Abstract
fibroblast vekstfaktor-reseptorer (FGFRs) aktiveres ved mutasjon og overexpressed i blærekreft (Bachelor), og FGFr hemmere blir nå undersøkt i kliniske studier i BC pasienter. Men BC celler vise markert heterogenitet i sine svar til FGFr hemmere, og de biologiske mekanismene bak dette heterogenitet er ikke godt definert. Her brukte vi en ny inhibitor av FGFRs 1-3 og RNAi for å bestemme effekten av å inhibere FGFR1 eller FGFR3 i et panel av humane BC cellelinjer. Vi har observert at FGFR1 ble uttrykt i BC-celler som også uttrykkes av «mesenchymale» markører ZEB1 og vimentin, mens FGFR3 ekspresjon var begrenset til E-cadherin- og p63-positiv «epitelial» delsett. Følsomhet overfor veksthemmende virkninger av BGJ-398 ble også begrenset til «epiteliale» BC-celler og den direkte korrelert med FGFR3 mRNA-nivåer, men ikke med tilstedeværelse av aktiverende FGFR3 mutasjoner. I motsetning til dette ble BGJ-398 ikke sterkt hemme proliferasjon, men gjorde blokk invasjon i «mesenkymale» BC-celler in vitro. Tilsvarende hadde BGJ-398 ikke inhiberer primær tumorvekst, men blokkerte produksjonen av sirkulerende tumorceller (CTCs) og dannelsen av lymfeknute og fjernmetastaser i mus som bærer orthotopically implantert «mesenchymale» UM-UC3 celler. Sammen våre data viser at FGFR1 og FGFR3 har i stor grad ikke-overlappende roller i regulering invasjon /metastasering og spredning i distinkt «mesenchymale» og «epitel» undergrupper av menneske BC celler. Resultatene tyder på at svulsten EMT fenotype vil være en viktig faktor for de biologiske effektene av FGFr hemmere hos pasienter
Citation. Cheng T, Roth B, Choi W, Black PC, Dinney C, McConkey DJ (2013 ) fibroblast vekstfaktor reseptor-1 og -3 Spill Tydelige roller i forskrift av blærekreft vekst og metastase: Konsekvenser for Terapeutisk målretting. PLoS ONE 8 (2): e57284. doi: 10,1371 /journal.pone.0057284
Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, Taiwan
mottatt: 25 oktober 2012; Godkjent: 21 januar 2013; Publisert: 26 februar 2013
Copyright: © 2013 Cheng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av MD Anderson blære SPORE (P50 CA91846), The Baker Foundation, og MD Anderson CCSG (P30 016672). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært noen konkurrerende interesser
Innledning
Blærekreft (BC) er den femte vanligste kreftformen i vestlige land. Blærekreft kan deles inn i to hoved undergrupper som besitter tydelig patologisk, klinisk, og molekylære karakteristika [1], [2]. De fleste BCs (70% -80%) er lav karakter, ikke-muskel invasiv papillær ( «overfladiske») svulster (NMIBCs) som sjelden fremgang, slik at pasienter med denne formen for kreft har en meget god prognose. På den annen side, pasienter med muskel-invasiv kreft i urinblæren (MIBCs) har en mye dårligere prognose ( 50% 5 års overlevelse) [1], [2]. MIBCs ofte utvikle seg til å bli metastatisk, og pasienter med metastatisk sykdom har en forferdelig kamp 5-års overlevelse på mindre enn 5%. Derfor identifisere de molekylære mekanismene som er involvert i BC invasjon og metastasering og identifisering av terapeutiske strategier som er rettet mot disse prosessene er svært høy prioritet i pågående forskning.
fibroblast vekstfaktor reseptorer (FGFRs) er svært attraktiv kandidat mål i begge undergrupper av BCs [3]. I det minste to tredjedeler av NMIBCs inneholder aktiverende FGFR3 mutasjoner som resulterer i ligand-uavhengig reseptor-dimerisering og konstitutiv nedstrøms signaltransduksjon [4], [5], [6], [7], og in vitro-studier har vist at FGFR-inhibitorer blokkerer proliferasjon i normale urotelialceller som overuttrykker disse reseptorene [8], [9]. Selv om hyppigheten av aktiverende FGFR3 mutasjoner i MIBCs er mye lavere ( 25%), mange av dem uttrykker høye nivåer av FGFR3 og andre FGFRs [3], [10], [11]. I tillegg til å fremme spredning, har FGFRs vært innblandet i reguleringen av epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT), invasjon, og forankringsuavhengig vekst i BC celler [11].
BGJ-398 er en selektiv inhibitor av FGFRs 1, 2 og 3 ble syntetisert ved anvendelse av en ny kjemisk metode [12]. Det viser IC
50-tallet på ca. 5 nM mot villtype FGFRs og den mest vanlige mutante formen av FGFR3 som er uttrykt i BCs (S249C) [12]. En innledende karakterisering av den sammensatte vekstinhibitoriske effekter i et panel på 8 humane BC cellelinjer avdekket markert heterogenitet i respons, hvor det vises IC
50 s av 5-30 nM i halvparten av cellelinjene og IC
50 s av over 1 uM i den andre halvdel [12]. Den observerte heterogeniteten er i overensstemmelse med resultatene oppnådd ved anvendelse av en distinkt kjemisk inhibitor [13], men det molekylære grunnlaget for denne heterogeniteten er fortsatt uklar. Vi innledet derfor denne undersøkelsen for å få en bedre forståelse av effektene av FGFR hemming i BC celler, med mål om å identifisere biologiske mekanismer og biomarkører som kan brukes til prospektivt identifisere FGFr avhengige tumorer. Våre resultater viser distinkte, EMT-relaterte roller for FGFR3 og FGFR1 i kjøre spredning og invasjon som har viktige implikasjoner for utviklingen av FGFr inhibitor-basert terapi hos pasienter.
Materialer og metoder
Kjemi og reagenser
BGJ-398 ble sjenerøst gitt av Novartis. For in vitro-studier ble BGJ-398 rekonstituert i DMSO ved en lager-konsentrasjon på 10 mmol /l og lagret ved -20 ° C. Den BGJ-398 masse ble fortynnet i medium like før bruk, slik at konsentrasjonen av DMSO oversteg aldri 0,1%. For in vivo studier, ble BGJ-398 oppløst i 10% Tween-80.
tumorcellelinjer og kultur betingelser
Cellelinjer ble hentet fra University of Texas MD Anderson Cancer Center Blære SPORE tissue Bank, og deres identitet ble bekreftet ved DNA fingerprinting bruke AmpFlSTR® Identifiler® Amplification (Applied Biosystems) eller AmpFlSTR® Profiler® PCR Amplification (Applied Biosystems) protokoller. Alle cellelinjer ble opprettholdt som monolag i modifisert Eagles MEM supplert med 10% føtalt bovint serum, vitaminer, natriumpyruvat, L-glutamin, penicillin, streptomycin, og ikke-essensielle aminosyrer ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator .
Dyr
Kvinne atymiske nakne mus (NCR-NU) ble kjøpt fra National Cancer Institute. Musene ble holdt under patogenfrie forhold i Animal Kjerne Facility ved The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center. Anlegget har fått godkjenning fra American Association for Akkreditering av Laboratory Animal Care og i tråd med gjeldende regelverk og standarder for det amerikanske Department of Health and Human Services, USA Department of Agriculture, og NIH. Musene benyttet i disse forsøkene var 6 til 8 uker gamle.
FGFR3 Mutasjonsanalyser
DNA ble isolert fra BC-cellelinjer ved anvendelse av en genomisk DNA-ekstraksjon kit (Qiagen). PCR ble utført for å amplifisere exon 7 og 10 ved hjelp av AmpliTaq Gold-DNA-polymerase (Applied Biosystems) og primerne 5′-CGGCAGTGGCGGTGGTG- GTG-3 «(sense) og 5′-AGCACCGCCGTCTGGTT GGC-3′ (antisense) i exon 7 (23 ) og 5»-CCTCAACGCCCATGTCTTT-3 «(sense) og 5′-AGGCAGCTCAGAACCTGGTA-3» (antisense) i exon 10 (kjøpt fra Sigma Genosys). De følgende sykling variabler ble benyttet: 95 ° C i 10 min, deretter 35 sykluser med 95 ° C i 30 s, 65 ° C (ekson 7) eller 58 ° C (exon 10) i 30 s, og 72 ° C i 30 s, etterfulgt av en endelig inkubering ved 72 ° C i 10 min (23). Unincorporated primere og deoksynukleotider ble fjernet ved hjelp av reker alkalisk fosfatase og eksonuklease jeg (US Biochemical). Produktene ble analysert ved Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems), og dataene ble analysert med Sekvense Analyse 3.0 programvare (Applied Biosystems).
RNAi-mediert knockdown av FGFR3, FGFR1 eller bFGF
UM-UC14 og RT4 ble transfektert med små interfererende RNA (siRNAs) rettet mot FGFR3 og FGFR1 hjelp Oligofectamine (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Målrettede oligonukleotider (sekvens) og en ikke-måls kontroll ble kjøpt fra Ambion. Totalt RNA ble samlet 48 timer etter transfeksjon og analysert ved RT-PCR for å bekrefte mål knockdown. Parallelt ble siRNA transfekterte cellene høstet ved 48 timer og analysert ved hjelp av celleproliferasjon og cellesyklus analysene beskrevet nedenfor. UM-UC3 og UM-UC13 ble transduced med lentiviral korte hårnål RNA (shRNAs) (Åpne Biosystems). Celler ble kontinuerlig dyrket for 5~7 dager i 10% MEM inneholder puromycin. Totalt RNA ble samlet opp etter valg og analysert ved RT-PCR for å bekrefte mål knockdown. Stabile knockdown-celler ble opprettholdt i puromycin og benyttet i MTT og Boyden kammer invasjons testene beskrevet nedenfor.
immunblotanalyser
Celler ble høstet ved ca 75% til 85% konfluens og lyseres. Proteinkonsentrasjoner ble målt ved anvendelse av Bradford-analyse (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Lysater ble kokt i prøvebuffer (62,5 mmol /L Tris-HCl (pH 6,8), 10% (w /v) glycerol, 100 mmol /l DTT, 2,3% SDS, 0,002% bromfenolblått) i 5 minutter og avkjølt på is i 5 minutter. Prøvene ble separert på 8% eller 12% SDS-PAGE-geler ved 110 V i elektroforese buffer (25 mmol /liter Tris-HCl (pH 8,3), 192 mmol /l glycin, 0,1% SDS) og deretter elektroforetisk overført til metanol-forhåndsfuktet polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner i overføringsbuffer (25 mmol /liter Tris-HCl, 192 mmol /l glycin, 20% metanol) i 1 time ved 100 mV. Membranene ble inkubert i blokkeringsbuffer (TBS: 10 mmol /liter Tris-HCl (pH 8,0), 150 mmol /l NaCl, 5% fettfri melk) i 1 time ved romtemperatur under risting og deretter skylt en gang kort med TBS-T (TBS inneholdende 0,1% Tween-20). Membranene ble inkubert med primære antistoffer fortynnet 1:1000 i blokkeringsbuffer over natten, vasket og deretter inkubert med andre antistoffer (anti-mus eller anti-kanin-immunglobulin, pepperrot peroksidase-koblet F (ab) 2-fragment fra mus) fortynnet 1: 8000 i blokkeringsbuffer i 1 time ved romtemperatur under risting. Immunreaktive proteiner ble oppdaget ved hjelp av forbedret kjemiluminescens (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) i henhold til produsentens instruksjoner.
genekspresjonsanalyse
Gene uttrykk profilering ble utført på et panel av 30 humane BC cellelinjer hjelp av Illumina plattform. For hver cellelinje, ble mRNA generert fra én log-fase-kultur. RNA renhet og integritet ble målt ved anvendelse av et Nanodrop ND-1000 og en Agilent Bioanalyzer, og høy kvalitet RNA ble brukt for cRNA forsterkning. Biotin-merket cRNA ble utarbeidet etter den Illumina RNA forsterkning kit (Ambion, Inc., Austin, TX), og forsterket cRNA ble hybridisert til Illumina HT12 V4 chips (Illumina, Inc., San Diego, California). Etter at de ble vasket, ble platene skannet med iscan (Illumina, Inc.). Signalintensiteter ble kvantifisert med GenomeStudio (Illumina, Inc.), og quantile normalisering ble anvendt for å normalisere dataene. BRB ArrayTools versjon 4.2 er utviklet av National Cancer Institute [14] ble brukt til å analysere dataene. Å observere uttrykk mønstre av forskjellig uttrykte gener, spesifikke genuttrykk verdier, justert til et gjennomsnitt på null, ble brukt for clustering med Cluster og Utforsker [15].
MTT Analyser
Cells ( 5 x 10
3) ble sådd ut i 96-brønners plater og tillatt å holde seg i 24 timer før de ble inkubert med eller uten økende konsentrasjoner av BGJ-398 i 48 timer eller 5 dager. MTT (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) analyser ble anvendt for å måle relative celletall basert på omdanning av MTT til formazan i levedyktige celler. Femti pl MTT oppløst i PBS (50 ug /ml) ble tilsatt til hver brønn og platene ble inkubert i 3 timer. Mediet ble deretter fjernet, og 100 ul DMSO ble tilsatt til hver brønn for å lysere cellene, og oppløseliggjøre den formazan. En standard mikroplateleser ble brukt til å bestemme absorbans (600 nm). Hver eksperimentelle data punkt representerer gjennomsnittsverdier innhentet fra seks gjentak og hvert forsøk ble utført minst to ganger.
Sanntids revers transkriptase PCR analyser
Celler ble høstet på 75% til 85% samløpet og total RNA ble isolert ved hjelp av Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion, Life Science, CA). FGFRs og andre gener steder ble analysert ved Taqman-basert real-time PCR (ABI PRISM 7500, Applied Biosystems). Den komparative CT-metoden ble brukt for å bestemme relativ genekspresjon for hvert mål-genet; den cyklofilin A-genet ble benyttet som intern kontroll for å normalisert mengden av forøkbare RNA. TAQMAN primere ble kjøpt fra produksjon (Applied Biosystems, CA) som følger: E-cadherin; Hs00170423_m1, TP63; Hs00978343_m1, ZEB1; Hs00232783_m1, vimentin; Hs00185584_m1, FGFR1; Hs00915142_m1, FGFR2; Hs01552926_m1, FGFR3; Hs00179829_m1, FGFR4; Hs01106908_m1, bFGF; Hs00266645_m.
Cell Cycle Analyser
Celler ble sådd ut i 6-brønners plater og vedlikeholdt i 10% FBS MEM i 24 timer. Cellene ble deretter eksponert for forskjellige konsentrasjoner av BGJ-398 i 48 timer og dyrket i 24 timer til (nådde ca 75% til 85% konfluens) for å analysere virkningene av FGFR3 eller FGFR1 knockdown. Cellene ble høstet ved trypsinering og pelletert ved sentrifugering. Pelletene ble deretter resuspendert i PBS inneholdende 50 ug /ml propidiumjodid, 0,1% Triton X-100 og 0,1% natrium-citrat. Propidiumjodid- fluorescens ble målt ved fluorescens-aktivert celle sortering (FL-3 kanal, Becton Dickinson, Mountain View, CA) ved hjelp av instrumentet syklus analyse programvare.
Boyden Chamber Invasion Analyser
Invasion kamre inneholdende Matrigel-belagte polyetylentereftalat membraner med 8 um porer ble innkjøpt fra BD Science i et 24-brønners plateformat. Celler (2,5 x 10
5) ble frigjort fra vevskulturkolber ved hjelp av EDTA (1 mmol /L), sentrifugert, suspendert i et serumfritt medium og plassert i de øvre avdelinger av invasjons kamre. Tretti prosent føtalt bovint serum medium ble plassert i de nedre rom som en kjemoattraktant og invasjons analyser ble utført i 48 timer. Hver cellelinje ble belagt i tre eksemplarer. For å undersøke celle invasjon etter eksponering for BGJ-398, celler som ikke hadde invadert ble fjernet, og cellene på den nedre overflate av filteret ble farget med Diff-Quick (American Scientific Products, McGaw Park, IL). Invasiv aktivitet ble målt ved å telle cellene som hadde migrert til den nedre side av filteret. For å evaluere invasjon etter stanse FGFR1 eller bFGF, ble membranene fjernet etter inkubering i 48 timer ved 37 ° C og farget i propidiumjodid (Sigma-Aldrich) uten å fjerne cellene fra de øvre overflatene av membranene. Filtrene ble montert på objektglass og analysert ved konfokal mikroskopi ved 100 x forstørrelse. Enes plan fokus ble justert slik at cellene som ikke hadde invadert kunne skjelnes fra den invaderte celler og telles i 8 uavhengige felter. Invasiv aktivitet ble målt ved å beregne prosenter av invadert til noninvaded celler.
Archorage Uavhengig Vekst analysen
UM-UC3 og UM-UC13 villtype eller bFGF /FGFR1 forstummet celler ble sådd på 1 × 10
4 celler per brønn i 6-brønn-skåler supplementert med 10% FBS MEM inneholdende 0,6% agar. Celler ble tillatt å vokse i 2 uker. Bilder ble ervervet ved hjelp av et Olympus IX invertert-fasekontrastmikroskop. De totale antallet kolonier pr tilfeldig view (100 ×) og gjennomsnittlig diameter på kolonier pr tilfeldig view (100 ×) ble bestemt ved hjelp av en SliderBook bilde analysator.
ortotopiske xenograft Eksperimenter
Den menneskelige BC cellelinje UM-UC-3 ble transdusert med en lentiviral vektor som koder for luciferase (luc) og rødt fluorescerende protein (RFP; mCherry) som tidligere beskrevet [16]. Etter stabil transduksjon med luc-RFP reporter ble cellene sortert etter fluorescens Activated Cell Sortering (FACS) ved hjelp av en Tilstrømningen Internett-tilgang sorter (BD Biosciences). Luciferase-aktivitet ble kvantifisert in vitro ved anvendelse av D-luciferin (150 ug /ml), og IVIS Bioluminescens systemet (Xenogen Co.). For å fremstille tumorer i nakne mus, ble subsammenflytende kulturer av merket UM-UC3 løftes med trypsin, blandet med 10% FBS MEM, sentrifugert ved 1200 rpm i 5 min, vasket i PBS og resuspendert i HBSS. Cellene ble deretter injisert orthotopically inn i blæreveggen ved en konsentrasjon på 5 x 10
5/50 pl ved anvendelse av en lavere laparotomi. Mus med metastaser ble avlivet 5 til 8 uker etter tumorcelle-injeksjon ble det lymfeknute og fjernmetastaser skåret ut, skåret opp i små biter ved hjelp av skalpeller, eksponert for 1% trypsin i 20 minutter, sentrifugert (1200 rpm i 5 minutter), og dyrket i 10% supplert MEM. Etter FACS sortering, de resirkulerte cellene ble subconfluently dyrket og injisert i en konsentrasjon på 2 x 10
5/50 ul HBSS som beskrevet ovenfor. Således ble tumorcelle resirkulering utført tre ganger for å velge et høyt metastatisk UM-UC3 subpopulasjon som utvikler metastaser i ca 75% av musene. For vårt eksperiment terapi, injiseres vi 4
th syklus av resirkulert UM-UC3 ved en konsentrasjon på 2 x 10
5/50 ul. Mus med påvisbare tumorvekst på tidspunktet for den første imaging (5 dager etter injeksjon) ble randomisert i to grupper (n = 7 /gruppe).
In vivo Bioluminesens Imaging
Bioluminesens bildebehandling var gjennomført på en IVIS 100 imaging system med Levende bilde programvare (Xenogen) som beskrevet andre steder [16]. I korte trekk, ble dyrene bedøvet før avbildning med en 2,5% isofluran /luftblanding og injisert s.c. med 15 mg /ml av luciferin kaliumsalt i PBS i en dose på 150 mg /kg kroppsvekt. En digital grå-skala dyr bilde ble kjøpt og pseudocolored bildet ble kledde representerer den romlige fordelingen av påviste fotoner som kommer ut av aktiv luciferase. Signalintensitet ble kvantifisert som summen av alle oppdagede fotoner innenfor regionen av interesse per sekund, separat teller hver primærtumor og hver metastatisk nettstedet.
Innsamling av primærtumor og Sirkulasjonstumorceller (CTCs)
Førti dager etter injeksjon, da dyrene i kontrollgruppen ble døende mus ble bedøvet med isofluran, som beskrevet ovenfor. For å måle antallet CTCs, den maksimale mengde av blod (600-1200 ul) ble oppsamlet ved hjertepunksjon ved anvendelse av 1 ml sprøyte, 22 gauge nål, og heparin-belagte prøverør som tidligere beskrevet [17]. Musene ble deretter avlivet med karbonmonoksid. Svulster ble skåret ut, og prøver ble enten fiksert formalin og innstøpt i parafin, innstøpt i OCT (Miles, Inc.), eller frosset raskt i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C for RNA og protein utvinning. For ytterligere behandling av blodet, var røde blodcellene lysert to ganger i 5 minutter med 1 ml ACK lyseringsbuffer (Invitrogen), og sentrifugert i 5 minutter ved 1200 rpm i Eppendorf-rør. Pelleten ble endelig lysert og bearbeides videre for total RNA isolering bruker Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion, Life Science). For Real-time PCR-analyse, PCR-teknologi (trinn en, Applied Biosystems) ble brukt sammen med TaqMan® genuttrykk Analyser (Applied Biosystems). Absolutt mengdebestemmelse ble brukt til å generere syklus terskel (CT) verdier for human spesifikke HLA-C-primer (Hs00740298_g1) for hver prøve. RT-PCR-analyse av de blodprøver (i tre paralleller) ble kjørt sammen med standard-isolater (0, 2, 20, 200, 2000 og 20.000 UM-UC3 celler i 100 ul museblod). CT verdier av standardene ble brukt til å lage en standardkurve for UM-UC3 CTC, og antall CTCs av hver blodprøve ble beregnet deretter.
Resultater
Forholdet mellom E-cadherin og bFGF /FGFR Expression i UC Cells
Vi analyserte uttrykket av de 4 FGFRs og den dominerende kreft-assosiert ligand (FGF-2 /basic FGF) på mRNA-nivå i et panel på 30 UC cellelinjer av hele genom uttrykk profilering (Illumina plattform). Ekspresjon av FGFR3 direkte korrelert med ekspresjonen av p63 [18], [19] og E-cadherin [20] (fig. 1A), noe som indikerer at FGFR3 er uttrykt ved «epithelial» undergruppe av BC-celler. Motsatt uttrykk for FGFR1 korrelert mer direkte med «mesenchymale» markør vimentin (Fig. 1a). Vi brukte kvantitativ real-time revers transkriptase PCR (RT-PCR) for mer nøyaktig å definere mønstre av ekspresjon av «epiteliale» og «mesenchymale» markører på tvers av panelet av cellelinjer. Resultatene er vist i figur 1 B, hvor vi organisert BC-cellelinjer i alt av panelene i henhold til deres relative ekspresjon av den kanoniske «epiteliale» markør E-cadherin (fig. 1B, øvre venstre panel) [20]. Uttrykket av E-cadherin direkte korrelert med uttrykk av p63 og omvendt med uttrykk av ZEB1 og vimentin, viser at de «epitel» og «mesenchymale» markører er uttrykt i en stor grad ikke-overlappende måte i BC linjer (Fig. 1B) . Bare to av de cellelinjer (1A6 og UM-UC18) co-uttrykk «epitel» og «mesenchymale» markører (Fig. 1B).
A. Korrelasjon av FGFR1 og FGFR3 med kanoniske EMT markører. mRNA-nivåer ble målt ved anvendelse av hele genomet mRNA-ekspresjon profilering (Illumina plattform). Varmen kartet viser uttrykk for FGFR1, FGFR3, FGF2 (bFGF), p63 (TP63), E-cadherin (CDH1), Slug (SNAI2), og vimentin. B. Kvantitativ analyse av EMT markør uttrykk. Relative nivåer av «epitelceller» markører E-cadherin (CDH1) og p63, og «mesenchymale «markører ZEB1 og vimentin ble målt ved hjelp av kvantitativ sanntids RT-PCR.
så målt uttrykk av FGFRs 1-4 og FGF-2 av kvantitativ RT-PCR (fig. 2A). Bekrefte genuttrykk profilering resultater, ble FGFR1 uttrykt hovedsakelig av celler i «mesenchymale» undergruppe (UM-UC3, UM-UC13, T24, BV og UC12) (Fig. 2A øverst til venstre), mens FGFR3 uttrykk ble konsentrert innenfor » epitel «celler, med RT4 å ha det høyeste uttrykk etterfulgt av UM-UC14, SW780 og RT112 (fig. 2A, øverst til høyre). FGFR2 også ut til å bli noe beriket i «epithelial» og FGFR4 i «mesenkymale» celler, henholdsvis, men deres nivåer av uttrykk var mye lavere enn nivåene av FGFR3 eller FGFR1 (gjennomsnitt av 36 sykluser versus 30 sykluser av PCR), i overensstemmelse med tidligere funn [10]. Til slutt, de «mesenchymale» celler uttrykte høye nivåer av FGF2 (bFGF) enn de «epiteliale» celler (Fig. 2A). Vi har bekreftet at FGFR3 ekspresjon ble anriket i «epiteliale» og FGFR1 og bFGF ekspresjon ble anriket i de «mesenkymale» cellelinjer på proteinnivå ved immunoblotting (Fig S1). Bruke nonparametric korrelasjon analyser, vi bekreftet at FGFR3 uttrykk korrelert sterkt og direkte med uttrykk av E-cadherin (Spearman r = 0,8155, p 0,0001, figur 2B.) Og omvendt med uttrykk av «mesenchymale» markører (Fig S2.). Omvendt, ekspresjon av FGFR1 og bFGF sterkt og direkte korrelert med ekspresjonen av ZEB1 (Spearman r = 0,799; p = 0,0001 for FGFR1 og r = 0,6198, p = 0,008 for bFGF) (Fig. 2B). I tillegg bFGF og FGFR1 uttrykk korrelert direkte med hverandre som forventet (fig. 2B). Vi deretter undersøkt hvorvidt de observerte forskjeller i mRNA-ekspresjon omregnet til differensial ekspresjon på proteinnivået i en undergruppe av cellelinjer ved immunblotting. Vi fant ut at FGFR3 men ikke FGFR1 ble uttrykt i epiteliale UM-UC14, RT4 og RT112 celler, mens FGFR1 men ikke FGFR3 ble uttrykt i mesenchymale UM-UC3, UM-UC12 og UM-UC13. FGF-2 var uttrykt i alle 6 cellelinjer, men mesenchymale celler uttrykte mer FGF-2 enn den epiteliale «celler gjorde. Sammen utgjør disse dataene støtter ideen om at FGFR3 og bFGF /FGFR1 sannsynligvis fungere i ikke-overlappende epiteliale og mesenkymale undergrupper av BC celler.
A. Uttrykk for FGFRs 1-4 og bFGF i forhold til E-cadherin uttrykk. De relative mRNA-nivåer ble målt ved hjelp av kvantitativ sanntids RT-PCR. Cellelinjene i hvert panel er organisert ved relativ E-cadherin uttrykket (lav til høy, fra venstre mot høyre, se figur 1B.). B. Scatterplots skildrer forholdet mellom FGFR1, bFGF, FGFR3, og EMT markør uttrykk. Nonparametric korrelasjon analyser ble brukt for å vurdere forholdet mellom FGFR3 og E-cadherin (CDH1) uttrykk, FGFR1 og ZEB1 uttrykk, bFGF og ZEB1 uttrykk, og bFGF og FGFR1 uttrykk. Korrelasjonskoeffisienter og p-verdiene er vist på figuren.
Effekter av BGJ-398 på Cell Proliferation
Tidligere studier konkludert med at FGFr hemmere blokkere spredning i noen menneskelige BC celler in vitro [ ,,,0],12], [13]. Vi testet derfor virkningene av BGJ-398 på proliferasjon i 17 BC cellelinjer for å karakterisere graden av heterogenitet i medikamentsensitivitet. Vi inkuberte cellene med økende konsentrasjoner av BGJ-398 i 48 timer og målte cytotoksisitet og vekststans ved hjelp av MTT-analyser. Vi identifiserte 5 cellelinjer (UM-UC14, SW780, RT4, RT112 og UM-UC1) som var narkotika-sensitive som definert av ≥50% veksthemming hos legemiddelkonsentrasjoner av 1 mikromol /l eller lavere (Fig. 3A venstre panel og data ikke vist). For å bestemme de relative bidrag fra vekst arrestasjon og celledød til disse effektene, utsettes vi UM-UC14 og RT4 celler til økende konsentrasjoner av BGJ-398 i 48 timer og direkte målt cellesyklus og apoptose ved propidiumjodidfarging og FACS analyse. I begge cellelinjer økende konsentrasjoner av BGJ-398 produsert økninger i prosentandelen av celler i G1 fase og parallelle reduksjoner i prosentandelen av celler i S-fasen. Nærmere bestemt prosentandelen av celler i G1 fase økte fra 47,5% og 54% til 74,2% og 69,1%, mens prosentandelen av celler i S-fase ble redusert fra 33,5% og 25% til 2,7% og 8,8% i BGJ-398- eksponerte UM-UC14 og RT4 celler, henholdsvis (fig. 3A). På den annen side, BGJ-398 ikke indusere apoptose i noen cellelinje i konsentrasjoner under 10 um (data ikke vist). Derfor utøver BGJ-398 primært cytostatisk effekt på BC celler in vitro.
A. Effekter av BGJ-398 på celleproliferasjon i narkotika-sensitive celler. I venstre panel, ble celler inkubert i 48 timer i nærvær av de angitte konsentrasjoner av BGJ-398 og celleveksten ble målt ved MTT-reduksjon. Gjennomsnitt ± SEM, n = 6. i sentrum og høyre panel, UM-UC14 eller RT4 celler ble inkubert med de angitte konsentrasjoner av BGJ-398 og prosenter av cellene i hver celle syklus kvadrant ble kvantifisert ved propidiumjodidfarging og FACS analyse . Gjennomsnitt ± SEM, n = 3. B. Følsomhet til de anti-proliferative effekter av BGJ-398 korrelerer med FGFR3 uttrykk, men ikke med tilstedeværelse av aktiverende FGFR3 mutasjoner. Nivået av veksthem observert etter 48 timers eksponering til en pM BGJ-398 (som målt i MTT-analyser) ble korrelert med den relative grad av FGFR3 (venstre panel) eller FGFR1 (høyre panel) mRNA-ekspresjon i et panel av 17 humane BC cellelinjer .. C. Effekter av FGFR3 knockdown på celleproliferasjon. Venstre panel: UM-UC14 eller RT4 celler ble transient transfektert med enten ikke-targeting (NT) eller FGFR3 spesifikke sirnas og cellevekst ble målt til 48 timer ved MTT reduksjon. Gjennomsnitt ± SEM, n = 6. senter og høyre panel: UM-UC14 eller RT4 celler ble transient transfektert med enten ikke-målsøkende (NT) eller FGFR3-spesifikke sirnas og prosentandelen av celler i løpet av hver fase av cellesyklusen ble kvantifisert ved propidium iodide flekker og FACS analyse. Gjennomsnitt ± SEM, n = 3. Nedre panel: effektiviteten av FGFR3 lyddemping ble målt med kvantitativ RT-PCR og immunoblotting
Vi deretter undersøkt forholdet mellom BGJ-398 følsomhet og tilstedeværelse av aktiverende. FGFR3 mutasjoner. Ved hjelp av exon sekvense vi identifisert 5 cellelinjer innenfor vårt panel som inneholdt aktivering FGFR3 mutasjoner (UM-UC6, UM-UC14, UM-UC15, UM-UC16 og UM-UC17) (Fig. S3). Påfallende, bare ett av de FGFR3-mutant cellelinjer (UM-UC14) var også BGJ-398 sensitive. På den annen side, ble det observert en god korrelasjon mellom FGFR3 mRNA-ekspresjon og medikamentsensitivitet (Spearman r = 0,7247 p = 0,01) (fig. 3B venstre panel), mens det ikke var noen korrelasjon mellom sensitivitet til BGJ-398 og FGFR1 uttrykket (Spearman r = -0,2931 p = 0,2536) (fig høyre panel). 3B.
Gitt den ikke-overlappende mønstre av FGFR1 og FGFR3 uttrykk, resultatene antydet at FGFR3 spiller en viktigere rolle enn FGFR1 i kjøre proliferasjon human BC celler. Til mer direkte teste denne hypotesen, brukte vi RNAi å slå ned FGFR1 eller FGFR3 i BGJ-398-sensitive UM-UC14 og RT4 celler og målte effekten på celleproliferasjon ved hjelp av MTT-analyser. Kvantitativ RT-PCR avslørte knockdown effektivitet på 50% og over 80% i RT4 og UM-UC14-celler transfektert med FGFR3 spesifikk sirnas, henholdsvis sammenlignet med celler transfektert med den ikke-spesifikke siRNA kontroll, og disse resultater ble også bekreftet ved proteinnivå ved immunoblotting (fig. 3C nedre panel). De tilsvarende virkning på celleformering var svært like, ved at proliferasjonen ble redusert med nesten 50% i RT4 celler og med over 80% i UM-UC14 transfektert med FGFR3 siRNA (fig. 3C venstre panel). Cellecyklus-analyser bekreftet at FGFR3 knockdown økte prosentandelen av celler i G1 fase og reduserte fraksjoner av cellene i S-fasen (fig. 3C sentrum /høyre panel), i samsvar med MTT-resultatene og de tidligere observerte effekter av BGJ-398 [ ,,,0],12]. I kontrast, knockdown av FGFR1 hadde ingen signifikant effekt på spredning (Fig. S4).
Effekter av BGJ-398 på Invasion
Selv om «mesenchymale» UM-UC3 og UM-UC13 celler uttrykt relativt høye nivåer av FGFR1, de var resistente mot anti-proliferative effekter av BGJ-398 (fig. 4A venstre panel). Fordi invasjon, migrasjon, og metastase er karakteristiske trekk ved «mesenchymale» kreftceller [20] undersøkte vi effekten av BGJ-398 på invasjonen i UM-UC3 og UM-UC13 celler, ved hjelp av to «epitel», BGJ-398 -resistente cellelinjer (UM-UC6 og UM-UC9) som kontroller. Vi utsettes cellene for økende konsentrasjoner av BGJ-398 og målt invasjon ved bruk av modifiserte Boyden kammere.
