Abstract
Bakgrunn og formål
NAD (P) H: kinonoksidoreduktase 1 (NQO1) mediert kinon reduksjon og påfølgende UDP-glukuronosyltransferaser (UGTs) katalyserte glukuronidering er den dominerende metabolismeveien av Tanshinone IIA (TSA), en lovende anti-cancer middel. UGTs er positivt uttrykt i forskjellige tumorvev og spiller en viktig rolle i den metaboliske eliminering av TSA. Denne studien tar sikte på å undersøke hvilken rolle UGT1A i å bestemme den intracellulære akkumuleringen og den resulterende apoptotisk effekt av TSA.
eksperimentell tilnærming
Vi undersøkte TSA intracellulær akkumulering og glukuronidering i HT29 (UGT1A positive) og HCT116 (UGT1A negativ) humane tykktarmkreft cellelinjer. Vi har også undersøkt TSA-medierte reaktive oksygenarter (ROS) produksjon, cytotoksisitet og apoptotisk virkning på HT29 og HCT116-celler for å undersøke hvorvidt UGT1A nivåer er direkte forbundet med TSA anticancer-effekt. UGT1A siRNA eller propofol, et UGT1A9 kompetitiv hemmer, ble brukt til å hemme UGT1A uttrykk eller UGT1A9 aktivitet.
Nøkkelresultater
Flere UGT1A isoformer er positivt uttrykt i HT29 men ikke i HCT116 cellene. Cellular S9-fraksjoner fremstilt av HT29 celler viser sterk glukuronidering aktivitet mot TSA, som kan hemmes av propofol eller UGT1A siRNA forstyrrelser. TSA intracellulær akkumulering i HT29-celler er mye lavere enn den i HCT116-celler, som korrelerer med høye ekspresjonsnivåer av UGT1A i HT29-celler. Konsekvent, induserer TSA mindre intracellulær ROS, cytotoksisitet, og apoptotisk effekt i HT29 celler enn de i HCT116 cellene. Forbehandling av HT29 celler med UGT1A siRNA eller propofol kan redusere TSA glukuronidering og samtidig forbedre sin intracellulær akkumulering, samt øke TSA anti-kreft effekt.
Konklusjoner og implikasjoner
UGT1A kan kompromittere TSA cytotoksisitet via redusere intracellulær eksponering og bytter NQO1-utløst redoks sykle til metabolsk eliminasjon. Vår studie kan kaste et lys i forståelsen av cellulær farmakokinetiske og molekylære mekanismen som UGTs bestemme kjemoterapi effekten av legemidler som er UGTs «underlag
Citation. Liu M, Wang Q, Liu F, Cheng X, Wu X, Wang H, et al. (2013) UDP-Glucuronosyltransferase 1A Kompromisser intracellulær akkumulering og Anti-kreft effekt av Tanshinone IIA i Human Colon kreftceller. PLoS ONE 8 (11): e79172. doi: 10,1371 /journal.pone.0079172
Redaktør: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: May 27, 2013; Godkjent: 20 september 2013; Publisert: 14.11.2013
Copyright: © 2013 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansielt støttet av en stiftelse for forfatteren av National Excellent doktoravhandling of China (Grant 200979), Foundation of China naturvitenskapelige universitet (Grants 91029746 og 81273586), Science Foundation i Jiangsu-provinsen Natural (Grants BK2011065 og BK2012026), og programmet for New Century gode talenter i Universitets (Grant NCET-09-0770). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
UDP-glukuronosyltransferaser (UGTs) katalyserer glukuronidering av mange lipofile endogene underlag som bilirubin og steroidhormoner, og xenobiotics inkludert kreftfremkallende og kliniske narkotika [1], [2], [3]. I de fleste tilfeller fremmer UGT-mediert metabolisme metabolsk eliminering og minsker de biologiske efficacies av substrater, selv om flere tilfeller av bioaktive er blitt observert [4], [5]. UGTs blir således betraktet som et viktig avgiftning system. Genetisk polymorfisme av UGTs forårsaker redusert enzymaktivitet har blitt forbundet med kreftrisiko, slik som kolorektal kreft, brystkreft, lungekreft, proksimale fordøyelseskanalen kreft, leverkreft, prostatakreft og [6], [7]. Alternativt kan de forbedrede enzymatisk aktivitet av UGTs representere en viktig bidragsyter til kjemoterapeutisk resistens av mange legemidler som er UGTs «substrater, slik som irinotecan, metotreksat, epirubicin, og tamoxifen [8], [9], [10], [11] , noe som tyder på en avgjørende rolle UGTs i anticancerterapi. UGTs er positivt uttrykt i ulike typer av tumor vev og celler, om enn til en forholdsvis lavere nivå sammenlignet med de tilsvarende normale vev [12], [13], [14], [15]. Selv UGTs har blitt hevdet som en viktig årsak til kjemoterapeutisk motstand, er lite kjent om direkte innflytelse av UGTs om intracellulær akkumulering i målet kreftceller og kjemoterapeutiske effekten av narkotika.
Tanshinone IIA (TSA) er en diterpene phenanthrenequinone sammensatte isolert fra tørket rot av salvie miltiorrhiza (Danshen i kinesisk), som er et mye brukt urtemedisin med velprøvde kardiovaskulære og cerebrovaskulære efficacies [16], [17], [18]. Spesielt akkumulere bevis støtter som TSA er et lovende middel mot kreft [19], [20], [21], [22]. Tidligere har vi avklart at TSA hovedsakelig elimineres via sekvensiell NAD (P) H: kinonoksidoreduktase 1 (NQO1) og UGT katalysert metabolisme [23], [24]. NQO1 katalyserer en to-elektron reduksjon av TSA produsere en svært ustabil katekol metabolitt som kan raskt glukuronideres hvis UGTs er til stede. Imidlertid, når UGTs er fraværende, kan det svært reaktive katekol mellomprodukt gjennomgår en syklus av redoks-kinon reduksjon og auto-oksydasjon, en prosess som produserer store mengder av reaktive oksygenarter (ROS). Basert på dette funnet, har vi nylig validert at NQO1 er en viktig intracellulære mål av TSA som utløser den apoptotisk død human ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler [25].
På bakgrunn av vår nylige funn at flere UGT1A isoformer er involvert i TSA glukuronidering [24], fokuserer foreliggende studie på å belyse rollen til disse UGTs i å bestemme den intracellulære akkumuleringen og apoptotiske virkning av TSA i humane tarmkreftceller. Her viste vi at TSA glukuronidering i UGT-positive cancerceller reduseres TSA intracellulær akkumulering, brøt NOQ1-utløste redoks-syklus, og følgelig redusert TSA-indusert ROS-dannelse og sin anti-kreft-effekt.
Materialer og Metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og kultur
Menneskelig tykktarmskreft cellelinjer HT29 og HCT116 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, USA). Cellene vokste i McCoys 5a (Gibco, USA) medium med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, USA), 100 U ml
-1 penicillin, og 100 mg ml
-1 streptomycin ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2. For forskjellige formål, ble cellene dyrket i 24-72 timer i medium og deretter medikamenter ble tilsatt. Trypsin (2,5%) ble brukt for celle innhøsting. Alle celler var mycoplasma gratis.
Kjemikalier og reagenser
TSA ble kjøpt fra Statens institutt for kontroll av farmasøytiske og biologiske produkter (Beijing, Kina), og forberedt til fast spredning med PEG6000 som beskrevet [26]. Propofol, 4-metylumbelliferon (4-MU), mykofenolsyre (MPA), N-acetylcystein (NAC), dikumarol (DIC), glukose-6-fosfat, glukose-6-fosfat-dehydrogenase, β-nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat (NADP) , uridin-5′-difosfat-glukuronsyre (UDPGA), D-sukkersyre 1,4-lakton, β-D-glucuronidase (Escherichia coli), chlorzoxazone, 2 «, 7»-dichlorofluorescein diacetat (DCFH-DA), og 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) ble alle oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Annexin V-FITC Apoptose Detection Kit ble kjøpt fra Bipec Biopharma Corporation (USA). Sanntid PCR primere for påvisning transkripsjoner av UGT1A1, UGT1A3, UGT1A6, UGT1A9, og UGT1A10 ble kjøpt fra Invitrogen (CA, USA). Antistoffer mot UGT1A (Abcam, USA), UGT1A9 (Abcam, USA), og GAPDH (BOOSTER biologi, Kina) ble brukt i Western blot analyse. Væskekromatografi med høy ytelse (HPLC) karakter acetonitril ble oppnådd fra Fisher Scientific (Toronto, Canada). Alle andre kjemikalier var HPLC-kvalitet eller den beste karakteren som ble kommersielt tilgjengelig.
Transient Transfeksjon av UGT1A siRNA
Transient transfeksjon ble utført ved hjelp Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens anvisninger. I korte trekk ble det Stealth RNAi siRNA (Invitrogen, USA) for UGT1A stillhet eller en negativ kontroll blandet med Lipofectamine RNAiMAX reagens i Opti-MEM I (Gibco, USA) ved en spir konsentrasjon på 20 nM, og den siRNA blandingen ble tilsatt til en passende kulturplate ved romtemperatur. Eksponentielt voksende celler ble deretter sådd ut i den transfeksjon blanding inneholdende plate. Celler ble inkubert i en inkubator (5% CO
2) ved 37 ° C i 24-72 timer.
Kvantifisering av mRNA-nivåer
Totalt mRNA ble ekstrahert fra celler, og cDNA- ble syntetisert ved PrimeScrip RT reagent Kit (Takara Biotechnology, Dalian, Kina). Kvantitativ real-time PCR ble utført ved SYBR Premiks Ex Taq II (Takara Biotechnology, Dalian, Kina) etter produsentens anvisninger. Sekvensene av primere som brukes i real-time PCR er oppført på å støtte informasjon 1 (tabell S1). PCR-betingelsene var 95 ° C i 1 minutt, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 5 sekunder, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder.
Western Blot analyse
Cellene ble høstet og totalt protein ble ekstrahert. Proteinkonsentrasjonen ble deretter bestemt ved anvendelse av BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Kina). Like mengder av protein (50 ug) ble lastet og separert ved SDS-PAGE elektroforese. Proteiner ble så overført til en PVDF-membran (Pall, USA). Blottene ble blokkert med 5% skummet melk i en TBST-buffer og inkubert i 24 timer ved 4 ° C med spesifikke primære antistoffer. Membranen ble vasket 3 ganger med TBST og deretter inkubert med HRP-konjugert sekundært antistoff (KeyGen, Nanjing, Kina) i 1 time ved 37 ° C. Signalet ble visualisert ved forsterket kjemiluminescens (ECL, Millipore). Protein uttrykk nivåer ble normalisert med GAPDH.
UGT aktivitetsanalyse
UGT aktivitet ble presentert av underlaget er glukuronidering aktivitet med celle S9-fraksjoner. Cellene ble høstet ved 2,5% trypsin og vasket i iskald PBS, homogenisert i PBS og sentrifugert ved 9000 g i 20 min ved 4 ° C for å oppnå celle-S9-fraksjoner. Proteininnholdet av S9-fraksjoner ble bestemt ved anvendelse av BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Kina). I henhold til tidligere rapporter [27], [28], ikke-spesifikk UGT1A substrat 4-MU ble anvendt for å bestemme den generelle aktiviteten av UGT1A, og MPA, som er glukuronideres primært av UGT1A9 ble anvendt for å bestemme UGT1A9 aktivitet. I korthet, 4-MU eller MPA (0,5 mM) ble inkubert i en 200 pl reaksjonsblanding inneholdende 0,1 mg (0,2 mg for MPA) celle S9-fraksjoner, 2 mM UDPGA, 1 mM sakkarinsyre 1,4-lakton, 5 mM MgCl
2, og 50 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,4) ved 37 ° C i 15 min (30 min for MPA). S9 fraksjoner ble forbehandlet med alamethicin i en konsentrasjon på 25 ug mg
-1 på is i 20 min. Etter pre-inkubering i 5 minutter ved 37 ° C ble reaksjonen startet ved tilsetning av UDPGA. Reaksjoner ble stoppet ved tilsetning av 400 ul iskald acetonitril og prøver ble sentrifugert i 10 minutter ved 20 000 g. Supernatantprøver (100 pl) ble analysert ved hjelp av en Shimadzu (Kyoto, Japan) LC-2010C HPLC-system utstyrt med en kvaternær pumpe, autosampler, kolonne ovn, og UV-detektor. Separasjonen ble utført ved hjelp av en Lunar-C18-kolonne (250 x 4,6 mm indre diameter, fem mikrometer, Phenomenex Inc., Kina) med en vakt kolonne (Phenomenex Inc., Kina). For 4-Mu, den mobile fase var acetonitril (A) og vann med 25 mM K
2HPO
3 (B) ved en strømningshastighet på 1 ml min
1; eluering ble gjennomført med følgende gradient: 15% A (0-2 min), lineær gradient fra 15% til 60% A (2-5 min), 60% til 40% A (5-8 min), og 15% en for 8-10 min, og deretter i ytterligere 5 min av ekvilibrering med kolonnetemperatur en på 40 ° C og UV-deteksjon ved 322 nm. For MPA, den mobile fase var acetonitril (A) og vann med 0,1% (v /v) eddiksyre (B) ved en strømningshastighet på 1 ml min
1; eluering ble utført med den følgende gradient: 45% (0-2 min), lineær gradient fra 45% til 80% A (2-8 min), 80% A i ytterligere 1 min, og 45% A for 9-10min og deretter i ytterligere 4 minutter for ekvilibrering med kolonnetemperatur en på 40 ° C og UV-deteksjon ved 250 nm. Nøyaktig kvantifisering av de nydannede glukuronider ble oppnådd ved å kalibrere med autentiske standarder (Sigma, USA).
Glukuronidering analysen av TSA i S9-fraksjoner
S9 fraksjonen (0,25 mg) ble inkubert med angitt konsentrasjoner av TSA i en reaksjonsblanding bestående av 2 mM UDPGA, 1 mM sakkarinsyre 1,4-lakton, 5 mM MgCl
2, og et NADPH-regenererende system inneholdende 0,2 mM NADP, 1,9 mM glukose-6-fosfat, 1,2 U ml
-1 glukose-6-fosfat dehydrogenase, og 50 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,4) i et sluttvolum på 200 ul. S9-fraksjon ble forbehandlet med alamethicin i en konsentrasjon på 25 ug mg
-1 på is i 20 minutter for å redusere ventetiden for UGT aktivitet. For enzymkinetikk-analyse, etter pre-inkubering i 5 minutter ved 37 ° C ble reaksjonen startet ved tilsetning av UDPGA og inkubert ved 37 ° C i 60 min. For propofol inhibering studium, propofol (0-400 pM) ble ko-inkubert med TSA (20 mM) ved 37 ° C i 20 min. Alle reaksjonene ble avsluttet ved iskald acetonitril, etterfulgt av sentrifugering ved 20.000 g i 10 min for å oppnå supernatantene, og deretter analysert ved HPLC-system på samme måte som beskrevet ovenfor med fremgangsmåten basert på vår tidligere rapport [24].
TSA intracellulær akkumulering og Glukuronidering i levende celler
eksponentielt voksende celler med 70% samløpet ble utsatt til 20 mikrometer TSA for 0,5, 2, 6, 24 og 48 timer. Celler og dyrkingsmedium ble samlet hver for seg ved angitte tidspunkter. Cellene ble vasket tre ganger med iskald PBS. Ultrarent vann (300 ul) ble tilsatt til hver celleprøve og frysing /tining tre ganger for å bryte cellene. Enten cellen eller kulturmedium prøve (100 pl) ble tilsatt med is-kald acetonitril (300 ul) og blandet ved sterk virvel i 5 min, fulgt av sentrifugering ved 20.000 g i 10 minutter for å oppnå supernatanten analyseres deretter ved HPLC-metoden basert på vår forrige rapport [24]. Medikamentkonsentrasjoner ble normalisert ved å bestemme proteinkonsentrasjonen av celleprøver ved bruk av BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Kina).
ROS-analysen
indikerte konsentrasjon av TSA ble administrert til cellene ved 70% løpet for en time. Da celler ble behandlet med DCFH-DA i 30 min og vasket med iskald PBS tre ganger. Cellular ROS kan snakke non-fluorescerende DCFH-DA sin fluorescerende derivat DCF. ROS-dannelse ble analysert ved å måle fluorescensintensiteten til DCF ved 535 nm (med 488 nm eksitasjon) på Synergy-H1 fluorimeter (Bio-Tek Instruments).
Cvtotoksisitetsmålinq
Celler ble sådd ut 7000 celler per brønn til en 96-brønns plate og inkubert over natten. Cellene ble deretter eksponert for de angitte konsentrasjoner av TSA. Etter 48 timer (for HCT116) eller 72 timer (for HT29), MTT (5 mg ml
-1) ble tilsatt til hver brønn, og platen ble inkubert ved 37 ° C i ytterligere 4 timer. MTT-løsning ble deretter fjernet, og 150 pl DMSO ble tilsatt per brønn. Absorbansen ved 570 nm ble målt med en mikroplateleser.
Apoptose-analysen
Celler ble sådd ut ved 2 x 10
5 /brønn i 6-brønns plate og nådde 60% konfluens etter 72 timer kultur. Da celler ble eksponert for den angitte konsentrasjon av TSA i 48 timer (HCT116) eller 72 timer (HT29) og høstet med 0,25% trypsin uten EDTA og vasket med iskald PBS. Annexin V-FITC apoptose Detection Kit (Bipec Biopharma Corporation, USA) ble brukt for å farge cellene i henhold til produsentens anvisninger. Prøvene ble analysert ved hjelp av et strømningscytometer (FACSCalibur BD, USA).
Statistical Analysis
Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter. Statistiske forskjeller mellom to grupper ble evaluert ved hjelp av t-test; for multiple sammenligninger, ble påført en enveis analyse av varians etterfulgt av Dunnet test. Forskjellen ble betraktet som signifikant på * P 0,05, ** P 0,01, eller *** P 0,001
Resultater
Flere UGT1A isoformer Positively Uttrykt i HT29 men ikke i HCT116. celler
Vi først evalueres uttrykket nivåer av UGT1A isoformer som var involvert i TSA glukuronidering av real Time PCR i både HT29 og HCT116 cellelinjer. Figur 1A viser genuttrykk mønster av UGT1A isoformer i HT29 celler. I motsetning til dette ble ingen ekspresjon av UGT1A gener påvist i HCT116-celler (data ikke vist). For ytterligere å undersøke hvilken rolle UGTs ble bestemt siRNA brukt til taushet UGT1A gener i HT29 celler. Tre par siRNAs rettet mot UGT1A sekvensen ble utformet, og det beste paret med de høyeste Silencing effekter sammen med uspesifikke siRNA som en negativ kontroll ble undersøkt. Etter siRNA transfections, ble mRNA nivåer evaluert i HT29 celler. MRNA nivåene av UGT1A1, UGT1A3, UGT1A6, UGT1A9, og UGT1A10 ble redusert med 85,8%, 31,4%, 87,5%, 66,5% og 68,2%, henholdsvis, mens de negative kontroll siRNA hadde liten effekt (figur 1A). Western blot-assay understøttet et høyt ekspresjonsnivå av UGT1A i HT29-celler, mens ingen påvisbar UGT1A protein ble observert i HCT116-celler (figur 1B). Proteinet uttrykk for total UGT1A og spesifikk UGT1A9 ble kraftig redusert med UGT1A siRNA i HT29 celler (figur 1B og 1C). Resultatene av UGT aktivitetsanalyse viste at HT29-celler besitter høy kapasitet mot glukuronidering av 4-MU, en generell UGT1A substrat, og MPA, en relativt spesifikk UGT1A9 probe. 4-MU og MPA glukuronideringsprosessen aktiviteter ble redusert med UGT1A siRNA transfeksjon med 85,6% og 57%, henholdsvis (figur 1B og 1C). I samsvar med mRNA og proteinnivåer undersøkelse ble det ikke UGT1A spesifikk enzymatisk aktivitet detektert i HCT116-celler (figur 1B).
Celler ble forbehandlet med UGT1A siRNA, ikke-spesifikk siRNA (negativ kontroll) eller vehikkel i 48 timer. (A) mRNA-nivåene av UGT1A isoformer i HT29-celler. UGT1A1 mRNA nivå av cellene med vehikkel ble tatt som en; (B) protein nivåer og enzymaktivitetene UGT1A; (C) proteinnivåer og enzymaktivitetene UGT1A9. Den totale UGT1A aktivitet ble bestemt ved å detektere hastigheten av 4-Mu glukuronidering, og den UGT1A9 spesifikke aktivitet ble bestemt ved å detektere hastigheten av MPA glukuronidering. Enzymaktiviteten ble uttrykt som nmol pr min per mg protein. En UGT1A aktivitet 0,1 nmol min
-1 mg
-1 ble ansett ikke detekterbar (ND). Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter.
Den Hemming av UGT1A Expression eller UGT1A9 aktivitet reduserer TSA Glukuronidering i HT29 Cell S9 Fraksjoner
For å få forståelse for TSA glukuronidering av tykktarm kreft celler, utførte vi enzymet kinetisk undersøkelse ved hjelp av S9-fraksjoner fremstilt av HT29 celler med eller uten UGT1A siRNA behandling. I samsvar med vår forrige undersøkelse [24], M1 og M2, et par regioisomerer av TSA katekol glukuronider, ble oppdaget fra HT29 men ikke HCT116 celle S9-fraksjoner. TSA glukuronidering vises en typisk Michaelis-Menten kinetikk (figur 2a og 2b). Kinetic parametere, inkludert den tilsynelatende K
m, maksimal hastighet (V
max), intrinsic clearance (CL
int, V
max /K
m) for M1 og M2, og summen CL
int (M1 + M2) er oppsummert i tabell 1. stanse av UGT1A isoformer av UGT1A siRNA ledet til en omtrent 10 gangers reduksjon av V
maks for produksjon av både M1 og M2, mens hadde liten innflytelse i K
m verdier. Følgelig CL
int for M1 og M2, og summen CL
int (M1 + M2) av UGT1A stillhet gruppe var tilnærmet 10 ganger lavere enn for den negative kontrollgruppe.
enzymkinetikk for dannelse av TSA glukuronider (M1 og M2) ble undersøkt i (A) celle S9-fraksjoner fremstilt fra HT29-celler forbehandlet med negativ kontroll siRNA, og (B) celle S9-fraksjoner fremstilt fra HT29-celler forbehandlet med UGT1A siRNA. (C) inhiberende effekt av propofol (0-400 uM) på TSA glukuronisering i HT29-celle S9-fraksjoner. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter.
Den hemmende effekt av propofol på TSA glukuronidering i HT29 cellefraksjoner ble også undersøkt. Som et spesifikt substrat UGT1A9 [8], propofol viste omtrentlig 25% inhibering av både M1 og M2 på 100 uM, og omkring 40% inhibering ved 400 uM (figur 2C).
UGT1A determinates TSA Akkumulering i Colon Cancer celler
For å teste om UGT1A kan påvirke TSA disposisjon i levende celler, utførte vi en mobil farmakokinetisk studie. Den dynamiske intracellulær akkumulering av TSA og dets metabolitter (M1 og M2) ble bestemt. Av interesse, det intracellulære nivået av TSA økes kontinuerlig i løpet av 48 timer etter behandling TSA i HCT116-celler. Imidlertid TSA konsentrasjon i HT29-celler nådde en topp på 6 timer og deretter dramatisk redusert (figur 3A). Arealet under kurven fra 0 til 48 timer (AUC
0-48 h) og maksimumskonsentrasjon (C
max) av TSA i HCT116 var mye høyere enn det i HT29-celler (tabell 2). Forbehandling av HT29-celler med propofol i en signifikant å øke intracellulær akkumulering av TSA. Tilsvarende UGT1A siRNA transfeksjon også økt TSA akkumulering i HT29-celler (figur 3A, tabell 2). Både M1 og M2 var detekterbare i HT29-celler ved 0,5 timer etter TSA behandling, hvilket antyder en hurtig intracellulær produksjon av glukuronider. De intracellulære nivåer av M1 og M2 nådde en topp på 6 timer og deretter redusert (figur 3B og 3C), mens nivåene av TSA glukuronider i kulturmediet samlet seg kontinuerlig i løpet av deteksjon (figur 3D og 3E). Dannelsen av M2, men ikke M1, ble redusert med enten propofol eller UGT1A siRNA transfeksjon i HT29-celler (figur 3B og 3C, tabell 2). Både propofol og UGT1A siRNA betydelig redusert dannelse av TSA glukuronider M1 og M2 i kulturmediet (figur 3D og 3E, tabell 2).
HT29-celler ble forbehandlet med UGT1A siRNA eller vehikkel i 48 timer, eller forbehandlet med propofol (100 pM) i 1 time. Deretter ble cellene eksponert for TSA (20 mM) for 0,5, 2, 6, 24 og 48 timer og prøver av både kulturmediet og cellene ble samlet opp og klargjort for HPLC-analyse. TSA og dets glukuronider (M1 og M2) ble påvist med metoden basert på vår forrige rapport [24]. (A) intracellulært TSA av HT29 eller HCT116-celler; (B) intracellulær M1 av HT29 celler; (C) intracellulært M2 av HT29-celler; (D) M1 i HT29-cellekulturmedium; (E) M2 i HT29-cellekulturmedium. Data er vist som gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter.
UGT1A Reduserer TSA-indusert ROS Formation
Vi har tidligere vist at TSA gjennomgår NQO1 stoffskiftet å produsere en svært ustabil katekol mellom som kan enten konjugert av UGTs eller spontant gått tilbake til moder TSA å danne et fåfengt redoks syklus med store mengder av ROS produksjon [23]. Videre fant vi at TSA produsert en betydelig grad av ROS i NSCLC celler, en NQO1 positiv og UGT negativ cellelinje [25]. Vi har derfor begrunnet at, i nærvær av UGT1A, kan TSA-utløste redoks-syklus settes til metabolsk eliminering og derved redusere produksjonen av ROS. For å undersøke denne hypotesen ble DCF farging analyse gjennomført for å overvåke TSA-indusert ROS formasjon. TSA indusert doseavhengig dannelsen av ROS i HCT116-celler (figur 4A). Men disse endringene i ROS dannelse ble ikke observert i HT29 celler (figur 4B). Når propofol ble brukt til å hemme UGT1A9 aktivitet i HT29 celler, ble TSA-indusert ROS nivå signifikant økt med omtrent 3,6 ganger 40 mikrometer TSA, og denne økningen ble reversert ved NAC (figur 4B). I motsetning til dette ble propofol ikke endre TSA-indusert ROS nivå i HCT116-celler, men kombinasjonen av NAC fortsatt falt TSA-indusert ROS nivå (4A). I tillegg UGT1A siRNA transfeksjon også betydelig forbedret ROS-nivå på 2,0 ganger 40 uM i HT29-celler (Figur 4C).
Celler ble forbehandlet med UGT1A siRNA eller ikke-spesifikk siRNA (negativ kontroll) i 48 timer eller forbehandlet med propofol (100 uM) /NAC (5 mM) i 1 time. Deretter ble cellene eksponert for TSA (5, 20, 40 pM) i 1 time og deretter behandlet med DCFH-DA. Fluorescensintensiteten ble målt ved hjelp av et fluorimeter. (A) HCT116-celler; (B) og (C) HT29-celler. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD av minst fire uavhengige eksperimenter (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, TSA behandling vs kontrollcellene;
# P 0,05,
# # P 0,01,
### P. 0,001, propofol /NAC forbehandling vs TSA bare, eller UGT1A siRNA forbehandling vs negativ kontroll siRNA forbehandling)
UGT1A Årsaker Resistance of Colon Cancer celler til TSA-indusert Cytotoksisitet
Overflødig ROS kan indusere forstyrrelser av intracellulær redoks homeostase, og irreversible oksidative modifikasjoner av lipid, protein, eller DNA, deretter fremme celle apoptotisk død via både død reseptor og mitokondrier-mediert trasé [29 ]. Vi har nylig bekreftet at TSA-indusert cytotoksisitet er ROS avhengig [25]. Siden tilstedeværelsen av UGT1A i HT29-celler nedsatt produksjon av ROS, foreslår at ekspresjon av gener UGT1A ville øke motstanden av kreftceller til TSA-indusert cytotoksisitet. For dette formål ble MTT-analyse utført i både HT29 og HCT116-celler. Resultatene viste at TSA produsert dramatisk cytotoksisitet i HCT116-celler som uttrykker ikke UGT1A med en IC
50 verdi på 4,5 ± 0,4 uM (figur 5A). I motsetning til dette, HT29-celler, som uttrykker rikelige UGT1A enzymer, ble det funnet meget motstandsdyktig mot TSA cytotoksisitet med en IC
50 verdi på 54,3 ± 4,7 pM (figur 5B). Forbehandling med propofol for å inhibere UGT1A9 aktivitet signifikant økt TSA cytotoksisitet i HT29-celler med en IC
50 verdi på 29,9 ± 4,5 pM (figur 5B), som ble reversert ved kombinasjonen av NAC (IC
50 80 pM) . I HCT116-celler, ble propofol-forbedret TSA cytotoksisitet ikke observert, men NAC kombinasjon forårsaket høy TSA motstand (figur 5A). Sammen tyder disse resultater at effekten av propofol i HT29-celler er fra inhiberingen av UGT1A9 og dermed fremme den intetsigende redoks-syklus av TSA. Konsekvent, UGT1A siRNA transfections forsterket også den cytotoksiske effekten av TSA i HT29 celler og betydelig redusert IC
50 verdi til 25,9 ± 5,6 mikrometer (figur 5C).
Celler ble forbehandlet med UGT1A siRNA eller ikke- spesifikk siRNA (negativ kontroll) i 24 timer, eller forbehandlet med propofol (100 uM) /NAC (5 mM) i 1 time. Deretter ble cellene eksponert for graderte konsentrasjoner av TSA (2,5 til 80 uM for HT29, 0,5 til 40 uM for HCT116) i angitt tid og MTT-analysen ble utført. (A) HCT116-celler; (B) og (C) HT29-celler. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD av minst fire uavhengige forsøk (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001)
UGT1A Kompromisser TSA-indusert apoptose av Colon. kreft~~POS=TRUNC celler~~POS=HEADCOMP
for ytterligere å utforske hvilken rolle total UGT1A og UGT1A9 i TSA-mediert anti-kreft aktivitet, ble celle apoptotisk død undersøkt av Annexin V-FITC /PI farging analysen. Når HT29-celler ble utsatt for den angitte konsentrasjon av TSA i 72 timer, det var noen påvisbare apoptotiske celler (figur 6B). Imidlertid apoptotisk død ble observert i HCT116-celler etter 48 timers eksponering TSA på en doseavhengig måte. Apoptotisk celledød var 20,7 ± 1,7%, 30,8 ± 2,4% og 48,7 ± 3,0% med TSA konsentrasjoner på 5, 20, og 40 uM, henholdsvis (figur 6A). Propofol (100 pM) i betydelig grad gjenopprettet mottakelighet av HT29-celler til TSA-indusert apoptotisk død, fra basal apoptotiske nivåene til en apoptotisk forhold på 27,8 ± 4,5%, 45,0 ± 3,5% og 53,5 ± 14,7% ved 5, 20, og 40 uM TSA, henholdsvis (figur 6B). Propofol-forbedret apoptose ble ikke observert i HCT116-celler (Figur 6A). Tilsvarende UGT1A siRNA transfeksjon øket TSA-indusert celle apoptose i HT29-celler, som karakteriserer med 16,2 ± 1,4%, 40,3 ± 4,3% og 48,5 ± 3,2% apoptotiske celler ved TSA konsentrasjoner på 5, 20, og 40 uM, henholdsvis (figur 6C ).
Celler ble forbehandlet med UGT1A siRNA eller ikke-spesifikk siRNA (negativ kontroll) i 72 timer, eller forbehandlet med propofol (100 pM) i 1 time. Deretter ble cellene eksponert for TSA (5, 20, 40 pM) for angitte tid og oppsamlet. Celler ble farget av Annexin V-FITC /PI og undersøkt av en strømningscytometri. (A) HCT116-celler; (B) og (C) HT29-celler. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, TSA behandling vs kontrollcellene;
# P 0,05,
# # P 0,01,
### P. 0,001, propofol forbehandling vs TSA bare, eller UGT1A siRNA forbehandling vs negativ kontroll siRNA forbehandling)
diskusjon
Mange anti -cancer agenter er substrater av UGTs, og av denne grunn har den funksjonelle betydningen av UGTs i forårsaker kjemoterapeutisk resistens blitt en viktig bekymring. Til tross for tidligere innsats i å ta opp dette viktige spørsmålet, er lite kjent om den direkte effekten av UGTs uttrykt i tumorvev /celler i å bestemme intracellulær akkumulering og den resulterende anticancer effekten av slike midler som er UGTs «underlag. Vi viser i denne studien at uttrykket nivået av UGT1A, og spesielt UGT1A9, er en viktig faktor i å bestemme intracellulær akkumulering og apoptotisk effekt av TSA i menneskelige tykktarmskreftceller.
Vår tidligere studie identifisert som UGT1A isoformer, inkludert UGT1A1, UGT1A3, UGT1A6, UGT1A10, og spesielt UGT1A9, er de dominerende enzymer involvert i glukuronidering av TSA følgende reduksjon sin ved NQO1. Selv om UGT2B7 kan være involvert i produksjonen av M1 og bidra til den totale glukuronidering av TSA, CL
int (M1 + M2) verdien av UGT1A9 var mye høyere enn for UGT2B7 [24]. Og i HT29-celler, er det basal ekspresjon av UGT2B7 mye lavere enn UGT1A9 (figur S1). Basert på dette funnet, var ved å stanse all UGT1A av UGT1A siRNA og hemmende for UGT1A9 av propofol undersøkt i TSA metabolisme og toksisitet i denne studien.
HT29 celler har tilstrekkelig UGT-enzymaktiviteten til glucuronidate TSA i både S9 fraksjoner og levende celler (figur 1, 2, 3).
