Abstract
CDA-2 (celledifferensiering agenten 2), en urin forberedelse, har potent anti-proliferativ og pro-apoptotiske egenskaper i kreftceller. Imidlertid mekanismene for tumor-inhiberende virkning av CDA-2 er langt fra klart, og spesielt var det ingen rapport om lungekreft. Her viser vi at CDA-2 og dets hovedkomponent fenylacetylglutamin (PG) redusere den metastatisk lungetumorvekst, og øker overlevelsestiden etter inokulering med Lewis lungekarsinom (LLC) celler på en doseavhengig måte i C57BL6 mus. Proliferativ program analyse i kreftceller avdekket en fundamental innvirkning av CDA-2 og PG på spredning og apoptose, inkludert BCL-2, BCL-XL, cIAP1, Survivin, PCNA, Ki-67 proteiner og tunel analyser. CDA-2 og PG betydelig redusert NF-kB-DNA-bindende aktivitet i lungekreftceller og i alveolære makrofager av tumorbærende mus, og særlig redusert frigivelse av inflammatoriske faktorer, inkludert TNFa, IL-6, og KC. Videre CDA-2 og PG redusere uttrykk for TLR2, TLR6, og CD14, men ikke TLR1, TLR3, TLR4, og TLR9 i benmargsmakrofager (BMDM) av mus stimulert av Advisor-kondisjonert medium (LLC-CM ). Over-uttrykk TLR2 i BMDM forhindret CDA-2 og PG fra inhibere NF-kB-aktivering, så vel som induksjon av TNFa og IL-6. TLR2: TLR6 komplekser megle effekten av NF-kB inaktivering av CDA-2. I konklusjonen, CDA-2 er en potent hemmer lunge svulst utvikling ved reduksjon av betennelse i lungene gjennom undertrykkelse av NF-kB aktivering i myeloide celler, assosiere med modulering av TLR2 signale
Citation. Wang X, Jiang CM, wan HY, Wu JL, Quan WQ, Bals R, et al. (2012) CDA-2, en urin Forberedelse, Hemmer Lung Cancer Development gjennom bekjempelse av NF-kappaB Activation i myelogen Cell. PLoS ONE 7 (12): e52117. doi: 10,1371 /journal.pone.0052117
Redaktør: Hiroshi Shiku, Mie Universitetet Graduate School of Medicine, Japan
mottatt: 26 april 2012; Godkjent: 09.11.2012; Publisert: 17.12.2012
Copyright: © 2012 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av forskningsprogrammet i komiteen for vitenskap og teknologi i Putuo (PTKW09-B02). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall i verden, forårsaker mer enn en million dødsfall på verdensbasis [1]. Til tross for fremskritt i tidlig oppdagelse og standard behandling, er lungekreft ofte diagnostisert på et avansert stadium og har en dårlig prognose. Derfor forebygging og behandling av lungekreft er i fokus for intensiv aktuell forskning [2].
CDA-2 (celledifferensiering agenten 2) er en urin forberedelse som isolert fra sunn menneskelig urin i Kina. Det er en ny multifunksjonelt legemiddel som er nyttig for både forebygging og behandling av flere tumorer, inkludert leukemi, brystcancer, leverkreft, og pheochromocytoma, i prekliniske undersøkelser [3] – [5]. Imidlertid mekanismene for tumor-inhiberende virkning av CDA-2 er langt fra klart, og spesielt var det ingen rapport om lungekreft. CDA-2 inneholder flere aktive komponenter, inkludert fenylacetylglutamin (PG) (41%), benzoyl glycocoll (35%), peptider (MW 400-2800) (17%), 4-OH-fenyleddiksyre (6%), og 5 -OH-indoleddiksyre (1%), som med ulike mekanismer for anticancer [5]. Selv om tumor-inhibering kan være knyttet til disse komponentene, er PG sannsynlig å være en stor svulst-hemmende komponent [3]. Fase I /II /III kliniske studier av CDA-2 har blitt fullført i Kina i 2003. I august 2004, Statens Drug Administration (SDA) i Kina godkjent bruk av CDA-2 som en anticancer stoffet i solide tumorer. Selv om CDA-2 ble foreslått for å bidra til tumorinhibering gjennom oppregulering av peroksisom proliferator-aktiverte reseptor-γ (PPAR-γ) og undertrykkelse av PI3 /akt-signalreaksjonsveien i tumorceller, tumorhemmende virkning av CDA-2- ble hittil hovedsakelig påvist i kreftceller og dens virkning på tumor microenvironments, særlig for å immun /betennelsesceller i svulsten stroma, ikke er blitt kritisk evaluert [6], [7].
NF-kB er en nøkkel koordinator av inflammatoriske og immunrespons, og er nylig blitt funnet å spille en sentral rolle i karsinogenese av en rekke kreftformer, inkludert lunge- eller kolonkarsinom [8], [9]. Det er bemerkelsesverdig at de pro-inflammatoriske cytokiner og kjemokiner har vært knyttet til kreftfremkallende prosesser i mennesker og mus, og er regulert av NF-kB pathway. For eksempel, NF-kB-drevet cytokinproduksjon av myeloide celler (f.eks modne makrofager, dendrittiske celler og neutrofiler) slik som TNF-α og IL-6 er nødvendig for lungetumorvekst [9]. I en musemodell av kolitt-assosiert kreft (CAC), ble IKKβ slettet i myeloide celler (som fører til redusert NF-kB aktivitet), tumorstørrelsen var betydelig mindre sammenlignet med kontroller og ekspresjon av proinflammatoriske cytokiner, slik som TNFa, IL -6, og IL-1, ble også betydelig redusert [10]. Således i myeloide celler, fremmer NF-kB-aktivering tumorvekst. Denne effekten er hovedsakelig på grunn av økt tumorcelle-proliferasjon til ved produksjon av TNFa, IL-6, og andre cytokiner som er regulert av NF-kB banen i myeloide celler [10], [11].
Her rapporterer vi vår siste arbeidet med svulsten undertrykkelse og de molekylære mekanismene for CDA-2 og dens viktigste bestanddel, PG, til lungekreft. Vi brukte eksperimentelle murine lungekreft modeller hvori CDA-2 og PG reduserer tumorvekst lunge, og vist at NF-kB-inaktivering i myeloide celler som er ansvarlig for CDA-2-indusert tumorregresjon. Vi fant at inhibering av TLR-2-signalering er en viktig mekanisme for CDA-2-indusert NF-kB inaktivering. Våre resultater tyder på en ny teori for kreftbehandling ved CDA-2, basert på hemming av NF-kB i myeloide celler i kreft microenvironments.
Materialer og metoder
Cell Culture
musen Lewis-lungekarsinom (LLC) celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection og dyrkes i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Hyclon laboratorier. Inc, South, Utah, USA) supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS) (Invitrogen, Grand Island, NY, USA), 100 U /ml penicillin og 100 U /ml streptomycin (Hyclon laboratorier. Inc, South, Utah, USA). Cellekulturer ble utført ved 37 ° C i fuktet luft med 5% CO
2.
Dyr
Kvinne C57BL /6 mus ble hentet fra National gnagere Laboratory Animal Resource (Shanghai Branch , PRC) og holdt under et patogen-fri Central Animal Facility av Tongji University. Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i retningslinjene for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Alle dyreforsøk ble godkjent av Tongji University etikkomiteen om bruk og stell av dyr.
Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Generation av Lung Cancer Model i mus og behandling av CDA-2 og PG
En lungekreft metastase modell i C57BL /6 mus ble generert ved intravenøs injeksjon av LLC celler. I korthet Subkonfluente LLC celler eller A549-celler ble høstet og ført gjennom en 40 um celle sil (BD Biosciences, Bedford, MA, USA), ble vasket tre ganger med PBS, resuspendert i serumfritt DMEM og injisert ved en konsentrasjon på 2 x 10
5 LLC celler per mus inn i halevenen. After14 dager, ble mus injisert intraperitonealt (ip) med 500 mg /kg, 1000 mg /kg, og 2000 mg /kg CDA-2 (vennlig levert av Ever Livet Pharmaceutical Co Ltd Hefei, Anhui, Kina) eller 200 mg /kg, 400 mg /kg, og 800 mg /kg PG (Sigma Aldrich, Steinheim, Tyskland) i PBS eller PBS alene en gang hver dag i 10 dager.
Evaluering av lungesvulster
på utpekt tidspunkter, ble musene drept, og deres lunger ble fjernet, veid, og histologisk undersøkt. Noen mus ble holdt inntil døden og overlevelsesdata ble innhentet. Lungetumorknuter ble microdissected ved anvendelse av en 18 G nål under et mikroskop for proteinanalyse. Tumor mangfold og maksimal størrelse ble bestemmelse som beskrevet [9]. I korte trekk, ble hele tumorbærende lungene manuelt oppblåst med og fiksert i 4% paraformaldehyde og innebygd. Parafininnstøpte lungene ble serielt seksjonert ved 350 nm og histologisk undersøkt med hematoxylin og eosin (H E).
Immunohistokjemiske Analyser
Immunohistochemistry ble utført som beskrevet tidligere [12]. Mus anti-Ki-67 (Abcam, Cambridge, UK) ble anvendt som primært antistoff. Sekundær antistoff inkubasjon og farging ble utført ved hjelp av EnVision® + System-HRP (AEC) kit (Dako, Carpinteria, CA, USA) i henhold til produsentens anbefalinger. For TUNEL analysen ble en deadend ™ Colorimetric TUNEL System (Promega) brukes i henhold til produsentens anbefalinger. Antallet Ki-67 eller TUNEL-positive tumorceller, og totalt antall tumorceller ble målt i seks mikroskopiske felt av tilfeldig valgte tumorer og deretter den midlere verdi ble beregnet som prosentandelen av Ki-67 eller TUNEL-positive tumorceller.
Western blotting
Lung tumornoduler ble nøye microdissected å bruke en 18 G nål fra lungene under et mikroskop. For total protein isolasjon, ble 10 mg tumor nodul homogenisert i 500 pl cellelyseringsbuffer (Cell Signal Technology, Danvers, MA, USA) inneholdende 5 mM PMSF og proteasehemmere ved hjelp av rotor-stator-homogenisator. Western blot-analyse ble utført som beskrevet tidligere [13]. Kort fortalt ble totalproteinekstrakter lastet på 10% SDS-polyakrylamidgeler, utsatt for elektroforese, og blottet på Hybond-C Ekstra membraner (Amersham Bioscience, Buckinghamshire, Storbritannia). De primære antistoffer inkludert: mus anti-BCL-XL, mus anti-BCL-2 (begge fra Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); mus anti-PCNA, kanin anti-cIAP1, kanin anti-Survivin (alle tre fra Abcam, Cambridge, UK); mus anti-β-aktin (Sigma Aldrich, Steinheim, Tyskland). HRP-konjugert geit anti-kanin (Santa Cruz Biotechnology) eller kanin anti-mus ble brukt som sekundær antistoff (Dako, Glostrup, Danmark).
Bronchoalveolar kylling (Balf) leukocyttverdiene og alveolære makrofager Isolation
Balf ble bestemt som tidligere beskrevet [14]. Prosenter av leukocytt-subpopulasjoner ble bestemt ved å telle 100 leukocytter i en tilfeldig valgt parti av cytospin lysbildet. Det totale antall leukocytter i Balf ble bestemt ved hjelp av et hemocytometer (Beckman Coulter, Miami, FL, USA). Alveolære makrofager ble isolert i EMSA som tidligere beskrevet [15]. Kort fortalt, det Balf var seedet i DMEM og vedlikeholdes i cellekultur parabolen. Celler ble inkubert ved 37 ° C i fuktet luft med 5% CO2 i 1 time. Skålen ble deretter vasket 3 ganger med PBS, og de adherente celler, hovedsakelig makrofager, ble oppsamlet for kjerneproteinekstrakt.
Elektroforetisk mobilitet skift analyse (EMSA)
Nuclear proteiner ble isolert fra lunge svulster og alveolære makrofager ved hjelp Nuclear Extract Kit (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) og NF-kB DNA-bindende aktivitet ble målt med EMSA som beskrevet [13]. Kort sagt ble kjerneproteiner inkubert med [
32p] -merket dobbeltkjedet NF-kB konsensus probe (Promega) ved romtemperatur i 30 min. DNA-proteinkomplekser ble løst på 4% polyakrylamidgeler likevekt i 0,5 × TBE henhold 300V. Geleer ble tørket og utsatt for Hyper ECL (Amersham Bioscience) ved -80 ° C og utviklet ved hjelp av Kodak film (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA).
Cytokiner ELISA-analysen
Balf prøver ble fremstilt som beskrevet ovenfor. TNFa, IL-6, og KC ble målt ved kommersielt tilgjengelig sandwich-type ELISA (R D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), etter produserer «instruksjoner
Mouse Bone Marrow makrofager (BMDMs. ) Isolering og luciferaserapportørplasmid analysen
Celler fra benmargen av C57BL6 mus ble dyrket i DMEMs medium (10% FCS) supplert med 10 ng /ml rekombinant mus M-CSF (eBioscience, San Diego, CA, USA ) i 7 dager for å tillate differensiering til makrofager. Adenovirus-konstruksjoner som koder for full-lengde cDNA av TLR2 ble opprettet ved hjelp av Adeasy system som tidligere beskrevet [16], [17]. NF-kB luciferase adenovirus plasmid PNF-kB-Leu (BD Clontech) som inneholdt flere kopier av NF-kB konsensussekvensen for å overvåke NF-kB-aktivering. BMDMs (1 x 10
5 per brønn av 12-brønners plater) ble infisert med adenovirus TLR2 plasmider og kontroll plasmider, etter 5 timer ble cellene infisert på nytt med luciferase adenovirus plasmid PNF-kB-Leu. Etterfulgt av 24 timers inkubasjon ble de infiserte cellene stimulert i 24 timer med LLC-CM eller /og CDA-2, og deretter ble lysert og luciferase reporter-gen-aktivitet ble bestemt ved luciferase reporter-analysen (Promega, Madison, WI, USA) .
LLC kondisjonert medium
Kondisjonert medium ble samlet inn fra LLC celler inkubert i serum-free DMEM (SFM) i 24 timer, og filtreres gjennom et 0,2 mikrometer filter. Kondisjonert medium prøvene ble lagt til BMDMs i 24 timer, hvoretter TLR gener uttrykk ble analysert.
RNA Isolation og Real-time PCR
Totalt lungevev og BMDMs RNA var forberedt med RNeasy pluss mini kit (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA) i henhold til produsentens anbefaling. Sanntids blandinger PCR reaksjons har blitt beskrevet tidligere [18]. I korthet cDNA ble syntetisert ved revers transkripsjonsreaksjon ved å bruke First Strand cDNA-syntesesett (Invitrogen). Real-time PCR ble utført ved hjelp av qPCR SYBR Grønn Mix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) på en AB 7300 Real time PCR system maskin (AB Applied Biosystems, Singapore). De følgende PCR-primere ble anvendt: mus β-aktin, 5′-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 «og 5′-CTGGTGCCTGGGGCG-3′; mus Il1β, 5»-CAACCAACAAGTGATATTCTCCATG-3 «og 5′-GATCCACACTC TCCAGCTGCA-3′; mus IL6, 5»-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3 «og 5′-TCC ACGATTTCCCAGAGAAC-3′, mus-TNFa, 5»-AGCCCCCAGTCTGTATCCTT-3 «og 5′-CTCCCTTTGCAGAACTCAGG-3′; mus Kc, 5»-CTTGGGGACACCTTT TAGCA-3 «og 5′-GCTGGGATTCACCTCAAGAA-3′; mus Mip1, 5»-TGGAG CTGACACCCCGAC-3 «og 5′-ACGATGAATTGGCGTGGAA-3′; mus Mcp1, 5»-GCAGGTCCCTGTCATGCTTC-3 «og 5′-TCCAGCCTACTCATTGGGATCA-3»; mus TLR2, 5’TGGTGTCTGGAGTCTGCTGTG -3 «og 5’CGCTCCGTACGAA GTTCTCAG -3»; TLR6, 5’CAACTTAACGATAACTGAGAG -3 «og 5’CCAGAG AGGACATATTCTTAG -3»; CD14, 5’ACA TCT TGAACC TCC GCA AC -3 «og 5’AGGGTTCCTATCCAGCCTGT -3′. Spesifisitet av RT-PCR ble kontrollert av » ingen revers transkripsjon » kontroller og smeltekurve analyse. Kvantitative PCR-resultater ble oppnådd ved bruk av ΔΔCT (syklus terskel) -metoden. Data ble normalisert til p-aktin nivåer i hver prøve.
Statistical Analysis
Tallene presenteres som gjennomsnitt pluss eller minus SEM. Sammenligninger mellom grupper ble analysert ved t-test (to-sidig) eller ANOVA for eksperimenter med mer enn to undergrupper eller Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse. Resultatene ble ansett som statistisk signifikant for P-verdier mindre enn 0,05.
Resultater
CDA-2 Reduserer Lung tumorvekst i mus tumormodeller
For å undersøke effekten av CDA-2 og dens viktigste komponenten PG på vekst av lunge svulst, svulster ble generert ved intravenøs injeksjon av 2 × 10
5 LLC celler i C57BL6 mus. After14 dager, ble musene injisert intraperitonealt (ip) med 500 mg /kg 1000 mg /kg og 2000 mg /kg CDA-2 eller 200 mg /kg, 400 mg /kg og 800 mg /kg PG i PBS eller PBS alene en gang hver dag i 10 dager. Mus ble avlivet, og deres tumor mangfold og maksimal tumorstørrelser av lungetumorer ble evaluert. I kontrast med kontroll, administrering av CDA-2 til musene betydelig reduserte lungetumor mangfoldighet og maksimal tumorstørrelsene (fig. 1A, B). H E farging bekreftet massiv reduksjon av tumorbelastningen i CDA-2-behandlede mus. (Fig. 1A). Det er også betydelige forskjeller i lungetumorbelastninger etter forskjellige doser av CDA-2 administrering indikerer CDA-2 inhiberte metastatisk tumorvekst i en doseavhengig måte (fig. 1 A, B). På samme måte, PG hadde også en betydelig hemmende effekt på metastatisk vekst av lungetumor, som åpenbart av macroscopy og mikroskopi undersøkelse (Fig. 2A, B). Vi har også vurdert overlevelsestider av tumor injiserte mus som ble behandlet med CDA-2 av Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse. Mus overlevelsestider ble undersøkt og viste at levetiden strekker seg fra tumor-bærende mus ble forlenget når det gis forskjellig konsentrasjon av CDA-2-behandling (fig. 1C). Det var også signifikant forskjell i overlevelse på forskjellige konsentrasjons CDA-2-behandlede tumorbærende mus (Fig. 1C). Disse resultatene bekrefter de oppnådd ved å undersøke svulst mangfold, maksimal tumor størrelser, H E flekker fra lungemetastatisk karsinomer modeller
(A) Lung utseende (opp) og histologi. (H E flekken, ned) i Advisor inokulerte C57 /BL6-mus 10 dager etter CDA-2 behandling med angitte doser. 2 x 10
5 LLC celler ble injisert intravenøst inn i kjønnstilpassede C57 /BL6 mus ved halevenen, 14 dager senere ble musene behandlet med PBS eller CDA-2 i 10 dager, på dag 25, ble lungene fjernet. (B) Lung svulst mangfoldighet og maksimal tumor størrelser ble bestemt av serie seksjonering på 350 mikrometer intervaller. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM, n = 5, signifikant forskjell, * p 0,05. (C) Overlevelseskurver av mus (p 0001, Log-rank test for statistisk analyse, n = 10).
(A) Lung utseende (opp) og histologi (H E flekken; ned) i Advisor inokulert C57 /BL6 mus 10 dager etter PG behandling med angitte doser. 2 x 10
5 LLC celler ble injisert intravenøst inn i kjønnstilpassede C57 /BL6 mus ved halevenen, 14 dager senere ble musene behandlet med PBS eller PG i 10 dager, på dag 25, ble lungene fjernet. (B) Lunge tumor multiplisitet og maksimal tumorstørrelsene ble bestemt som i figur 1B. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM, n = 5, vesentlig forskjell, * p. 0,05
CDA-2 Redusert spredning og apoptose i lungekreftceller
Neste, for å undersøke om CDA-2-indusert endring i lungetumorbyrden skyldes endret celleproliferasjon eller apoptose, undersøkte vi celleproliferasjon av immuno-histokjemisk analyse av Ki-67 og celle apoptose ved in situ terminal-transferase dUTP-mediert nick ende merking (TUNEL) analyse. 2 x 10
5 LLC celler ble injisert i mus og 14 dager etter slutten av 2000 mg /kg CDA-2, 800 mg /kg PG eller PBS ble administrert som beskrevet ovenfor i 5 dager. I samsvar med forandringer i lungetumorbyrden, Ki-67-positive celler var lavere i CDA-2 eller PG-behandlede tumorer i forhold til tumorer i PBS-behandlede dyr (fig. 3A). Omvendt, apoptose var signifikant oppregulert etter CDA-2 eller PG behandling, mens meget lite apoptose ble observert etter behandling PBS (fig. 3B).
(A) Tumor-bærende mus ble behandlet med 2000 mg /kg CDA- 2 eller 800 mg /kg PG i 5 dager, og lunger ble fjernet, fiksert og parafin innebygd. Parafininnstøpte tumorbærende lunge seksjoner ble undersøkt ved farging med anti-ki-67-antistoffer for påvisning av prolifererende celler. Bar = 100 mikrometer. Resultatene er midler ± SEM, n = 5, vesentlig forskjell, * p 0,05. (B) apoptotiske celler ble identifisert ved TUNEL-farging. Bar = 200 mikrometer. (C) spaltet lungetumorer ble analysert for ekspresjon av angitte proliferative og apoptotiske proteiner ved immunblotanalyse. Ekspresjonen av β-aktin ble benyttet som intern kontroll for mengden av proteiner.
Vi undersøkte noen proteiner og gener som er kjent å være involvert i celle-proliferasjon og apoptose. Svulster ble nøye microdissected bruker nåler fra lungene, lysert og undersøkt av immunoblotting. I kontrast til PBS behandlingsgruppe, ekspresjon av proteiner antiapoptotic Bcl-2, Bcl-XL, cIAP1, og Survivin var sterkt redusert i respons til CDA-2-behandling (fig. 3C). CDA-2-behandling reduserte også ekspresjonen av prolifererende cell nuclear antigen (PCNA), en annen S-fasen av cellesyklusen markør (Fig. 3C). Immunoblot-analyse av tumor lysater av mus avslørte også nedregulering av Bcl-2, Bcl-XL, cIAP1, og survivin samt PCNA i lungesvulster etter PG behandling (Fig. 3C). Disse resultatene korrelerer med de som ble observert ved analyse av Ki-67 og TUNEL.
CDA-2 hemmer NF-kB aktivering og lunge betennelse i lunge hos mus
Det er vist at NF -κB aktivering spiller en sentral rolle i regulering av inflammatoriske og immunrespons, apoptose, og onkogenese som er assosiert med inflammasjon bringtumorvekst [19], [20]. For å belyse mekanismene for tumor-inhiberende effekt av CDA-2, vi først sammenlignet med NF-kB-aktivering av kreft dissekert fra mus med CDA-2, PG eller PBS behandling. Av notatet, inneholdt resected vev svulstvev inkludert svulst og betennelsesceller. Atom ekstrakter ble utarbeidet og NF-kB aktivering undersøkt av EMSA. Som vist på fig. 4A, CDA-2-behandling minsket signifikant NF-kB-DNA-bindende aktivitet sammenlignet med kontrollgruppen etter 5 dager 2000 mg /kg CDA-2 for behandling. Viktigere, NF-kB-DNA-bindende aktivitet også ble sterkt hemmet i respons til CDA-2-behandling i alveolære makrofager av bronkoalveolar lavage fluid (Balf) (Fig. 4B). Deretter behandling med 800 mg /kg PG i 5 dager i tumorbærende mus også effektivt hemmet NF-kB-DNA-bindende aktivitet både i kreftceller og alveolære makrofager (fig. 4C). Dette resultatet tyder på at PG har lignende effekt ved inhibering av NF-kB-aktivering.
EMSA av nukleære ekstrakter isolert fra tumorceller og alveolære makrofager som viser atom binding av NF-kB etter 5 dager 2000 mg /kg CDA-2 (A og B), eller 800 mg /kg PG (C) behandling. Totalt celletall og leukocytt-populasjonen i Balf oppsamlet fra C57BL6 mus 3 eller 5 dager 2000 mg /kg CDA-2 (D) og 800 mg /kg PG (E) eller PBS behandling. Cellulær sammensetning ble bestemt ved anvendelse av Cytospin preparater. Resultatene er midler ± SEM, n = 5, vesentlig forskjell, * p. 0,05
Deretter spurte vi om CDA-2-indusert inaktivering av NF-kB i myeloide celler endrer provoserende situasjon i lungene. Vi karakterisert inflammatoriske celler og mediatorer i lungene av mus utsatt for mus kreft modell. Totalt celletall og absolutte tall av makrofager, neutrofiler og lymfocytter i Balf ble betydelig redusert 3 og 5 dager etter 2000 mg /kg CDA-2-behandling (fig. 4D) eller 5 dager etter 800 mg /kg PG behandling (fig. 4E ). CDA-2 eller PG behandling effektivt reduserte ekspresjon av forskjellige inflammatoriske cytokin og chemokin-mRNA, for eksempel Il1b, IL6, Kc, TNFa, Mip1α, og Mcp1 i lungen (Fig. 5A, B). CDA-2 eller PG behandling også redusert sekresjon av TNF-α, IL-6, og KC ved lungeceller (Fig. 5C, D). Teser resultater antydet at reduksjon av inflammatorisk reaksjon ved inhibisjon av NF-kB-aktivering, er sannsynlig å være en stor tumor-inhiberende mekanisme av CDA-2 og PG.
induksjon av inflammatorisk cytokin og chemokin-mRNA i homogenater av 3 eller 5 dager 2000 mg /kg CDA-2 (A) eller 800 mg /kg PG (B) behandlede lungene, ble målt ved hjelp av sanntids-PCR. Resultatene er midler ± SEM, n = 5, vesentlig forskjell, * p 0,05. Konsentrasjon av inflammatoriske cytokiner i Balf av 3 eller 5 dager 2000 mg /kg CDA-2 (C) eller 800 mg /kg PG (D) behandlede mus ble evaluert ved hjelp av ELISA. Resultatene er midler ± SEM, n = 5, vesentlig forskjell, * p. 0,05
CDA-2 hemmer TLR2 signalering i benmargsmakrofager
Tidligere studier har vist som Toll-lignende reseptorer (TLR’ene) -mediert aliserte favorisere aktivering av NF-kB, som fører til en pro-inflammatorisk respons [21]. For å løse enten CDA-2 inhiberte NF-kB gjennom TLR-signalreaksjonsveien, undersøkte vi uttrykket for TLR familiemedlemmer i benmarg-avledede makrofager (BMDM) som ble stimulert av serumfritt kondisjonert medium fra LLC celler (LLC-CM) . LLC-CM signifikant induserte ekspresjon av TLR2 og dens coreceptor TLR6 og CD14 (fig. 6A, B), men ikke TLR1, TLR3, TLR4, og TLR9 i BMDM (data ikke vist). Viktigere, tilsetning av CDA-2 eller PG i betydelig grad undertrykket ekspresjon av TLR2, TLR6, og CD14 på en konsentrasjonsavhengig måte (fig. 6A, B). Inkubering av BMDM med CDA-2 eller PG alene hadde ingen effekt på TLR2, TLR6, og CD14 ekspresjon (Fig. 6A, B). Disse resultatene antydet at TLR2 signiling kan fungere som mediator og bidrar til NF-kB inaktivering av CDA-2 og PG.
BMDMs ble behandlet i 24 timer med serumfritt DMEM (SFM), eller LLC-CM eller kombinasjoner med CDA-2 (A) eller PG (B). Totalt RNA ble isolert fra BMDMs, og genekspresjon ble vurdert ved real-time PCR. Resultatene er gjennomsnitts ganger endring ± SEM, n = 3, signifikant forskjell, * p. 0,05
Hemming av CDA-2 til NF-kB aktivering ble opphevet ved Over uttrykk for TLR2
For å ytterligere evaluere TLR2 signaliserer-mediert NF-kB aktivering ble regulert av CDA-2, utførte vi NFkB drevet luciferasereportergenet analysen. Rekombinante adenovirus vektorer ble generert kode TLR2 uttrykt i BMDM. TLR2 eller kontroll vektor smittet BMDM ble infisert med NF-kB luciferase reporter plasmid adenovirus. Begge infisert BMDMs behandling med LLC-CM førte til signifikante økninger i binding av NF-kB til dets DNA-konsensussekvens, som vist ved en økning i luciferase-aktivering (Fig. 7A). TLR2 infisert BMDM viste betydelige utgangsaktiveringer av denne transkripsjonsfaktor og høyere verdier av LLC-CM sammenlignet med kontrollverdiene (fig. 7A). Behandling av CDA-2 eller PG forårsaket signifikant reduksjon av LLC-CM-indusert NF-kB transaktivering i kontroll infisert BMDM, mens det ikke er noen endring på rapportøraktivitet, ved CDA-2 eller PG i TLR2-infiserte celler (fig. 7A). I samsvar med NF-kB transaktivering resultater, er disse konstruksjonene også fremstilt tilsvarende virkning på uttrykkene for TNFαand IL-6 (fig. 7B). Dermed er TLR2 uttrykk hemming av CDA-2 og dens komponent PG nødvendig for inaktivering av NF-kB i myeloide celler.
(A) BMDMs ble infisert med TLR2 og NF-kB luciferasereportergenet adenovirus konstruksjoner . 24 timer etter infeksjon, ble cellene behandlet med SFM eller LLC-CM og /eller CDA-2 eller PG som angitt. Luciferase-aktiviteter ble bestemt 24 timer etter behandlingen. Data er vist som gjennomsnitt ± SEM ganger i forhold til kontroll. n = 3, vesentlig forskjell, * p 0,05; ns, ikke signifikant. (B) induksjon av inflammatorisk cytokin mRNA i infiserte BMDMs som ovenfor beskrevet. Resultatene er gjennomsnitt ganger endring ± SEM, n = 3, vesentlig forskjell, * p 0,05; ns, ikke signifikant.
Diskusjoner
Hovedfunnet i denne studien er at CDA-2, en urin forberedelse, hemmer tumorvekst lunge via en myeloid celle mellom. CDA-2 reduserer betennelse i lungene gjennom undertrykkelse av NF-kB aktivering i myeloide celler assosiere med modulering av TLR2 signalering. Den viktigste bestanddel av CDA-2, PG, vil trolig spille en sentral rolle for å anti-tumor effekt av CDA-2.
Denne studien testet direkte viktig svulst hemmende effekt av CDA-2 ved hjelp av eksperimentell lunge tumormodeller. Tidligere studier hadde vist at CDA-2 er av potensiell verdi som middel mot kreft [3], [7]. CDA-2 er undersøkt og vist å hemme veksten av humane brystcancerceller, glioma-celler, og humane leukemiceller
in vitro
og
in vivo product: [3], [7]. Klinisk CDA-2 viste signifikante effekter i å forbedre kjemoterapi responser i glioma, hepatoma, ikke-småcellet lungekreft, og pasienter med brystkreft [7]. PG er en viktig bioaktiv bestanddel i CDA-2. Tidligere studier tyder på at PG har en potensiell tumor-inhiberende virkning, og det er også en viktig komponent i antineoplaston AS2-1, en blanding av natriumsalter av fenyleddiksyre og PG, som er en anti-tumor legemiddel [3], [22] . De foreliggende data først bekrefte at CDA-2-behandling resulterer direkte i et veksthemming av lungetumor og en forlenget levetid i mus indikerer potent anti-tumoraktiviteten til CDA-2 til å inhibere tumorvekst i en doseavhengig måte. Både spredning-hemming og apoptose-induserende effekter ble observert i lungesvulster, som demonstrert av immunhistokjemi og western blotting analyse. PG oppviser også en direkte effekt på tumorvekst lungen, og har tilsvarende resultatene av tumorinhibering som CDA-2. Disse resultatene antydet at CDA-2 kan være et potensielt terapeutisk middel for behandling av lungekreft, og PG er antatt å bidra til større bioaktiviteten til CDA-2 på grunn av høy prosent (41%) og klar tumor suppresjon virkning.
svulstens mikromiljø spiller en avgjørende rolle i startfasen og forfremmelse og inneholder immunceller og bindevev, slik som fibroblaster, endotelceller, pericytes og mesenchymale celler [23]. De hyppigst funnet immunceller i svulsten mikromiljøet er tumorassosierte makrofager (TAM). TAMs stort sett fremme tumorvekst og kan være obligatorisk for angiogenese, invasjon og metastasering av frigjøring av inflammatoriske cytokiner og chemokiner, og deres tilstedeværelse i lungekreft er korrelert med dårlig prognose av lungekreftpasienter [24], [25] og andre utfall som økt microvessel count [26]. Som deler av positive fôr fremover looper, chemokiner produsert av TMA tiltrekke seg flere immun /betennelsesceller inkludert makrofager til svulstens mikromiljø [27]. Våre data viser behandling av CDA-2 eller PG resulterer i en reduksjon av totale celler i Balf, som for det meste aktuelle makrofager, redusert betennelse. Således er det sannsynlig at CDA-2 inhiberer lungetumorvekst gjennom undertrykkelse av den populasjon av immune /inflammatoriske celler og betennelse i lungen.
Aktivering av NF-kB er ansvarlig for induksjon av en rekke målgener som er viktige for tumorigenesis [28], [29]. NF-kB-aktivering i inflammatoriske celler som styrer produksjonen av pro-inflammatoriske cytokiner, inkludert TNFa, IL-1, IL-6 og IL-23, som medierer tumorvekst og progresjon, samt NF-kB-aktivering i tumorceller [ ,,,0],8], [11]. NF-kB-aktivering er også funnet i tumorceller hvor det regulerer cellevekst, overlevelse, angiogenese, invasjon og metastase [30] – [32]. Den fremmende virkning av NF-kB-aktivering på lunge karsinogenese er allerede vist med forskjellige innfallsvinkler og rapportert av forskjellige grupper, og uttømming av myeloid celledelte eller epitelial NF-kB synes å ha en innvirkning på reduksjon av lunge tumorigenesis [9], [ ,,,0],33] – [36].
