Abstract
Normal funksjon av human leukocytt antigen klasse I (HLA-I) og antigen prosessering maskiner (APM) proteiner er nødvendig for T-celle-mediert anti-tumor eller antiviral immunitet, mens tumor overlevelse indikerer en svikt i verten i immunovervåkning assosiert med dysfunksjon i antigenpresentasjon, hovedsakelig på grunn av deregulering i HLA -Jeg og APM uttrykk eller funksjon. Den posttranskripsjonelt regulering av HLA-I og APM uttrykk kan assosiere med epigenetiske endringer i kreftutvikling som ikke ble beskrevet så langt. Her viste vi at utviklingen av cervikal intraepitelial neoplasi (CIN) og livmorhals plateepitelkarsinom (CSCC) i uigurske kvinner ble akkompagnert med delvis eller totalt tap av protein uttrykk av HLA-I, SS2-m og APM komponenter, inkludert transporter forbundet med antigen prosessering (TAP1 /2), lav molekylvekt protein (lMP2, LMP7), endoplasmatiske retikulum aminopeptidase 1 (ERAP1), anstand molekyler omfatte calreticulin (CLR), calnexin (CNX) og ERp57, og dette ble bevist på nytt ved analyse av transkripsjon av de samme genene i tillegg til tre gener HLA-A, B og C som koder for HLA-i. Ved bisulfite sekvensering tilnærming, identifiserte vi målet CpG øyer metylert ved genet promoter-regionen i TAP1, TAP2, LMP7, tapasin og ERp57 i livmorhalskreft celler. Videre analyser av CpG stedsspesifikke metylering av disse genene i tilfeller av CSCC og CIN demonstrerte en invers korrelasjon av endret CpG island metylering av TAP1, LMP7, og ERp57 med endringer i protein uttrykk. Videre promoter metylering av disse genene var betydelig høyere i de tilfeller som var positive for humant papillomavirus 16 (HPV 16) enn negative. Våre resultater antydet at epigenetiske modifikasjoner er ansvarlig for avvikende uttrykk for visse HLA-I og APM gener, og kan bidra til å forstå unrevealed mekanismer for svulst flukt fra immun overvåking i livmorhalskreft
Citation. Hasim A, Abudula M, Aimiduo R, Ma JQ, Jiao Z, Akula G, et al. (2012) Post-Transkripsjonell og epigenetiske Regulering av Antigen Processing Machinery (APM) Komponenter og HLA-I i livmorhalskreft fra Uighur kvinner. PLoS ONE 7 (9): e44952. doi: 10,1371 /journal.pone.0044952
Redaktør: Torbjörn Ramqvist, Karolinska Institutet, Sverige
mottatt: 20 januar 2012; Akseptert: 14. august 2012; Publisert: 14. september 2012 |
Copyright: © Hasim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med midler fra Xinjiang Uighur autonome region Fund (2009211B14) og Natural Science Foundation National of China (81060164). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
dannelsen og overlevelse av en svulst celle er et tegn på vellykket immun flukt og en svikt i vertens immunovervåking og eliminering. Normal funksjon av human leukocytt-antigen klasse I (HLA-I) og antigen prosessering maskiner (APM) er en forutsetning for T-celle-mediert medfødte og ervervede immunresponser mot virusinfeksjon eller cellulær karsinogenese [1] – [3]. HLA-I er en sentral aktør og arbeider sammen med APM medlemmer i montering, lasting, og presentere endogene antigene peptid samt regulere cellulære og humorale immunitet [4] – [5]. Således eliminering av tumorceller av immunsystemet i stor grad er avhengig av ekspresjonen av APM og HLA-I.
I de senere år har vært gjort fremskritt i forståelsen av hvordan peptidene som presenteres av HLA-I-molekyler. Spesielt er det kjent som proteaser som er involvert, og hvor intracellulære reaksjonsveier påvirker antigen-presentasjon i profesjonelle antigen-presenterende celler og i ulike typer av ondartet sykdom [6] – [8]. APM av cellen er et komplekst system av samvirkende proteiner, inkludert proteasomer subenheter, med lav molekylmasse proteiner 2 og 7 (lmp2 og LMP7), transportører er forbundet med antigenprosessering 1 og 2 (TAP1 og TAP2), endoplasmatiske retikulum aminopeptidase 1 (ERAP1), og det ER chaperonproteiner calnexin, calreticulin, og tapasin. I tillegg, tiol oksidoreduktase ERp57 er ansvarlig for presentasjon av HLA-I-peptid-komplekser på celleoverflaten og er avgjørende for gjenkjennelse av virusinfiserte eller malignantly transformerte celler, vedlikehold av selv-toleranse, og overvåking av nylig oppstår tumorer av immunsystemet [ ,,,0],9]. Nedregulering av HLA-I og APM komponenter har blitt observert i mange svulster og er nært forbundet med svulst immunoevasion, vekst og metastatisk evne [6] – [8]. De molekylære mekanismer som ligger til grunn av det relativt lave nivå av transkripsjon av HLA-I og APM komponenter i kreftceller er i stor grad uforklarlig. Epigenetiske modifikasjoner av det menneskelige genom, inkludert avvikende DNA metylering, representerer kreft genetisk hendelser som er funksjonelt likeverdig med genetiske endringer. Nedregulering av HLA-I ekspresjon forårsaket av hypermethylation av HLA-I-genene er blitt dokumentert i esophageal platecelle karsinom, kolonkarsinom, og melanomcellelinjer, og dette kan bli reversert ved behandling med DNA-metyltransferase-inhibitorer [10] – [11].
Humant papillomavirus (HPV) infeksjon spiller en sentral rolle i patogenesen av livmorhalsen (CIN) og livmorhalskreft med HPV-infeksjon anses å være en nødvendig, men ikke alltid tilstrekkelig, føre [12]. Utvikling av menneskelige livmorhalskreft uten involvering av en spesifikk HPV er enestående, og det er allment akseptert at i tillegg til HPV-infeksjon, andre kofaktorer, inkludert endogene hormoner, genetiske faktorer som HLA-I, og andre forhold knyttet til vertens immunrespons kan ha viktige roller i utviklingen av livmorhalskreft [13].
livmorhalskreft i Uighur har skjedd med høy sykelighet og dødelighet kvinner i Xinjiang-regionen og regnes som en høy hendelsen sykdom i regionen i Kina [14]. HPV-infeksjon er antatt å være den viktigste årsaken til livmorhalskreftutvikling, og infeksjon av virus, spesielt høy risiko HPV påvises i uigurske kvinner med livmorhalskreft med en hastighet sammenlignbart med andre bestander i og utenfor Kina [15] . Våre tidligere studier har vist at tendensen i tap frekvensen av HLA-I protein uttrykk var sammenlignbare for både kvinner fra Uighur og Han etniske grupper i livmorhalskreftutvikling, men det totale tapet av HLA-I i prøver fra livmor plateepitelkarsinom (CSCC) og dets forstadier (CIN II eller III) var høyere i uigurske kvinner (27% og 53%, henholdsvis) enn i Han-kvinner (18% og 37%, henholdsvis) [16]. Det virker som etniske forskjeller kan ha, til en viss grad, innflytelse på tumorutvikling på grunn av ulik genetisk bakgrunn, levevaner eller geografiske miljø. Derfor, med tanke på at avvikende overflate ekspresjon av HLA-I i livmorhalskreft forbundet med høy risiko HPV16 infeksjon ofte forårsaket av fraværet av APM [17] – [18], som man kan spørre om epigenetiske modifikasjoner vil modulere overflate-ekspresjon av HLA- jeg direkte eller indirekte av stanse eller inaktive av APM komponent gener og føre til utvikling av livmorhalskreft i uigurske kvinner.
i denne studien har vi fokusert på 10 kandidat gener tilhører HLA-i og APM familie, analysert sammenslutning av kreftutviklingen med endret genekspresjon på ulike nivåer, inkludert genet promoter metylering, transkripsjon og protein uttrykk. Disse dataene gir innsikt i ukjente mekanismer for cervical karsinogenese i forhold til reguleringen HLA-I og APM ekspresjon, og kan tilveiebringe med molekylær markør profil for tidlig diagnose basert på påvisning av epigenetiske modifikasjoner og ekspresjon av disse genene. I tillegg gir denne studien videre forståelse av virkningen av HLA-I mediert antigen presentasjon i antiviral eller anti-tumor immunitet eller unormalt forårsaket av, eller som fører til, cervical kreftutvikling.
Materialer og Metoder
Kliniske Kjennetegn og vevsprøver
Fersk eller formalinfiksert og parafininnstøpte cervikale vevsprøver ble samlet inn fra Uighur kvinner med livmorhals plateepitelkarsinom (CSCC) og livmorhalsen (CIN), eller uten livmorhalssykdommer , men behandlet av hysterektomi. Alle livmorhalskreftpasienter henvist mellom juni 2009 og mars 2010 på grunn av livmorhalskreft ble bedt om å delta i vår studie under sitt første besøk til Institutt for gynekologi av First Affiliated Hospital i Medical University of Xinjiang. Informert samtykke ble oppnådd fra alle pasienter og kontroller som deltok i denne studien. Studien ble godkjent av etisk komité av vårt sykehus.
Gynekologisk undersøkelse ble utført i alle livmorhalskreftpasienter for iscenesettelse i samsvar med International Federation of gynekologi og fødselshjelp (Figo) kriterier. 152 tilfeller av formalinfiksert, parafininnstøpte (FFPE) vevsprøver ble hentet fra vevsprøve arkiv av patologisk avdeling etter undersøkelse av arkiv lysbilder av erfarne patologer. De FFPE- prøver (eller Dypfryst cervical vev beskrevet nedenfor) ble opprinnelig samlet inn under den første besøk på poliklinikk eller ved gynekologisk undersøkelse eller etter operativ behandling under narkose. Av pasienter med CSCC inkludert i studien, var 29 FIGO stadium IIB, 25 FIGO stadium IIIB, 9 FIGO stadium IVB. Blant dem ble 28 tilfeller patologisk karakterisert som godt differensiert, 19 moderat differensiert og 16 dårlig differensierte svulster. Lymfeknutemetastase ble dokumentert for 31 kreftpasienter. I alt 64 pasienter med CIN ble valgt for denne undersøkelse, inkludert 33 tilfeller med CIN I-II og 31 med CIN III. Median alder for de livmorhalskreftpasienter var 49,5 år (IQ range 29-67 år). Kontroll tilfeller (n = 25) ble oppnådd fra pasienter uten en historie med livmorhalskreft eller noen form for kreft og planlagt å gjennomgå en hysterektomi for ikke-ondartede grunner i samme periode. Indikasjoner for hysterektomi var fibroids, prolaps uteri eller adenomyosis eller hovedsakelig en kombinasjon av muskelknuter med prolaps halsen.
I tillegg 55 frosne biopsier, inkludert 20 tilfeller av CIN, 20 CSCC og 15 kontrollsaker, ble samlet i henhold til kriteriene beskrevet ovenfor, for påvisning av gentranskripsjon ved semi-kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR).
Immunhistokjemisk Studies
Immunhistokjemisk (IHC) farging~~POS=HEADCOMP ble utført med primær antistoffer som gjenkjenner target proteiner og IHC Kits som inneholder biotin-merket sekundære antistoffer. muse mAb HLA klasse I tung kjede (HC-10,1:300, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) ble anerkjent som SS2-m-free [19]. Kaninen polyklonale anti-b2-m-antistoff ble kjøpt fra (1:100, Shanghai Jingtian, bioteknologi, Kina), TAP1 og TAP2 antistoff (1:300, Santa Cruz Biotechnology, henholdsvis), LMP2 og LMP7 antistoff (1:100 ; Abcam, Cambridge, MA, USA, henholdsvis), ERAP1 antistoff (1:200; Abcam), ERp57 antistoff (1:300, Santa Cruz Biotechnology), calnexin og calreticulin antistoff (1:50, Shanghai Jingtian, bioteknologi, Kina, henholdsvis), og tapasin antistoff (1:300, Santa Cruz Biotechnology). I korthet, ble 3-mikrometer tykke seksjoner skåret fra de parafininnstøpte vevsblokker. Etter å ha blitt avvokset i xylen og rehydratisert i alkohol og destillert vann, ble antigen gjenvinnes ved oppvarming i mikrobølgeovn i 15 minutter ved 95 ° C i EDTA-buffer (pH 8,0). Etter avkjøling og skylling i destillert vann, ble endogen peroksidaseaktivitet blokkert ved inkubering seksjoner i 15 minutter i 3% H
2o
2, etterfulgt av skylling i 0,01 M PBS (pH 7,4) i 10 minutter. Prøvene ble preinkubert med et protein blokkeringsløsning i 10 minutter, og delene ble inkubert ved 4 ° C over natten i et fuktig kammer med de angitte antistoffer, Objektglassene ble vasket tre ganger i PBS og deretter inkubert med et biotinylert sekundært antistoff (Zhong Shan Goldenbridge Biotechnology Co Ltd., Kina) i 15 min ved romtemperatur. Reaksjonsproduktene ble visualisert med diaminobenzidine (DAB Kit, Zhongshan Goldenbridge Bioteknologi). PBS ble anvendt i stedet for det primære antistoff som en negativ kontroll og Glassene ble motfarget med hematoksylin, dehydrert, og evaluert under lysmikroskop.
Prosent og intensiteten av positivt farget tumorceller i hver lesjon ble undersøkt ved to patologer som ikke hadde noen kunnskap om pasientenes egenskaper. En konsensus tall ble nådd for hver tumorprøve mellom de to etterforskerne. Resultatene ble scoret på en skala fra 0 til 3 av andelen og intensiteten av positive celler blant kreftceller. Prosentandelen av positive celler ble scoret som 0 for ≤10%, en for 11-25%, 2 for 26-50%, 3 for 51-75%, 4 for ≥76%. Intensiteten av fargingen er som følger: 0 angir fravær av farging, 1 indikerer svak farging, 2 indikerer moderat farging, og 3 indikerer intens farging. Summen av begge score ble anvendt for å identifisere tre kategorier av uttrykket: normal uttrykk (Total score 7-8), delvis tap av ekspresjon (3-6), og totalt tap av uttrykket (0-2). IHC farging viste sterkt uttrykk av HLA-I i stromal vev og tumor-infiltrerende betennelsesceller, og dermed gi en intern positiv kontroll, som foreslått av en tidligere studie [20].
RNA Utvinning og Semi-kvantitativ RT- PCR
Total RNA ble ekstrahert fra pasientens vev ved hjelp Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) som anbefalt av produsenten. MRNA (1 ug) ble reverstranskribert inn i cDNA med RevertAid (MBI Fermentas, Burlington, Ontario, Canada) ved 42 ° C i 60 min. CDNA (20 ng) ble amplifisert ved PCR i et 25 ul blandingen under følgende betingelser: 95 ° C i 1 minutt, etterfulgt av 25 eller 30 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, annealing ved 60 ° C i 30 sek, og syntese ved 68 ° C i 1 minutt, og en endelig forlengelse ved 68 ° C i 10 min. PCR produktene ble separert på en 4% agarosegel, visualisert med GoldView I (Beijing Solarbio Co, Beijing, Kina) for ultrafiolett deteksjon og kvantifisering av Gel Imaging System og profesjonell programvare (GelDoc XR, Bio-Rad Laboratories, CA, USA) . Hver analyse ble gjentatt minst to ganger for å sikre gjengitt mRNA, β-aktin mRNA ble anvendt som en intern lasting og normaliseringskontroll. Forover og bakover primerpar og deres produkter er listet opp i tabell S1
Cellelinjer
Siha menneskelige carcinoma celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). . Celler ble dyrket i RPMI 1640 medium (Invitrogen) supplert med 10% FCS, L-glutamin, og antibiotika (Sigma-Aldrich).
DNA ekstraksjon, Bisulfite Treatment, og Bisulfite-sekvensering PCR (BSP)
DNA ble ekstrahert fra Siha celler ved hjelp av en DNA-ekstraksjon (Qiagen, Valencia, CA, USA), og genomisk DNA (500 ng) var sulfitt-modifisert ved hjelp av EZ Metylering Gold Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner [21]. CpG island fragmentspesifikke primere ble utformet ved å skanne genet promoter regioner som bruker spesialiserte Methyl Primer Express-programvaren (ABI selskap) basert på genetisk informasjon hentet fra Genbank database. Bisulfite behandlet DNA fra livmorhalskreftcellene var PCR forsterket. Primere som brukes til etterfølgende presiseringer er listet opp i tabell S2. Fullstendig bisulfitt modifisering ble bekreftet ved sekvensanalyse. BSP amplifikasjoner ble utført i 50-ul reaksjonsblandinger inneholdende 2 ul bisulfitt-modifisert genomisk DNA, 2 pl dNTP, 1,2 pl primere, 2 ul MgCl
2, 20 nM ammoniumsulfat,
. 75 nM Tris-HCl (pH 8,3), og 3 U av Taq DNA-polymerase. Det touch-down PCR Ordningen ble anvendt for å amplifisere med følgende sykkel betingelser: 95 ° C denaturering i 15 min, 95 ° C i 20 sekunder, annealing temperaturer i området fra 62 ° C til 56 ° C i 1 min, forlengelse ved 72 ° C i 1 min for 45 sykluser, og endelig inkubering ved 72 ° C i 7 min. Annealing temperaturer var som følger: HLA-B: 60 ° C, TAP1:62 ° C, TAP2:56 ° C, LMP: 60 ° C, LMP2:58 ° C, tapasin: 58 ° C, ERAP1:62 ° C, og ERP57:56 ° C. PCR ble etterfulgt av kloning i vektorer og sekvensering for å identifisere CpG nettsteder relatert til genet promoter metylering.
Genomisk DNA isolering og kvantitativ DNA Metylering analyse
Genomisk DNA ble ekstrahert ved hjelp av en QIAamp DNA Mini Kit ( QIAGEN, Valencia, CA). For kvantitativ påvisning av denaturert DNA, ble MassARRAY (Sequenom, San Diego, CA, USA) som brukes til å analysere cervical vev DNA for CpG innhold. Target genet bestemt primerpar ble brukt til å sammenligne metylering nivåer av målet fragmenter og CpG nettsider blant forskjellige prøver i henhold til produsentens instruksjoner og som beskrevet tidligere [22] – [23]. De analyserte områdene og CpG områder av kandidat gen-promotorer er vist i Tabell S3. Primere som brukes ble utformet i henhold til Sequenom Standard EpiPanel (Sequenom, november 2007-versjonen og tabell S4). PCR-amplifikasjon ble utført med de følgende parametere: PCR-blandingen inneholdt 10 ng bisulfitt-behandlede DNA, 200 mM dNTPs, 0,2 U av Hot Start-Taq DNA-polymerase (QIAGEN), og 0,2 mM forover og revers primere i et totalt volum på 5 ul. Sykluser inkludert en varm start ved 94 ° C i 15 min, etterfulgt av denaturering ved 94 ° C i 20 sekunder, annealing ved 56 ° C i 30 sek, forlengelse ved 72 ° C i 1 min (45 sykluser), med en endelig inkubering ved 72 ° C i 3 minutter. Unincorporated dNTP ble defosforylert ved å tilsette 2 ml premix inkludert 0,3 U reker alkalisk fosfat (SAP, Sequenom). Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 37 ° C i 40 minutter og SAP ble deretter varmeinaktivert i 5 minutter ved 85 ° C. Etter SAP behandling, ble 2 ml PCR produkt som brukes som mal for
in vitro
transkripsjon og RNase A cleavage ble brukt for den omvendte reaksjonen, per produsentens instruksjoner (Sequenom). Prøvene ble kondisjonert og sett på en 384-pad Spectro-CHIP (Sequenom) med en MassARRAY nanodispenser (Samsung, Irvine, CA, USA), etterfulgt av spektral oppkjøpet på en MassARRAY analysator kompakt MALDI-TOF massespektrometer (Sequenom). De metylering analysene ble utført ved hjelp av EpiTYPER søknad (Sequenom) for å generere kvantitative resultatene for hver CpG nettsted eller en samling av flere CpG nettsteder.
Fastsettelse av HPV genotyper
Genomisk DNA ble ekstrahert fra cervical vev ved hjelp av en QIAamp DNA Mini Kit? (Qiagen, Düsseldorf, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Konsentrasjonen og renheten av DNA ble bestemt ved absorbans ved 260 og 280 nm. HPV-genotypene ble oppdaget ved hjelp av humant papillomavirus Genotyping Diagnose Kit (yjkuang Genetel Pharmaceuticals, Shenzhen, Kina) og analysert ved bruk av HPV-genotypene DNA microarray lesersystem (HPV-GenoCam-9600, yjkuang Genetel Pharmaceuticals, Shenzhen, Kina)) som beskrevet [24]. I korthet, ble HPV-DNA ekstrahert og PCR-amplifisert ved anvendelse av følgende parametere: denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 30 sekunder, 52 ° C i 45 sek, og 65 ° C i 90 sek. Ved slutten av den siste syklus, ble blandingen inkubert ved 65 ° C i 5 minutter. Genet chip var forberedt, PCR-produkter hybridiserte, og visualisert.
Statistiske analyser
Alle statistiske analyser ble utført med SPSS versjon 17 programvarepakken. Alle P-verdiene var tosidig og signifikansnivået var
P
0,05. Mann-Whitney-testen ble brukt for å teste kontinuerlige variabler for forskjeller i immunhistokjemisk farging score mellom tumor og normalt vev for HLA-I og APM komponenter. Fishers eksakte test ble brukt for evaluering av assosiasjoner med kliniske patologiske parametere. Kvantitative DNA metylering data fra MassARRAY ble behandlet som kontinuerlige variabler og manglende målinger ble tilregnet til multivariabel regresjonsanalyse ved hjelp av prøver med erstatning for de nonmissing verdier (enkelt imputations). Lineære sammenhenger mellom 2 kontinuerlige variabler ble kvantifisert ved Pearson korrelasjonskoeffisient.
Resultater
APM Component og HLA- jeg Expression i cervixlesjoner
Alle antistoffer ble testet på formalin fast, parafin-embedded, normal cervical vev, CIN og CSCC. Representative fargemønstre for HLA klasse I tunge kjeder, ß2-m og APM komponenter er vist i fig. 1 og fig S1. Som vist i figur 1, ble Farging av HLA klasse I-tunge kjeder og SS2-m lokalisert på cellemembraner av nakke epitel og interstitielle celler, mens den APM komponentene fargingen var i hovedsak lokalisert i cytoplasma av cervikal epitel. Anti-HLA klasse I og anti SS2-m antistoffer viste sterk farging av cellemembraner i normal cervical vev, mens en svært variabel uttrykk profil i CIN og CSCC vevsprøver, som strekker seg fra delvis tap til totalt tap av uttrykk, men redusert uttrykk, til vanlig uttrykk. Ekspresjon av HLA klasse I tunge kjeder, ß2-m og APM komponentene er gjengitt i tabell 1.
A-C. Fargemønstre av HLA-I, henholdsvis SS2-m og ERAP1,. (Annet APM komponenter TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, calnexin, calreticulin, ERp57, og tapasin flekker vist i figur S1), Paneler A1-C1 skildre normal livmor livmorhalsen vev med normal protein uttrykk. Paneler A2-C2 viser cervikal intraepitelial neoplasi med delvis tap av protein uttrykk. Paneler A3-C3 vise livmorhalskreft med svak eller totalt tap av protein uttrykk.
Av de 64 tilfellene CIN og 63 tilfeller CSCC deltok i denne studien (tabell og figur 2), protein uttrykk nivået av HLA klasse i og APM komponenter ble endret fra normal uttrykk for delvis tap eller totalt tap, med utviklingen av normal epitel av livmorhalsen til CIN og CSCC. Den totale tap av protein uttrykk var bemerkelsesverdig for de fleste av medlemmene av HLA klasse I og APM familie i CSCC sammenlignet med CIN eller normale kontroller, bortsett fra CNX og CRT. Den delvis tap av protein uttrykk av HLA-I, SS2-m, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, ERAP1, tapasin og ERp57 var statistisk signifikant for CIN tilfeller sammenlignet med normale kontroller.
Analyser clinicopathologic egenskaper ( tumor grad, klinisk stadium og lymfeknutemetastaser) med protein uttrykk av HLA-i og APM komponenter (TAP-1, TAP-2, lMP2, LMP7, Tapasin, ERAP1, CNX, CRT og ERp57) i livmorhalsen cancer.Results er representert som prosent (%). øvre histogram A1 showet HLA-I og APM komponenter uttrykt i godt differensiert tumor, A2 viser uttrykt i moderat til dårlig differensiert tumor. B1 viser uttrykt i ≤II en svulst og B2 viser uttrykt i ≥II B, C1-show uttrykt i lymfeknutemetastaser negativ tumor og C2 viser uttrykt i lymfeknutemetastaser positiv tumor, henholdsvis. *
P
0,05.
Sammenhengen mellom uttrykket av HLA klasse I, SS2-m, og APM komponenter og clinicopathological egenskaper ble undersøkt i CSCC lesjoner. Som det kan ses i figur 2A, det var en invers korrelasjon med nedregulering av HLA-I, SS2-m TAP1, LMP7, og ERp57 proteinekspresjon og tumor differensiering karakter. Bruke Figo staging kriterier, ERp57 protein uttrykk var betydelig lavere i lavere stadium svulster enn i høyere stadier (figur 2B). I tillegg nedregulering av HLA-I, TAP1, LMP7, tapasin, CRT, og ERp57 hadde en invers korrelasjon med lymfeknutemetastase (figur 2C). Begge korrelasjoner var statistisk signifikant (P 0,05). Den nedregulering av SS2-m, TAP1, TAP2, LMP7, ERAP1, tapasin, og ERp57 protein uttrykk positivt assosiert med HLA-I uttrykk i CIN lesjoner, mens SS2-m, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, ERAP1, ERp57, og tapasin uttrykk positivt assosiert med HLA-i i til kreft. Nedregulering av noen APM komponent unntatt calnexin og calreticulin var signifikant assosiert med HLA klasse I nedregulering i CIN og CSCC gruppen (P 0,05).
For ytterligere å kontrollere resultatene av immunhistokjemisk farging analyse, vi har oppdaget transkripsjonen av HLA klasse i og APM-komponenter ved semi-kvantitativ RT-PCR. Ekspresjonsnivået av HLA-A, -B og -C koder for HLA-I var lavere i både CIN og CSCC enn i kontrollgruppen (Figur 3). Transkripsjoner av TAP-1/2 og LMP2 /7 var vanskelig å oppdage, og ingen transkripsjon av Tapasin og ERp57, i CIN og CSCC vev. Men ingen forskjell ble funnet for CNX og CRT transkripsjon mellom CIN eller CSCC og kontroller (figur 4). Selv om prøvene for RT-PCR og IHC-analyse var fra forskjellig opprinnelse, disse resultatene antydet at utviklingen av nedregulering av mål-gen-ekspresjon ved begge transkripsjonelle og translasjonelle nivå var sammenlignbare i utviklingen av livmorhalskreft, særlig i patogenesen av forstadier.
M: 100-600 bp markør stiger. Lanes 1 viser normal cervical vev, 2 og 3 viser CIN, 4 viser CSCC vev. mRNA-nivåer ble normalisert til p-aktin mRNA (D). Mangelen mRNA uttrykk for en enkelt allel av HLA-I vil påvirke den normale overflate uttrykk av HLA-I-molekyler ifølge protein oppdaget av IHC.
Expression nivåer av APM komponenter (TAP-1, TAP-2, lMP2, LMP7, Tapasin, ERAP1, CNX, CRT og ERp57) ble analysert ved Semi-kvantitativ RT-PCR i normal livmor livmorhalsen vev, CIN og CSCC. Sammenlignet med kontrollen, CIN og CSCC, ble mRNA-nivåer normalisert til p-aktin mRNA. Den øvre histogram har vist uttrykket nivåer av APM komponentene i i normal cervixuteri vev, CIN og CSCC. Resultatene av RT-PCR er representert som gjennomsnitt ± SD av 15 kontroller, henholdsvis 30 og 33 CIN CSCC. *
P
0,05.
metylering Profiler av APM Gene familie i en CSCC cellelinje
På grunn av den teoretiske sammenhengen mellom genet promoter hypermethylation som en epigenetisk modifikasjon med nedregulering av gentranskripsjon, vi analysert HLA-B, TAP1, TAP2, lMP2, LMP7, ERAP1, tapasin, og ERp57, på grunn av nedregulering av disse genene i livmorhalskreft eller forstadier, for metylering status av CpG øyer på promotorområdet i Siha cervical carcinoma celler etter sulfitt-sekvensering tilnærming. Ved forsterkning av målet CpG øyer identifisert av profesjonell programvare med bisulfate sekvense primere (BSP, figur 5) ved hjelp av genomisk DNA som mal, og etterfulgt av kloning og sekvensering, har vi funnet forskjellige grader av CpG nettstedet metylering av TAP1, TAP2, LMP7, tapasin og ERp57 gener. Men ingen metylering ble oppdaget for HLA-B, LMP2, og ERAP1. Alle CPG nettstedene denaturert kandidatgener er vist i tabell S4, der plasseringen av primere ble presentert i understrekinger, målrette CpG steder i kursiv og denaturert CPGs i fet skrift.
Hver vertikale indikerer et individ CpG nettstedet . Solid linjeposisjoner i BSP primere. Alle BSP primere er designet for å dekke transkripsjons start området bør være nær transcriptional starte nettstedet. Paneler AH avbilde HLA-B, TAP-en, TAP-2, LMP2, LMP7, Tapasin, ERAP1 og ERp57.
DNA Metylering i livmorhalskreft og sin tilknytning til mRNA uttrykk og HPV infeksjon
etter en tilnærming ved hjelp Sequenom MassARRAY plattform for kvantitativ påvisning av denaturert DNA, fant vi at den globale metylering nivået av målet CpG øyene TAP1, LMP7 og ERp57 gener var betydelig høyere i genomisk DNA fra CSCC enn i enten CIN eller normal kontroller (
P
0,05), men ingen forskjell ble funnet for TAP2 og tapasin (tabell 2). Metylering nivå TAP1 var betydelig høyere i både CIN og CSCC enn i kontrollene (
P
= 0,015 og 0,001, henholdsvis). Av LMP7 og ERp57 gener, metylering nivå i CSCC, men ikke i CIN, signifikant forskjellig fra kontrollen (
P =
0,001). Videre analyser av enkelt CpG stedsspesifikke metylering innen TAP1, LMP7, og ERp57 indikerte en betydelig økning i metylering nivå for de fleste av CpG nettsteder på målet CpG øyene TAP1, LMP7, og ERp57 gener i CSCC sammenlignet med kontrollene, mens ingen statistisk signifikans ble funnet mellom CIN og kontroll (
P
0,05).
Videre analyser av dataene resulterte fra den kvantitative analysen av enkelt CpG nettstedet metylering av Sequenom MassARRAY plattform, har vist at TAP1 genet inneholder 23 CpG nettsteder og metylering nivået mellom to eller tre CpG nettsteder fra CpG_1, CpG_2.3, CpG_4, CpG_16, CpG_19, CpG_20, CpG_21, CpG_22 og CpG_23 forbundet med hverandre, men ingen sammenheng ble funnet for metylering forhold på andre CpG nettsteder. LMP7 genet inneholder 22 CpG nettsteder og metylering nivå mellom CpG_1, CpG_2, CpG_6, CpG_8, CpG_9, CpG_12, 13, 14, CpG_20 og CpG_22 forbundet med hverandre. ERp57 genet inneholder 9 CpG nettsteder, der CpG_1, CpG_2, CpG_5, CpG_6, CpG_7 ha betydning mellom kontroll og kreft gruppe. Selv om ingen statistisk signifikans ble funnet av hele målet CpG-fragment metylering nivå av TAP2 mellom tre grupper, analyse av data resulterte fra den kvantitative analysen av TAP2 enkelt CpG området metylering har vist at det var betydelige forskjeller i metylering nivået av CpG_8 seter mellom CSCC og kontroller, men ingen sammenheng ble funnet for metylering forholdet mellom andre CpG områder (
P
0,05).
i tillegg komparativ analyse av TAP1, LMP7, og ERp57 metylering med protein ekspresjonsnivåene og høy-risiko HPV16 infeksjon vist en invers korrelasjon av endret CpG øy metylering med forandringer i protein ekspresjonen av korresponderende gener. Videre metylering nivået av disse genene var signifikant høyere i tilfeller positive for HPV16 infeksjon enn i negative (tabell 3 og 4).
Diskusjoner
Redusert immunocompetence forbundet med nedregulering av HLA-i uttrykket har blitt hyppig rapportert for pasienter med økt tumorinvasjon og metastasering, noe som tyder på at den funksjonelle abnormitet av HLA-i i cellulære antigen presentasjon mest sannsynlig være en viktig hendelse i tumor utvikling og progresjon [20], [ ,,,0],25] – [26]
i denne studien undersøkte vi foreningen av livmorhalskreftutvikling og patogenesen av sine forstadier med avvikende regulering av HLA-i og APM uttrykk på ulike nivåer, inkludert genet promoter metylering, transkripsjon. og protein uttrykk.
