Abstract
adenovirus (ADS) med sletting av
E1b55K
fortrinnsvis replikere i kreftceller og har vært brukt i kreftbehandling. Vi har tidligere vist at Ad E1B55K protein er involvert i induksjon av cyclin E for Ad replikering, men dette E1B55K funksjonen er ikke nødvendig i kreftceller der deregulering av cyclin E er ofte observert. I denne studien undersøkte vi samspillet av cyclin E og CDK2 i Ad-infiserte celler. Ad infeksjon betydelig økt stor form av cyclin E (cyclin EL), fremmet cyclin E /CDK2 kompleks formasjon og økt CDK2 fosforylering på T160 nettstedet. Aktivert CDK2 forårsaket pRb fosforylering på S612 nettstedet. Undertrykkelse av CDK2 aktivitet med den kjemiske hemmer roscovitine eller med spesifikke små interfererende RNA betydelig redusert pRb fosforylering, med samtidig undertrykkelse av virusreplikasjon. Våre resultater tyder på at Ad-indusert cyclin E aktiverer CDK2 som er rettet mot transkripsjons repressor pRb å generere et cellulært miljø for viral produktiv replikering. Denne studien viser en ny molekylære grunnlaget for onkolytiske replikering av
E1B
-deleted Annonser og skal hjelpe til med å utvikle nye strategier for Ad onkolytiske virotherapies
Citation. Cheng PH, Rao XM, McMasters KM, Zhou HS (2013) molekylære grunnlaget for Viral Selective Replication i kreftceller: Aktivering av CDK2 av Adenovirus-Induced Cyclin E. PLoS ONE 8 (2): e57340. doi: 10,1371 /journal.pone.0057340
Redaktør: Yi Li, Wuhan Bioengineering Institute, Kina
mottatt: 03.10.2012; Godkjent: 21 januar 2013; Publisert: 20 februar 2013
Copyright: © 2013 Cheng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIH Grant R01 CA129975 (til HSZ https://www.nih.gov/). PHC støttes delvis av K. C. Huang stipend fra University of Louisville (https://louisville.edu/medschool/pharmacology). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
menneske~~POS=TRUNC adenovirus (ADS) er dobbelt-trådet lineære DNA-virus som er i stand til å infisere og gjenskape i en rekke celletyper
in vitro Hotell og
in vivo
, inkludert post-mitotiske celler. Etter infeksjon, virale tidlige proteiner som interagere med cellulære faktorer for å skape gunstige miljøer for viral replikasjon [1]. Annonse
E1
regionen inneholder to sett med gener,
E1A Hotell og
E1B
, som er dedikert til cellesykluskontroll, apoptotisk hemming, og mobilnettet og viral genregulering [ ,,,0],2]. Annonser med
E1
modifikasjoner som fortrinnsvis replikere i kreftceller har blitt brukt for kreft genterapi.
viral
E1A
genet uttrykkes umiddelbart etter smitte. Den primære rolle
E1A
genproduktene er å regulere ekspresjonen av flere cellulære og virale gener [1]. I stedet for direkte å bindes til spesifikke DNA-sekvenser i transkripsjonelle reguleringselementer, E1A proteiner samvirke med flere viktige regulatorer av celle proliferasjon [3], [4]. Den kjente cellulære faktorer til som E1A proteiner binder er produkter av retinoblastom (
Rb
) genet og dets strukturelt beslektede gener,
p107 Hotell og
p130 product: [5] , [6]. Ved å avsette retinoblastom protein (pRb), aktiverer E1A transkripsjonsregulator E2F proteiner. Studier har antydet at pRb /E2F kompleks aktivt undertrykker transkripsjon fra målgener og formidler G
1 arrest utløst av p19 (ARF), p53, p16INK4a, TGF beta, eller cellekontakt [7] – [9]. Nylig Pelka
et al.
(2011) viste at E1A kan direkte binde til E2F /DP-komplekser ved å samhandle med DP-1, noe som resulterer i aktivering av E2F-responsive genekspresjon uavhengig til å binde til pRb [10] . Flere grupper har vist at ekspresjon av
E1A
gen utløser opphopning av proteinet p53 og p53-avhengig apoptose [11], [12], enten ved å aktivere transkripsjon p53 eller p53 hindre fra å bli forringet av proteasomet [11] – [14]
Ad E1B55K har blitt vist i noen studier for å motvirke den E1A-indusert stabilisering av p53 [11], [15].. E1B55K proteinet kan hemme funksjonene til p53 gjennom minst tre forskjellige mekanismer. E1B55K binder velig aminoenden av p53 [16], og denne bindingen kan undertrykke p53 transkripsjonen aktivering, som foreslått i transkripsjon assays [17] og forbigående transfeksjon studier [18]. E1B55K kan også interferere med p53-funksjon ved å samarbeide med viral E4orf6 protein for å bevirke proteolytisk degradering av p53-protein [19] – [21]. En fersk studie har vist at E1B55K alene fungerer som en E3 SUMO1-p53 ligase som samhandler med promyelocytic leukemi atom organer for å inaktivere p53 og stimulere sitt atom eksport [22]. Derved E1B55K blokkerer ekspresjon av p53-regulerte gener, og følgelig motvirker p53-avhengig apoptose indusert ved E1A, slik at effektiv viral replikasjon [16], [17].
Ad
dl
1520 (ONYX-015) inneholder et 827-bp delesjon og en punktmutasjon generering av et for tidlig stoppkodon i den E1B55K kodende sekvens, noe som forhindrer ekspresjon fra genet [23]. Det var opprinnelig foreslått at
E1b55K
-deleted Annonser kunne replikere bare i p53-mangeltumorceller, som E1B55K-mediert degradering av p53 protein ikke var nødvendig i disse kreftceller [24], [25].
E1b55K
-deleted onkolytiske annonser har blitt testet i kliniske studier og blir markedsført for kreftbehandling i Kina etter godkjent av Kinas State Food and Drug Administration (Drug Administration) [26]. Men den opprinnelige hypotesen ble utfordret av flere studier som viser at
E1b55K
-deleted Annonser er i stand til å replikere i cellene uavhengig av p53 status [27] – [30]. Videre studier har vist at opphopning av p53 protein, etter infeksjon med annonser bæring mutert
E1b55K
gener som er i stand til å undertrykke p53, kan verken effektivt indusere apoptose eller transcriptionally aktivere uttrykk for p53-responsive gener i Ad-smittet -celler [31], [32]. Følgelig antyder disse resultatene at blokkering av p53-aktivitet ved E1B55K proteinet er lite sannsynlig å være den viktigste forutsetning for viral replikasjon. Mekanismen (e) til
E1b55K
-deleted virusreplikasjon i kreftceller er fortsatt ikke er etablert, selv om vektorene har allerede blitt anvendt i klinikken for human behandling av kreft [26].
tidligere har vi vist at Ad E1B55K er involvert i induksjon av cellesyklusrelaterte gener, inkludert cyklin E og CDC25A [33]. Ad E1B55K formidler den store form av cyclin E protein (cyclin EL) induksjon i Ad-infiserte celler [34]. Cyclin E og den store formen cyclin EL genereres fra alternativ spleising. Oversettelsen av cyclin EL blir initiert ved et ATG-kodon beliggende i exon 2 og cyclin E er fra ATG-kodonet i exon 3 [35]. Den E1B55K funksjonen er nødvendig for cyclin EL induksjon i normale celler, men er ikke nødvendig i kreftceller med deregulert cyclin E. Unnlate å effektivt indusere cyclin EL uttrykk i normale celler, replikering av
E1b55K
-deleted onkolytiske Annonser er begrenset. Men
E1b55K
-deleted onkolytiske Annonser kan effektivt indusere cyclin EL i kreftceller og gjennomføre tilstrekkelig onkolytiske replikering. Vi foreslått at cyclin E deregulering i kreftceller kan bli en viktig molekylære basis for selektiv onkolytisk replikasjon av
E1b55K
-deleted Ads [34].
Cyclin E regulerer cellesyklusprogresjon, DNA-replikasjon [36], [37], og sentrosomen duplisering [38], [39]. Ekspresjon av cyclin E er strengt kontrollert i normale celler. Nivået av cyclin E stiger ved slutten av G
en fase, topper ved G
1 /S-fasen for å fremme den S-fase oppføring, og avtar deretter [35], [40]. Deregulering av Cyclin E blir ofte detektert i mange typer kreft, som cyclin E genamplifikasjon [41], overekspresjon av cyclin E mRNA eller proteinnivåer [42], [43], reduksjon av cyclin E omsetningen [44], og nærværet av mer aktive former av Cyclin E [45] – [47]. Konstitutiv overekspresjon av cyclin E ble vist å indusere kromosom ustabilitet og svekke normal cellesyklusprogresjon [48], [49]. Hypotesen om at unormal cyclin E uttrykk kan utløse svulster har også blitt støttet av transgene dyrestudier [50] -. [52]
En funksjon av cyclin E er å binde og aktivere cyclin-avhengig kinase 2 (CDK2) [53]. Cyklin E /CDK2 kompleks fosforylerer deretter underlag som pRb og fører til transkripsjonen aktivering av nedstrømsgener. Studier viser også at cyclin E har CDK2 uavhengige funksjoner [54], [55].
In vivo
dyrestudier indikerer avviket mellom fenotyper av cyclin E null (cyclin E1
– /- E2
– /-) mus og CDK2 null (CDK2
– /-) mus . Mus som mangler CDK2 er levedyktig, med normal utvikling bortsett defekt bakterie celle utvikling [56], [57]; ennå knockout av cyclin E1 og E2 gener hos mus forårsaker embryonale dødelighet på grunn av mangel på endoreplication av trophoblast kjempeceller og megakaryocytes [58]. Matsumoto
et al. Product: (2004) identifiserte en centrosomal lokaliseringssignal (CLS) domene i cyclin E [59]. Dette CLS domene gjør cyclin E å målrette sentrosomen og fremme S-fasen oppføring i en CDK2 uavhengig. I tillegg Geng
et al. Product: (2007) viste at en cyclin E kinase-mangel mutant (KD-E) er i stand til å delvis gjenopprette minichromosome vedlikehold protein (MCM) lasting og S-fasen oppføring i cyclin E null-celler [54]. Således har cyklin E CDK2-avhengige og uavhengige funksjoner i S-fasen oppføring og DNA-replikasjon. Et viktig spørsmål er om Ad-indusert cyclin E kan aktivere CDK2 og om cyclin E-CDK2 interaksjon kan spille en avgjørende rolle i Ad replikering. Dette spørsmålet er spesielt viktig i utviklingen av onkolytiske virotherapy strategier.
Vi rapporterer her at Ad-indusert cyclin E binder seg med og aktiverer CDK2 som er rettet mot transkripsjon repressor pRb, som i sin tur kan regulere uttrykket av cellulære og virale gener . Resultatene tyder på at samspillet mellom Ad-indusert cyclin E og CDK2 er å generere et egnet miljø for Ad produktiv replikering.
Materialer og metoder
Cellelinjer og kultur forhold
HEK 293 (ATCC nr. CRL-1573), humane lungefibroblaster WI-38 (ATCC nr. CCL-75), og kreft A549 humane lunge (ATCC nr. CCL-185) cellelinjer ble kjøpt fra the American Type Culture Collection (Rockville, MD). WI-38-celler ble dyrket i minimalt essensielt medium (MEM) Alpha Glutamax med 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer og 1,0 mM natriumpyruvat. HEK-293 og A549-celler ble dyrket i minimalt essensielt medium Alpha. Alle media ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og penicillin /streptomycin (100 U /ml). Celler ble dyrket i en 5% CO
2 inkubator ved 37 ° C. Alle cellekultur reagenser ble oppnådd fra Gibco BRL (Bethesda, MD).
adenovirusvektorer
Vill-type adenovirus type 5 (Adwt, ATCC nr. VR-5) ble anvendt som et replikasjons -competent kontroll. AdCMV /GFP, en Ad vektor med E1 delesjon som bærer et grønt fluorescerende protein (GFP), ble brukt som et replikasjons-defekt kontroll. Adhz63, en onkolytiske Ad vektor med sletting av
E1b55K
regionen, ble bygget av vårt laboratorium [60].
Virusinfeksjon og titrering
Celler ble sådd på 6- brønns plater ved en tetthet på 2,5 x 10
5 (celler /brønn) og dyrket under de angitte forhold. Deretter ble cellene mock-infiserte eller infisert med AdGFP, Adwt, eller Adhz63 ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 5. cytopatisk effekt (CPE) ble observert ved konstruert tidspunkter og fotografert med et invertert mikroskop (Olympus CKX41). Totalt infiserte celler og kultursupernatanter ble samlet opp ved 48 h postinfection (p.i.) og lysert for å frigjøre viruspartikler med tre sykluser med frysing og tining. De virale titere ble bestemt ved infeksiøs enhet metode som tidligere beskrevet [61], [62]. I korthet, ble HEK 293-celler sådd i 96-brønns plater ved en tetthet på 10
3 (celler /brønn) og deretter infisert med 5-ganger seriefortynnet virus. CPE ble spilt inn og scoret etter inkubasjon i 7 dager. Reduksjonsprosenten i virustiter beregnes ved hjelp av formelen, reduksjon% = [(titer av kontrollgruppe – titer på eksperimentell gruppe) /titer av kontrollgruppen]. X 100%
viral DNA-syntese assay
Etter viral infeksjon, ble cellene samlet opp ved forskjellige tidspunkter. Den virale DNA-syntese ble bestemt ved Southern blot; 1 ug av isolert genomisk DNA ble spaltet med restriksjonsenzymet
Pst
I og analysert med 1% agarose gel, som deretter ble transblottet til en Hybond-N + membran (YA3609; Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL) . Sonden ble utarbeidet ved å fordøye 0,5 mikrogram pBHGE3 [63] med
Pst
jeg og merket ved å følge protokollen for Amersham AlkPhos direkte Merking og Detection Systems (RPN 3690, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Blottet ble prehybridisert i 3 timer ved 63 ° C. De hybridiserings- og stringens vaskinger ble utført ved 55 ° C og etterfulgt av kjemiluminescens deteksjon i henhold til produsentens protokoll.
Western blot-analyse
Infiserte celler ble høstet ved angitte tidspunkter og lysert med CDK2 lyseringsbuffer (20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl
2, 0.5% Nonidet P-40, 0,1% Brij 35, 5 mM natrium glycerofosfat, 1 mM natrium-vanadat, 1 mM ditiotreitol). Western blot analyser ble utført som tidligere beskrevet [64]. I korthet ble 80 ug av cellelysatene ble underkastet elektroforese gjennom 12% SDS-polyakrylamidgeler og overført på en Immobilon-P-membran (Millipore, Billerica, Massachusetts). De primære antistoffene anvendt i denne studien var kanin anti-Cyclin E (M-20), CDK4 (C-22), muse-anti-Cyclin D1 (DCS-6), PCNA (PC10), p21 (F-5), pRb (IF8) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), mus anti-CDK2, p27 (BD Biosciences, San Jose, CA), pCDK2 T160 (Cell signalering, Danvers, MA), kanin anti-fosforylert pRb (fosfor-pRb ) S612, og aktin (Sigma, St. Louis, MO), anti-fosfor-pRb S795 (New England Biolabs, Beverly, MA), og anti-fosfor-pRb T821 (Invitrogen, Carlsbad, California). Aktin ble anvendt som en intern kontroll. Membranene ble deretter inkubert med anti-mus-immunoglobulin G (IgG) eller anti-kanin IgG peroksidase-koblet artsspesifikke hel antistoff (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Kjemiluminescens deteksjon ble utført med ECL-reagenser i henhold til leverandørens anbefalinger (GE Healthcare). Det skannede bandet intensiteten ble kvantifisert ved Gel-pro Analyzer 4.0-programvaren (Media Cybernetics, Bethesda, MD) i henhold til produsentens opplæringen. Densitometrisk verdi for hvert bånd ble uttrykt som integrert optisk tetthet (I.O.D.), og resultatene ble normalisert med aktin. De endelige verdiene representerer hjelp av relativ prosentvis endring, fra minst tre uavhengige eksperimenter, sammenlignet med modellgruppe ± S.D .. Statistiske forskjell ble vurdert med t-test. En p-verdi på. 0,05 ble betraktet som signifikant
Immunpresipitasjon
A549 celler ble sådd i 150 mm skåler ved en celletetthet på 5 × 10
6 (celler /skål) og deretter mock-infiserte eller infisert med AdGFP, Adwt, eller Adhz63 ved en MOI på 5. etter 48 timer pi ble cellene oppsamlet og lysert med CDK2 lyseringsbuffer i henhold til den metode som er beskrevet i tidligere publikasjoner [34], [65]. Cellelysater (500 ug) ble immunoutfelt med Cyclin E (HE111), mus monoklonalt antistoff (Santa Cruz), eller anti-CDK2-antistoff (BD Transduction Laboratories) ved 4 ° C i 4 timer, etterfulgt av tilsetning av protein A Sepharose Cl- 4B (82506, Sigma) og ruger over natten. Immunkomplekser ble analysert ved Western blot med anti-cyclin E og CDK2 antistoffer.
Små interfering RNA (siRNA) transfeksjon
siRNA oligonukleotider ble syntetisert ved Eurogentec (Fremont, California). Tre forskjellige siRNA tomannsboliger ble utformet for å målrette CDK2 på nukleotider 399-419 (# 1), 619-639 (# 2), og 691-711 (# 3) etter Genbank tiltredelse NM001798.2 (National Center for Biotechnology Information GenBank) . En negativ kontroll siRNA duplex inneholder to tråder av 19 komplementære RNA baser med 3’dTdT overheng ble hentet fra Eurogentec (SR-CL000-005). Celler ble sådd ut i en 6-brønns plate ved en densitet på 10
5 (celler /brønn) og deretter transfektert med 200 nM CDK2 siRNA duplekser eller et ikke-spesifikt kontroll siRNA dupleks med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) henhold til produsentens protokoll. Cellene ble høstet etter 48 timer etter transfeksjon. Åtti ug av cellelysatene ble analysert ved hjelp av Western blot med CDK2, pCDK2 T160, pRb, fosforylert pRb (p-pRb), cyklin E, kapsidproteiner og actin-antistoffer.
Alle ovennevnte eksperimenter, med unntak av spesifikt angitt, ble gjentatt minst tre ganger.
Resultater
Cyclin E /CDK2 kompleks dannet i celler infisert med adenovirus
Vi har tidligere etablert koblingen mellom cyclin E og replikering av adenoviruses [33], [34]. Dataene vist i figur 1 rekapitulere at Ad E1B55K deltar i induksjon av den store formen av Cyclin E protein (cyclin EL), som bidrar til effektiv virusreplikasjon. Cyclin E og cyclin EL genereres fra alternativ spleising med forskjellig start ATG-kodoner i eksoner 2 og 3 [35]. N-terminalen av virus-induserte cyclin EL er 15 aminosyrer lengre enn for cyclin E protein. Cyclin E proteinet er konstitutivt uttrykt i A549 humane lungekreftceller [34]. Villtype Ad5 (Adwt), med det intakte
E1b55K
region, induserte signifikant cyklin EL ekspresjon i begge av WI-38 humane lunge fibroblast-celler og A549 humane lungekreftceller (Fig. 1A, baner 2 og 5 ), og forårsaket effektiv cytopatisk effekt (CPE) (fig. 1B, paneler b og e). Ad vektor Adhz63 med
E1b55K
-deletion [60] også indusert betydelig cyclin EL i A549-celler (fig. 1A, spor 6) og forårsaket effektiv CPE av cellene (Fig. 1B, panel c). Imidlertid vektoren ikke klarte å indusere cyclin EL overekspresjon i WI-38-celler (Fig. 1 A, spor 3) og deres CPE (fig. 1B, panel f). For å sammenligne replikering av Adwt og Adhz63 i A549 og WI-38-celler, ble titere av disse to virusene bestemt. Den Adhz63 replikasjon var sterkt undertrykket i WI-38-celler, og viser bare 10% av relativ replikasjon i sammenligning med Adwt (Fig. 1C). Når vi sammenlignet Adhz63 replikering med den til Adwt i A549-celler, i samsvar med CPE resultater ble det observert 80% av relativ replikasjon av Adhz63. Dermed er Adhz63 replikering mer undertrykt i WI-38 celler enn i A549 celler. Resultatet er i tråd med vår forrige observasjon at cyclin EL induksjon i kreftceller er forbundet med selektiv replikering av
E1b55K
-deleted annonser i kreftceller [34].
WI-38 eller A549 cellene ble infisert med AdGFP, Adwt eller Adhz63 ved en MOI på 5. (A) celler ble samlet opp etter 48 timer og deretter analysert ved hjelp av Western blot. Cellelysater ble immunblottet for cyclin E og aktin. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. (B) CPE ble fotografert ved 72 timer etter infeksjon (p.i.). All mikroskopi ble opprinnelig ved en forstørrelse på X100. (C) Virale titere ble bestemt ved 72 timer p.i. med infeksjon metoden. Verdien angir gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter, vist som den gjennomsnittlige endringen i prosent i forhold til kontrollgruppen Adwt ± S.D. * P. 0,05 sammenlignet med Adwt gruppen Students
t
-test
Cyclin E kan fremme S-fasen oppføring og delta i DNA replikasjon via CDK2 avhengig [53] og CDK2 uavhengig trasé [59]. For å undersøke om cyclin E funksjon i Ad replikering er CDK2 avhengig eller uavhengig, må vi først søkt å undersøke fysisk kontakt mellom CDK2 og cyclin EL i celler påvirkes av annonser. Lungekreft A549 celler ble mock-infiserte eller infisert med AdGFP, Adwt, eller Adhz63. For å forstå hvordan
E1B
-deleted Annonser selektivt replikere i kreftceller, fokuserte vi på A549 lungekreft celler der både Adwt og
E1B
-deleted Adhz63 effektivt kan indusere cyclin EL og replikere. Ved 48 timer etter infeksjon (p.i.), ble cellene oppsamlet og lysert. Vi først brukt anti-cyclin E antistoff til immunpresipitere cyclin E protein og analysert immunkomplekser med Western blot. Dataene viser at cyclin E-protein utfelt fra celler mock-behandlet eller behandlet med sjonsdefektiv AdGFP (negativ kontroll) ikke oppviser signifikant sammenheng med CDK2-proteinet (fig. 2A, felt 1 og 2). Imidlertid immunokomplekser fra Adwt- og Adhz63-infiserte A549-celler inneholdt både cyclin E og cyklin EL med en økning av CDK2 binding (fig. 2A, kolonnene 3 og 4). For å bekrefte dette cyclin E /CDK2 bonding, vi også brukt anti-CDK2 antistoff til å trekke ned protein kompleks og deretter undersøkt nivået av cyclin E proteiner i cyclin E-CDK2 kompleks. Den immunopresipitert CDK2 protein ble øket i Adwt og Adhz63-infiserte celler med en samtidig utfelling av cyclin EL (fig. 2B, kolonnene 3 og 4), spesielt for Adwt-infiserte celler (kolonne 3). Resultatene viser at replikasjonskompetente Adwt og Adhz63 indusere cyclin EL ekspresjon og øke dannelsen av cyclin EL /CDK2-kompleks i A549 kreftceller, noe som indikerer at cyclin EL induseres i Ad-infiserte celler sterkt forbinder med CDK2.
(A) A549-cellelysatene ble immunopresipitert med anti-Cyclin E antistoffer (1:50 fortynning). Immunokomplekser ble analysert ved hjelp av Western blot med cyclin E og CDK2-antistoffer. (B) cellelysatene ble immunopresipitert med anti-CDK2 antistoff og immunoblottet for CDK2, cyclin E og cyclin EL.
Adenovirus-indusert cyclin EL øker CDK2 fosforylering
CDK2 er aktivert ved fosforyleringen ved T160 området, og dette fosforylering øker dens elektroforetisk mobilitet, noe som resulterer i raskere migrerende bånd [66]. Vi undersøkte om cyclin EL induksjon og økt samspill mellom cyclin EL og CDK2 i A549 celler etter Adwt og Adhz63 infeksjon kan fremme CDK2 fosforylering på spesifikke T160 nettstedet. Analyse av cellelysatene med Western blot viste at de induksjons cyclin EL førte til en økning av den raskere migrerende CDK2, i samsvar med fosforylert-CDK2-protein (pCDK2) T160 (den aktive formen av CDK2), spesielt ved 48 timer p.i. (Fig. 3A, baner 7 og 8). Vi bekreftet raskere migrering form av CDK2 med fosfor-CDK2 (T160) antistoff (# 2561, Cell signalering). Densitometrisk analyse av disse bandene viste at Adwt infeksjon forårsaket en 1.3 til 2.7 ganger økning (P = 0,03) i nivået av pCDK2 T160 og Adhz63 infeksjon forårsaket en 1,5 til 1,9 ganger økning (P = 0,0026) sammenlignet med mock-kontroll gruppe på 48 h pi (Fig. 3B, kolonnene 3 og 4). Resultatet i figur 3B er lik den i figur 3A (kolonnene 7 og 8).
A549-celler ble infisert uekte eller infisert med AdGFP, Adwt, eller Adhz63 ved en MOI på 5. Celler ble samlet opp ved 24 t eller 48 t pi og deretter analysert ved hjelp av Western blot. Cellelysater ble immunoblottet for (A) cyclin E og CDK2; (B) pCDK2 T160; og (C) cyklin D, CDK4 og PCNA. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. Det skannede bandet intensiteten ble kvantifisert og verdiene representerer hjelp av den relative endringen prosenter sammenlignet med modellgruppe ± S.D. fra tre uavhengige tredoble eksperimenter. * P. 0,05 sammenlignet med modell kontrollgruppen, t-test
I tillegg til cyclin E, cyclin D er også involvert i overgangen til G
1-S-fasen . Således vi også undersøkt nivået av cyclin D. Interessant nok var nivået av cyclin D redusert etter viral infeksjon. Densitometrisk analyse av bandene vist at Adwt og Adhz63 infeksjon på 24 timer ble redusert cyklin D-proteinet til nivåer på 11% (P = 0,0000025) og 71% (p = 0,001) av den mock-infeksjon, henholdsvis (fig. 3C, kolonnene 3 og 4). Nivåene av cyklin D i celler infisert med Adwt eller Adhz63 var ytterligere redusert etter 48 timer til 3% (p = 0,00000043) og 8% (p = 0,00002), henholdsvis (fig. 3C, baner 7 og 8). I mellomtiden, nivået av CDK4 og prolifererende cell nuclear antigen (PCNA) hadde ingen signifikant endring i noen av gruppene. CDK4 er regulert og aktivert ved cyklin D for å behandle G
1-S overgang [67], [68]; PCNA, som er kjent for å regulere DNA-replikasjon, og DNA-reparasjon, er tilknyttet flere cyklin /CDK-komplekser i cellesyklusprogresjon [69], [70]. Resultatene viser at annonser redusert cyclin D produksjon og ikke påvirke nivåene av CDK4. Dermed Ad infeksjon spesifikt indusert cyclin EL som aktiveres CDK2 via fosforylering på sitt T160 området, noe som tyder på en kritisk rolle cyclin EL og CDK2 i Ad replikering.
adenovirus økning pRb fosforylering
Cyclin E- aktivert fosforylert CDK2 (pCDK2) er kjent for å kontrollere G
1-S-overgang ved fosforylering av nedstrøms substrater. Tatt i betraktning at pRb er en av de velkjente mål for pCDK2, undersøkte vi om økningen av aktivert pCDK2 endrer fosforylering av pRb ved S612, som er en foretrukket CDK2-fosforylering rest [71], [72]. Vi har funnet at nivået av fosfo-pRb S612 ble øket til 314% (p = 0,016) og 240% (P = 0,03) i celler infisert med henholdsvis Adwt og Adhz63, selv om proteinnivået av ufosforylerte pRb reduseres litt ( fig. 4A, kolonnene 3 og 4). Vi kunne ikke finne noen vesentlige endringer av p-pRb T821, en annen CDK2-foretrukne fosforylering rest [71], [73], og CDK4-foretrukne p-pRb S795 [74] (Fig. 4A). Resultatene tyder på at valg av S612 nettstedet i pRb av Ad-aktivert CDK2 for protein fosforylering.
A549 celler ble mock-smittet eller infisert med AdGFP, Adwt, eller Adhz63 og samlet inn på 24 timer eller 48 timer pi , etterfulgt av Western blot-analyse. Cellelysater ble immunoblottet for (A) pRb, fosfo-pRb (p-pRb) ved S612, S795 og T821 eller (B), p21 og p27. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. * P 0,05 sammenlignet med modell kontrollgruppen, t-test
adenovirus undertrykke CDK-hemmere
Vi observerte også at protein nivåer av både p21 og p27 er redusert. i A549-celler infisert med Adwt og Adhz63, særlig for p21 (figur 4B). p21 og p27 er de velkjente CDK-inhibitorer, noe som negativt regulerer aktiviteten av Cyclin E /CDK2-komplekser for å forhindre celle-syklusprogresjon [75] i. Densitometrisk analyse av disse bånd viste at nivået av p21-protein ble redusert til nivåer av 8% (P = 0,0000002) og 44% (p = 0,00066) av den mock-kontroll i A549-celler etter infeksjon med Adwt og Adhz63 ved 24 timer, respektivt (fig. 4B, kolonnene 3 og 4). Den p21 nivået ble ytterligere undertrykket i A549-celler etter 48 timer etter infeksjon med Adwt (2%, p = 0,00000034) og Adhz63 (6%, p = 0,0000007) (fig. 4B, baner 7 og 8). Ad infeksjon også redusert P27 protein nivå til 36% (Adwt, P = 0,0015) og 49% (Adhz63, P = 0,00043) på 24 timer; 16% (Adwt, p = 0,00012) og 37% (Adhz63, P = 0,0092) etter 48 timer i A549-celler (Fig. 4B). Resultatene antydet at annonser aktivere CDK2 ved å fremkalle cyclin EL og undertrykke p21 og p27.
Avbrudd av cyclin EL og CDK2 interaksjon reduserer adenovirus replikering
For ytterligere å undersøke hvilken rolle CDK2 i virusreplikasjon brukte vi CDK2 kjemisk inhibitor roscovitine (Ros, CYC202) for å avbryte cyclin EL og CDK2 samhandling. Ros er et purinderivat som hemmer aktiviteten av CDK2 ved binding til dets aktive sete [76]. Ros reduserer fosforylering på CDK2 [77] og blokkerer androstendion-induserte økningen av aktiv fosforylert CDK2 [78]. Ved aktivering av CDK2 er nødvendig for viral replikasjon, bør blokkerings CDK2-aktivitet redusere den. Figur 5A, som representerer en av de fire gjentatte forsøk, viser at med økt Ros, CPE forårsaket av Adwt og Adhz63 infeksjon ble delvis inhibert. Figur 5B viser at behandling med 5 uM av Ros førte til en 50% reduksjon i Adwt titer (P = 0,0002) og 71% reduksjon i Adhz63 titer (P = 0,034) sammenlignet med de bærer-kontrollgruppe ble behandlet med dimetylsulfoksyd (DMSO , definert som 0 uM Ros). Behandling med 10 mm Ros førte til flere reduksjoner av virus kreditter: 81% reduksjon i Adwt (P = 0,00001) og 87% reduksjon i Adhz63 (P = 0,012). De fortrengte virale utbyttene er i overensstemmelse med CPE fenomen i figur 5A.
(A) Celler ble behandlet med 0 um (kjøretøy-kontrollgruppen behandlet med DMSO), 5 uM eller 10 uM roscovitine, og mock- infisert eller infisert med AdGFP, Adwt eller Adhz63 ved en MOI på 5. All mikroskopi er opprinnelig ved en forstørrelse på X100 tatt ved 48 t pi (B) Viral titere ble bestemt ved 48 h p.i. med infeksjon metoden. Verdiene representerer gjennomsnitt ± S.D. uavhengige fire eksemplarer. * P 0,05 sammenlignet med 0 mikrometer roscovitine, Student
t
-test
Vi undersøkte nivåer av virus-DNA og proteiner som produseres i celler påvirkes av Ros behandling.. Den virale DNA-syntese ble bestemt ved Southern blot probet med Ad-genomet. Den lineære Adwt DNA er 36KB med totalt 28
Pst
I restriksjonsseter. Den største fragmentet er 4333 bp og den minste fragment er bare 12 bp. Størrelsene på de representative DNA-fragmenter ble avmerket på figur 6. Den virale DNA-syntese av Adwt og Adhz63 ved 24 timer p.i. ble sterkt hemmet i nærvær av 10 pM Ros (fig. 6A, kolonnene 6 og 12). Gjennomgående, de virale kapsidproteiner ble signifikant inhibert i nærvær av 10 pM Ros (fig. 6B, sporene 4 og 6). Hemning av CDK2-aktivitet med Ros redusert fosforylering av pRb på S612 området i AdGFP, Adwt og Adhz63-behandlede celler (Fig. 6C). Interessant, Ros behandling markert undertrykket induksjonen av cyclin EL-protein forårsaket av Adwt og Adhz63 infeksjon (fig. 6C, sporene 4 og 6). For å oppsummere, viser disse data at inhibering av CDK2 med Ros trykt pRb fosforylering og hemmet viral replikasjon.
(A), A549-celler ble samlet opp ved 0 timer og 24 timer p.i. Viral DNA-syntese ble bestemt ved Southern blot. Ved 24 timer p.i., ble cellene høstet og cellelysatene ble immunoblottet for (B) adenovirus type 5 kapsidproteiner, (C) cyclin EL, p-pRb S612, og aktin. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. * P. 0,05 sammenlignet med 0 mM roscovitine-behandlede gruppen, t-test
siRNA hemme CDK2 undertrykker adenovirus replikering ved å hindre pRb fosforylering
Siden den kjemiske hemmer Ros kan også påvirke andre CDK og kinaser [79], også søkte vi RNA interferens å spesifikt slå CDK2 uttrykk.
