra en STP cellen vil inneholde STP celler og ND-celler, mens en sfære som stammer fra en LTP cellen vil inneholde LTP celler, STP celler og ND celler.
aging Neurosfærene nødvendigvis innebærer dissosiasjon av kulene til de individuelle bestanddelene (dvs. celler). En fraksjon av disse bestanddeler cellene blir så tilfeldig samplet og podet inn i en ny kolbe inneholdende et miljø ettergivende for celledeling (figur 1). Her antar vi at LTP cellene er stamceller-lignende celler, mens STP celler er mer begrensede stamceller. Derfor er den langsiktige utvidelse av befolkningen er direkte avhengig av utvidelsen av LTP og ikke STP-celler. Vi har tidligere vist at 95% av kulene i NSA ikke kan føres mer enn 4 eller 6 ganger antyder de fleste av kulene er avledet fra STP-celler og at LTP cellene oppviser en høyere proliferativ potensiell [20], [21]. Derfor, for nøyaktig å definere en populasjon av celler som inneholder stamceller-lignende (dvs. LTP) celler den totale tids løpet av forsøket må strekke seg over mer enn 4 til 6 passeringer.
Direkte modellering av neurosfærene-analysen.
Etter noen innledende passasjer (tilsvarende en «recovery periode» hvis du starter med fersk dissekert primære vev), den dissosierende, plating, og voksende kuler i bulk kultur vil bli konsekvent som prosessen når en stabil tilstand som gjenspeiler en kompleks likevekt mellom celleoverlevelse, død, proliferasjon og differensiering. Det vil si at et første antall celler blir sådd (for eksempel 2,5 x 10
5), som genererer kuler og produsere en total celletall for kolben (f.eks, 1 x 10
6), en del av hvilken høstes (for eksempel 25% blir tatt) og anvendt for poding av en annen kolbe for passasje. De målbare mengder er den celletall i starten av passasjen,
T
i
, og celletall i slutten av passasjen,
T
f
. Fold ekspansjon,
F
, beregnes ved
Etter prøveperioden av cellene til dyrkningsforhold, når eksperimentet har inngått stabil tilstand, er F konstant innenfor grensene av eksperimentell feil. Hvis staten er stabil da må det også være sant at de første tallene for LTP, STP og ND celler er de samme for hver passering. Likeledes må de endelige tall være den samme for hver passasje. Videre disse celletypene må være under samme generelle fold ekspansjon, dvs., etter
Siden LTP celler kan bare opprettes fra LTP celler, og hver LTP celle danner en sfære, så må det også være sant, at i gjennomsnitt det er
F
LTP celler i hver LTP avledet sfære. Det vil si at antallet LTP celler opprettet i en LTP stammer sfære (definert til å være
l
) må gis ved,
l = F
.
Den samme analyse kan ikke brukes til STP celler fordi både LTP og STP cellene produserer STP celler. På samme måte kan ikke anvendes den samme analysen til ND celler. Som sådan blir dataanalyse et spørsmål om å måle celletellinger ved starten og slutten av hver passasje, å dividere to for å tilveiebringe en fold ekspansjon, og deretter i snitt brette utvidelser av passasjer i den stabile tilstand. Per definisjon er dette gjennomsnitt tilsvarer antallet av LTP (dvs. NSC) celler i en LTP-avledet sfære. Derfor bør denne metoden nøyaktig reflektere forekomsten av stilk-lignende celler i stilk-lignende celler avledet kuler.
LTP selvfornyende symmetrisk divisjon frekvens.
Den minste tidsenhet i ovennevnte modell er en enkelt passasje. Vi har nå utlede en modell for intra-passasje LTP celle tall. Som nevnt tidligere, har LTP celledeling to mulige utfall (i) en
selvfornyende
symmetrisk divisjon (LTP → LTP + LTP) eller (ii) en asymmetrisk divisjon (LTP → LTP + STP). Vi betegner sannsynligheten for det første utfallet av
p
ll
og andre utfallet av
p
ls
. Siden det ikke finnes andre mulige utfall, må summen av disse to sannsynlighetene være enhet. La cellesyklustiden for de LTP cellene bli betegnet med
c
l
. Sannsynligheten for en symmetrisk celledeling per tidsenhet er dermed
p
ll Twitter /
c
l
. Dette kan også tolkes som frekvensen av LTP celle symmetrisk divisjon og vi vil betegne det ved å
K
ll
. Siden bare LTP cellene produserer LTP celler, er veksten av LTP celle tall proporsjonal med dagens totale antall LTP celler. Det bør også bemerkes at en asymmetrisk fordeling ikke endrer det totale LTP celle tall. Veksttakten av LTP celle tall kan dermed uttrykkes som
Dette uttrykket kan løses for å uttrykke de absolutte tallene for LTP celler på en gang
t
, etter
Det er nå mulig å likestille denne modellen med den ovennevnte direkte modell. For en passasje som starter ved t = 0 og etterbehandling ved t =
t
f
, etter
Ordne dette uttrykket gir en metode for å beregne frekvensen av LTP celle symmetrisk divisjon
det vil si at frekvensen av LTP celle selv-fornyende symmetrisk fordeling kan beregnes ved å ta den naturlige logaritme av folden ekspansjon og dividere med passeringstiden. Derfor endringer i folden utvidelse (helling av vekstkurven) gjenspeile endringer i LTP (dvs. stilk) celle frekvens etter variasjoner i deres selvfornyende symmetrisk celledeling rate.
Validering av modellen ved hjelp av Neural Colony Forming Cell Assay (N-CFCA)
i likhet med NSCs (LTP-celler), progenitor (STP) celler har evnen til å spre seg, og generere avkom som kan differensieres i funksjonelle celler. Imidlertid, i motsetning til stamceller, forløperceller ha en mer begrenset spredning potensial overtid. Den nylig utviklet neurale kolonidannende celleanalyse (N-CFCA) utnytter disse forskjellene i proliferativ evne, slik at man for å diskriminere NSCs fra progenitorceller basert på størrelsen av koloniene de produserer da overført til kulturen [21]. I samsvar med den forutsetning at progenitorceller oppviser begrenset proliferativ kapasitet i forhold til stamceller, og at størrelsen (diameteren) av kolonien kan brukes til å skjelne sin grunnlegger celletype, demonstrerte vi at store kolonier (mer enn 2 mm) har en større proliferativ potensial og oppviser alle de viktigste vevskultur stamcelle egenskaper (omfattende selvfornyelse, generering stort antall avkom og multilineær differensiering potensiale) sammenlignet med mindre kolonier (som ikke viser slike stamcellekriterier). Derfor gir N-CFCA en metode for å nummerere nevrale stamceller frekvens [21].
For å støtte matematisk modellering av NSA med biologiske eksperimenter vi har sammenlignet dyrking og utvidelse av embryonale og voksne murine NSC i forhold som fører til ulike vekstrater (dvs. forskjellig fold utvidelse som innebærer forskjellig stamcelleselvfornyende symmetrisk divisjon frekvens). Mens NSA-modellen ikke tillater oss å nøyaktig tallfeste antall stamceller (utelukkende på grunn av at vi ikke vet hvor mange stamceller vi startet med), men det gjør at en sammenligning mellom grupper av befolkningen i stamcelleekspansjonsrate, som gjenspeiler hyppigheten av symmetriske stilk celledeling. I dette tilfellet sammenlignet vi cellen fold utvidelse av følgende forhold (tabell 1): (group1) Foster E14 NSC kulturer vs. Aged voksen (20 måneder) NSC kulturer, (gruppe 2) Foster E14 NSC kulturer med mitogen EGF vs . bruk av EGF + bFGF, (gruppe 3) Voksen NSC kulturer med mitogen EGF vs. bruk av EGF + bFGF. Fra disse tiltakene effektiv stamcelle symmetrisk divisjon frekvens (K
ll
) ble avledet (tabell 1). Foster stamceller dyrket med både vekstfaktorer viste en 7.16-fold økt utbygging hastighet i forhold til 24-måneder gamle stamceller dyrket med EGF alene (gruppe 1) og en 1.33-fold forskjell i forhold til fosterets kulturer utsatt til EGF alene (gruppe 2 ). Gruppe 3 vises en 1,57 gangers forskjell mellom de to betingelser. Disse forskjeller innenfor gruppene i hastighet stamceller ekspanderte ble korrelert til den absolutte antall stamceller, målt ved hjelp av N-CFCA (fig. 2), og sammenligningsresultatene er vist i tabell 2. For å teste antagelsen at begge metoder var lik vi sammenlignet med forskjellen av deres utgang til null ved hjelp av Student t-test. Den p-verdi av den statistiske testen var 0,28 demonstrerer at begge analysene forutsi en tilsvarende endring i forholdet mellom neural stamcelle nummer eller fold utvidelse (også kjent som selv-fornyende symmetrisk divisjon rate), å validere denne matematisk tolkning av NSA.
Celler fra hver gruppe ble dyrket i N-CFCA. Grafene sammenligne i hver gruppe, antall store kolonier, større enn 2 mm i diameter (den eneste størrelsesområdet som viser alle de viktige vev kultur stamcelle funksjoner) oppnådd etter 21 dager
in vitro
. * P = 0,039, ** p = 5,38 × 10
-11, n = 15, t-test, 2 haler.
Bruk av modellen
Vi brukte modellen som en metode for å studere somatisk stamcelleselvfornyende symmetrisk divisjon mekanisme. Ved hjelp av N-CFCA, vi tidligere har vist at veksthormon reseptor slå ut (GHR – /-) mus viste signifikant færre periventrikulær region avledet stamceller sammenlignet med vill-type dyr (23 ± 3 vs 40 ± 3) [24]. Tilsvarende dyrket i NSA, sammenlignet med villtype nevrale stamceller, GHR – /- NSCs utvidet til en betydelig lavere pris (. 2,04 ± 0,2 vs 3,63 ± 0,4, figur 3a) [25] korrelert til redusert selvfornyende symmetrisk divisjon hastighet (fig. 3b). Igjen, begge analysene spådde de samme forholdene mellom de to populasjoner (1,74 og 1,78 for henholdsvis N-CFCA og NSA) [24]. Disse resultatene tyder på at veksthormon signale styrer selvfornyelse av somatiske neuralstamceller ved å regulere deres symmetriske divisjon hastighet. Pluchino og kolleger beskrives den hemmende effekten av kronisk betennelse på stamcelleselvfornyelse [26]. Denne studien rapportert at eksponering av voksen subventricular sone avledet stamceller til å indusere-betennelse Th1 cytokiner forårsaket en signifikant reduksjon i antall NSCs målt med N-CFCA og at dette fenomenet ble fulgt med en reduksjon av helningen av vekstkurven [ ,,,0],26]. Disse dataene ytterligere bekrefte vår matematisk tolkning av neurosfærene analysen og støtte av modellen hvor Th1 cytokiner nedregulerer somatiske voksen stamcelle-ekspansjon hastighet via symmetrisk celledeling relatert mekanisme.
(a-b) sammenlignet med vill-type dyr , GHR – /- neuralstamceller oppviste lavere ekspansjonstakt (a, ** p = 0,005, n = 7, t-test, 2 haler), som var forbundet med en redusert symmetrisk celledeling frekvens (f, ** p = 0,003, n = 7, t-test, 2 haler). (C-d) Sammenligning av veksten i neurosfærer analyse av tre menneskelige GBM prøvene viste tydelige fold utvidelser (c) og bakkene i vekstkurve (d). t-test (2 haler) ble anvendt for å sammenligne folden utvidelse mellom linjene A og B (*** p = 1,4 x 10
-6, n = 8-9), linjene A og C (** p = 1,4 x 10
-5, n = 8-6) og linjene B og C (* p = 0,001, n = 9-6). (E) LTP kreftcelle symmetrisk divisjon frekvens (K
ll
) ble avledet fra fold utvidelse observert ved hver passering. t-test (2 haler) ble brukt til å sammenligne K
ll
mellom linjene A og B (*** p = 8,34 × 10
-12, n = 8-9), linjene A og C (** p = 1,66 x 10
-8, n = 8-6) og linjene B og C (* p = 0,002, n = 9-6). (F) Overlevelse analyse etter implantasjon i striatum av NOD /SCID-mus med 200.000 celler fra tre forskjellige tumorcellelinjer vist et omvendt forhold mellom hastigheten for symmetrisk fordeling av den langsiktige proliferative kreftcellen og sykdomsprogresjon. Logrank test, p = 0,0038 sammenligning A til B, s 0,0001 sammenligning A til C og B til C. (g) Grafen representerer den midlere overlevelse etter hGBM intrakraniell transplantasjon som en funksjon av frekvensen LTP kreftceller gått symmetrisk divisjon (K
ll
). De stiplede linjene tilsvarer 95% konfidensintervall band av tilpasningen kurve oppnådd ved ikke-lineær regresjon (y = 2,323 – 0.2091x + 0.005125x
2). Koeffisient R
2 og p-verdi er også vist.
Matematikk modellen kan også brukes til kreft biologi. Flere typer kreft, inkludert de av bryst og CNS, inneholder celler som utviser stilk-lignende cellefunksjoner som langsiktig repopulating eiendom [10], [14], [16], [27]. Kreften stamcelle hypotesen sier at svulster er hierarkisk organisert og vedlikeholdes av en distinkt undergruppe av langsiktige repopulating kreft stamceller-lignende celler som gir terapeutiske Ingen respons egenskaper. Derfor forstå dynamikken i disse cellene er av stor interesse for å forstå kreft biologi og å designe innovative og spesifikke behandlinger. Vi brukte vår modell for å sammenligne kreft stilk-lignende celle (aka LTP kreftceller) selvfornyende symmetrisk divisjon frekvens og tumorprogresjon mellom flere voksne menneskelig glioblastoma multiforme (hGBM) cellelinjer dyrket i neurosfærene analysebetingelsene [16]. De tre forskjellige hGBM analyserte prøvene (A, B og C) og generert i vårt laboratorium utstilt forskjellige ekspansjonslister (som reflekteres av forskjellige bakker av kurven) og LTP kreftcelle symmetriske divisjon frekvens (Fig. 3c-e). Ortotopisk transplantasjon på 200.000 celler fra hGBM prøver A, B og C i striatum av immunkompromitterte mus førte til tumordannelse, etterfulgt av død av dyrene (fig. 3f). Viktigere, sykdomsprogresjon ble direkte og omvendt korrelert med selvfornyende symmetrisk divisjon frekvens av LTP kreftceller. Dette ble uttrykt ved å sammenligne den midlere overlevelse av vertsdyr implantert med en av de tre hGBM tumorstamcellelinjene til LTP kreftcellen symmetrisk fordeling rate (K
ll
) (fig. 3g).
i tillegg til hjernesvulster har vi brukt vår modell til brystkreft. Vi dyrket og formeres
in vitro
tre forskjellige brysttumorcellelinjer (KPL-1, MCF-7 og BT-474 heter henholdsvis linje A, B, og C) ved å anvende tilsvarende dyrkingsbetingelser som anvendes for NSA. Vi brukte serumfritt medium inneholdende human epidermal vekstfaktor (rhEGF) og basisk fibroblast vekstfaktor (rhbFGF) tillater brysttumorceller til å vokse og danne sfæriske ikke-adherente mammospheres [11], [19], målt folden utvidelse av brystkreft linjer over seks til åtte passasjer og beregnet deres respektive K
ll plakater (fig. 4a-b). Vår matematisk modell av mammosphere analysen spår en hastighet av LTP kreftcellen symmetrisk fordeling av 0,125 ± 0,011 for linje A, 0,078 ± 0,005 for linje B og 0,026 ± 0,003 etter linjen C. 10
6 celler av hver brysttumorcellelinjen ble transplantert under huden på immunkompromitterte mus og dannet tumorer ved forskjellig hastighet (fig. 4c). I likhet med hjernesvulst eksperimenter, cellelinjer som oppviser høyere LTP kreftcellen symmetrisk fordeling hastighet førte til raskere tumorprogresjon kombinert med dårligere overlevelsen som vist i grafisk sammenligning av K
ll
til den midlere overlevelse for de transplanterte dyr (fig. 4c-d).
(A-B) Tre brystcancercellelinjer ble dyrket i mammosphere analysen. Under disse betingelser viste de 3 cellelinjer forskjellig ekspansjonsrate og LTP celle symmetrisk divisjon frekvens. ** P 1 x 10
-5, t-test, 2 haler, n = 36-48. (C) Tumorvekst ble overvåket overtid mellom de 3 grupper som overlevelsesanalyse ble utført og fremstilt grafisk som prosent av dyr som ikke har nå den maksimale tumorstørrelsen (520 mm
3) som en funksjon av tid. Logrank test, p 0,0001 sammenligne de tre populasjonene til hverandre, n = 10. (d) På samme måte som hGBM, tumorprogresjon etter brystcancercelle s.c. transplantasjon ble direkte og inverst korrelert til den symmetriske fordeling frekvensen av kreftcellen LTP. De stiplede linjene tilsvarer 95% konfidensintervall band av tilpasningen kurve oppnådd ved ikke-lineær regresjon (y = 0,1743 – 0.001123x – 0.00002258x
2). Koeffisient R
2 og p-verdi er også vist.
Til sammen disse resultatene tyder på at LTP kreft celle selvfornyende symmetrisk divisjon hastighet målt
in vitro
hjelp Sphere analyser kan bli brukt til å forutsi tumorprogresjon basert på ideen om at øket selvfornyende symmetriske avdelingene av LTP kreftceller produserer mer tumor initiere cellene som resulterer i en mer aggressiv svulst. Disse data også validere den potensielle anvendelsen av vår modell i kreft og støtte betydningen av den maligne LTP-celledelen i å drive utvidelsen av tumor og påvirke sykdomsforløp.
Modellen kan også brukes til å identifisere stoffer som spesifikt målrette LTP kreftcellepopulasjon kontra de som målrette STP kreftcellepopulasjon. Tidligere hadde vi vist at eksponering av kultivert hGBM til BMP4 reduserer K
ll
som tyder på at det er rettet mot LTP kreftcellepopulasjon (dvs. kreft stamceller), som ble bekreftet av en betydelig reduksjon i
