Abstract
Exosomes er 30-150nM membranbundne utskilt vesikler som er lett isolert fra biologiske væsker som urin (UES). Exosomes inneholde proteiner, mikro RNA (miRNA), messenger RNA (mRNA), og lange ikke-kodende RNA (lncRNA) fra cellene sine opprinnelsesland. Selv miRNA, protein og lncRNA har blitt isolert fra serum som potensielle biomarkører for godartet og ondartet sykdom, er det ukjent om lncRNAs i UE fra urothelial blærekreft (UBC) pasienter kan tjene som biomarkører. lncRNAs er 200 nukleotid lange vitnemål som ikke koder proteiner og spiller avgjørende roller i tumorbiologi. Ettersom antallet av anerkjente tumorassosierte lncRNAs fortsetter å øke, er det en parallell behov for å inkludere lncRNAs til biomarkører og terapeutiske mål-algoritmer. Den lncRNA HOX transkripsjon antisans-RNA (varmluft) har vist seg å lette startfasen og progresjon og er assosiert med dårlig prognose i flere krefttyper. Betydningen av hotair i kreft biologi har skapt interesse for bruk av varmluft som en biomarkør og potensiell terapeutisk mål. Her viser vi hotair og flere tumorassosierte lncRNAs er anriket i UE fra UBC pasienter med høy grad av muskel-invasiv sykdom (HGMI pT2-pT4). Knockdown av hotair i UBC cellelinjer reduserer
in vitro
migrasjon og invasjon. Viktigere, tap av hotair uttrykk i UBC cellelinjer forandrer uttrykk for epitel-til-mesenchyme overgang (EMT) gener inkludert SNAI1, TWIST1, ZEB1, ZO1, MMP1 LAMB3, og LAMC2. Til slutt brukte vi RNA-sekvensering for å identifisere ytterligere fire lncRNAs anriket på UBC pasient UE. Disse data tyder på at UE-avledet lncRNA kan potensielt tjene som biomarkører og terapeutiske mål
Citation. Berrondo C, Flax J, Kucherov V, Siebert A, Osinski T, Rosenberg A, et al. (2016) uttrykk for Long ikke-kodende RNA hotair korrelerer med sykdomsprogresjon i blærekreft og finnes i blærekreft pasientUrin Exosomes. PLoS ONE 11 (1): e0147236. doi: 10,1371 /journal.pone.0147236
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, SPANIA
mottatt: 12 oktober 2015; Godkjent: 30 desember 2015; Publisert: 22 januar 2016
Copyright: © 2016 Berrondo et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. CTSI ved University of Rochester 5UL1TR000042-09
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lncRNAs, er karakterutskrifter som er 5 «7-methylguanosine avkortet og heller polyadenylert eller unadenylated og er 200 nucleotide lang. Når regnet genomisk støy, er lncRNA viser seg å være viktige formidlere av normale cellulære prosesser, inkludert, utviklings imprinting, dosering kompensasjon, og cellulær differensiering samt funksjoner innen modne celler som kontroll av spleising og hormonregulering [1,2]. Feilregulering av lncRNA uttrykk har vist seg å være viktig i maligne prosesser som tumorprogresjon [3-6].
Med bruk av transkriptomet-wide RNA-sekvensering (RNA-seq) oppdagelsen av lncRNAs har økt betydelig. Nylig Iyer
et al
brukes
ab initio
forsamlingen til RNA-sekvensering (RNA-seq) biblioteker fra flere svulster å avdekke tusenvis av avstamning og kreft-assosiert lncRNAs understreker viktigheten av å inkludere lncRNA inn biomarkør og terapeutiske mål oppdagelse algoritmer [7].
En utmerket kilde for biomarkører er exosomes. Exosomes er 30-150nM membranbundne utskilte vesikler som er lett renset fra kulturmedier og biologiske væsker, inkludert serum, ascites væske og urin (UE) [8-14]. Exosomes delta i interkommunikasjon ved å levere proteiner, miRNA, mRNA, og lncRNA til mottaker celler [15,16].
Det er nye bevis for at karakter emballasje i exosomes er ikke stokastisk og kan stole på signatur motiver og sekundær struktur. [17-20]. Videre onkogene signalisering slik som KRAS resulterer i selektiv pakking av miRNA inn i exosomes, hvilket indikerer at cellulær transformasjon kan danne et cancer-spesifikk exosome profil som kan tjene som biomarkører [21].
Spesielt, kvantitative sammenligninger av produsentceller versus exosomes viser at exosomes er markert oppbrukt i mRNA men beriket i lncRNA [18-20]. I tillegg lncRNAs vise større spesifisitet enn protein-kodende mRNA som biomarkører for kreft [22]. Gitt lncRNA er beriket i exosomes og utstillings kreft spesifisitet de er attraktive kandidater for biomarkører.
Flere grupper har vist at miRNA, mRNA og protein i serum-avledet (SES) og urin exosomes (UE) kan tjene som biomarkører for både godartet og ondartet sykdom [23-36]. For eksempel, vi tidligere identifisert, epidermal vekstfaktor-lignende gjentar og discoidin I-lignende domener 3 (EDIL-3) protein i exosomes fra urothelial blærekreft (UBC) cellelinjer og UE isolert fra UBC pasienter med høy grad av muskel invasive svulster (HGMI pT2-pT4) [34,37].
prostata og UBC forbundet lncRNAs har blitt isolert fra annullert celler eller frittflytende i urinen, og flere grupper har identifisert lncRNA i UE fra prostatakreftpasienter [28, 38,39]. Imidlertid har ingen publiserte studier vist at UBC UE-avledet lncRNAs kan tjene som biomarkører [28,38,39]. En fordel med å bruke UE er at exosome membranen beskytter innholdet mot proteaser og RNaser, som er allestedsnærværende i urin [40]. Nyere studier har vist at primær UBC svulster inneholder unike lncRNA derfor vi søkt å fange opp slike lncRNA i UE av UBC pasienter med HGMI sykdom [7]. En viktig medlem av klassen av tumor-assosierte lncRNAs er hotair, som blir overuttrykt, med så mye som 2000 ganger hos brystkreftpasient tumorer sammenlignet med normalt vev [3]. Hotair over-ekspresjon er også assosiert med økt invasivitet og dårlig prognose [3,41]. Viktigere, hotair har vist seg å regulere flere gener som er involvert i epitelial-til-mesenchyme overgang (EMT), inkludert snegle familie sink finger 1 (SNAI1), Laminin, beta 3 (LAMB3), Laminin, gamma 2 (LAMC2), synaptiske adhesjonsmolekyl 2 (JAM2) og ABL proto-onkogen 2 (ABL2) [3,42-44].
betydningen av hotair i UBC er i ferd med å komme frem i lyset gjennom flere nyere studier. For eksempel, Yan
et al
. vist at forhøyet uttrykk for hotair spår høyverdig ikke-muskel invasiv UBC (NMIBC) tilbakefall [45]. De opptrådte også
In vitro
studier som viser at hotair er involvert i migrasjon og invasjon og undertrykkelse av den kanoniske Wnt veien antagonist protein WIF-1 [45].
Martinez-Fernandez
et al
. undersøkt muligheten for at hotair uttrykk kan tjene som en prognostisk markør for tilbakefall av sykdommen i NMIBC [46]. De viste at pasienter med høyere nivåer av ekspresjon hotair hadde også tidligere tilbakefall av sykdommen. I tillegg viste de at Enhancer av Zeste 2 Polycomb Undertrykkende Complex 2 subenheten (EZH2) regulerer uttrykket av hotair. Til slutt brukte de Kreft Genomisk Atlas (TCGA) datasett for blærekreft å vise at hotair uttrykk er korrelert med stadium av UBC med de mest invasive T4 svulster som har det høyeste nivået av hotair uttrykk.
I en annen studie Sun
et al
. viste at mir-205 er viktig for inhibering av proliferasjon, migrering og invasjon av UBC cellelinjer. De identifiserte den cellesyklusregulering genet cyclin J (CCNJ) som en roman mål for MIR-205. Viktigere, viste de at hotair deltar i taushet av MIR-205 uttrykk i UBC cellene gjennom epigenetisk regulering [47].
Til sammen disse studiene viste hotair spiller viktige roller i UBC. Gitt betydningen av hotair i tumorprogresjon, er det økt interesse for å bruke hotair som en biomarkør samt et terapeutisk mål i kreft hvor hotair er abnormt uttrykt [2,48,49]. Viktigere, har en ikke-invasiv måte å oppdage hotair hos kreftpasienter, som UE, ville være ideelt for utvikling av biomarkører [15,16,23].
Her utvider vi omfanget av hotair engasjement i UBC biologi. For eksempel har vi identifisert ytterligere EMT faktorer som påvirkes av uttrykk for hotair. Kritisk vi vise hotair og andre lncRNA inkludert tumorassosiert lncRNAs Hoxa klynge anti RNA 2 (HOX-AS-2), Antisense ikke-kodende RNA i
INK4
locus (ANRIL), lang intergeniske RNA Regulator av Omprogrammering (Linc-RoR), er overexpressed i UBC cellelinjer og er beriket i exosomes isolert fra UBC cellelinjer. Vi viser også at hotair, HOX-AS-2, metastaser-forbundet lunge adenokarsinom transkripsjon 1 (MALAT1), og lincRoR er overexpressed i svulster og beriket i UE fra UBC pasienter med HGMI sykdom (pT2-pT4 på finalen cystektomi patologi). Viktigere, brukte vi RNA-seq å identifisere ytterligere og nye lncRNAs beriket i UE fra pasienter med HGMI (pT2-pT4) UBC sammenlignet med friske frivillige. Vi fant fire slike lncRNAs; Blæremola forbundet og trykt ikke-proteinkodende RNA 1 (HYMA1), Long intergeniske ikke-proteinkodende RNA 477 (LINC00477), LOC 100506688, Orthodenticle homeobox to antisense RNA 1 (OTX2-AS1)
Materialer og Metoder
Pasienter og frivillige
Denne studien ble godkjent av Forskningstemaer Review Board ved University of Rochester Medical Center (RSRB godkjenningsnummer IRB # 46706). Kjemoterapi naive pasienter som gjennomgår cystektomi for HG sykdom (slutt cystektomi patologi pT2-pT4) ble tatt med i denne studien. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne, og holdt i sikre filer per RSRB forskrifter. Forskningsdata ble kodet for å sikre at personer ikke kan identifiseres, direkte eller gjennom koblede identifikatorer, i samsvar med Institutt for helse og menneskelige forskriften for beskyttelse av menneske Motiver (45 CFR 46,101 (b)). Subject fødselsnummer ble også re-kodet for publisering. Vi samles urin, svulster, og distal normalt vev (DNT) fra pasienter. Vev ble hentet fra patologi i formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) blokker. Vev var hematoxylin og eosin farget for å bestemme tumorbærende vev og DNT (minst 3 cm fra tumor målt ved hjelp av en uavhengig patolog). Frivillige var friske 18+ år gammel med ingen historie med urologiske sykdommer.
RNA-sekvensering og dataanalyse
RNA mengden ble bestemt ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer og kvalitet ble bestemt med en Agilent Bioanalyzer, ved hjelp Pico analysen. RNA kvalitetskontroll, bibliotek forberedelse og sekvensering ble utført ved University of Rochester Genomics Research Center (GRC) med Ribo-utarmet cDNA bibliotek generert av TruSeq RNA kit V2 (Illumina). cDNA ble fragmentert, strekkode med Illumina-produserte adaptere, og PCR forsterket. Illumina HiSeq2500 ble brukt for høy gjennomstrømming RNA-sekvensering. Tjue millioner 125 bp pair-endte leser /prøven ble innhentet
For NSG databehandling.; rå 125 bp leser ble de-mutiplexed. Lav kompleksitet leser og vektor forurensning ble fjernet. Den FASTX toolkit (fast_quality_trimmer) ble brukt til å fjerne baser med kvalitet score under Q = 13 og justert til det menneskelige genom montering versjon hg19 /GRCh37 hjelp Burrows-Wheeler Aligner med standardinnstillinger. Les tellinger ble generert med HTSeq og mansjettknapper /Tophat ble brukt til ulike uttrykk analyse [50]
Cellelinjer
BC cellelinjer brukes. SV-høgskolen, 5637, TCC-SUP, T24 , UMUC3, HT1376, J82, og RT4, hentet fra ATCC. HEK293-celler ble anvendt for viral pakking. Celler ble dyrket i egnede medier, og i henhold til ATCC retningslinjer. UBC cellelinje identitet ble genetisk validert av DDC Medical
shHOTAIR og shScramble Stabil kloner
HEK293 celler ble transfektert med plasmider. PSPAX2, pMD2G, og GFP-uttrykker shRNA hotair (shHOTAIR) eller Scramble kontroll (shScramble) lentiviral vektorkonstruksjoner, som var sjenerøse gaver fra Systems BioScience (Mountain View, California). TCC-SUP og T24-celler ble infisert med shHOTAIR eller shScramble lentivirus og valgt av puromycin (2UG /ml) og FACS-sortert. Knockdown av varmluft ble bekreftet ved QRT-PCR.
siRNA
T24-celler ble sådd ut i 6-brønns plater i en konsentrasjon på 6×10
4 celler /brønn, og inkubert over natten. Inkubasjon og transfeksjon av siRNA hjelp DharmaFECT en reagens (GE biovitenskap, Dharmacon) ble utført i henhold til produserer protokollen. Spesielt for hver brønn, 2,5 pl av 5 pm siRNA og 1.37μL av DharmaFECT en reagens (GE biovitenskap Dharmacon) ble brukt. SiRNA brukt ble tidligere utgitt: siHOTAIR (siRNA-1 UAACAAGACCAGAGAGCUGUU, siRNA-2 CCACAUGAACGCCCAGAGAUU); og kontrollere siGFP (CUACAACAGCCACAACGUCdTdT.) ble oppnådd fra GE biovitenskap Dharmacon [51].
Exosome Utarbeidelse og Tracking Analysis
Exosome produserende cellelinjer TCC-SUP og T24 ble dyrket i Bioflasks som henhold til produsentens anbefalinger (CELLine 1000AD) i den aktuelle dyrkingsmedium supplert med 10% exosome-free FBS (EF-FBS). EF-FBS ble fremstilt ved ultrasentrifugering ved 100.000 x g ved 4 ° C i 18 timer.
Exosomes ble høstet ved sentrifugering og serieultrasentrifugering som tidligere beskrevet [34,52]. Exosome protein ble kvantifisert ved hjelp av en microBCA kit (Pierce) og partikkelanalyse ble utført ved hjelp av LM10 nanopartikkel karakterisering system (NanoSight) utstyrt med den blå laseren 488.
sårhelende, Trans-brønn og 3D Invasion Analyser
A sårhelende assay ble anvendt for å evaluert migrasjon [53]. Sår ble målt ved tiden null, bare etter at såret og firere senere. Lukking av sår ble målt ved bruk ImageJ programvare.
A trans-brønners analyse ble benyttet for å bestemme invasjons som beskrevet tidligere med modifikasjoner [54]. 1 × 10
5 celler i basal medium ble tilsatt 8um pore trans-brønn innsatser (Corning Inc.) pre-belagt med redusert vekstfaktor Cultrex (Trevigen Inc). Setter inn ble høstet, fast, og farget med 1% toluidinblått, fotografert, og det totale arealet av blå-farget celler ble beregnet ved hjelp av partikkelanalyse funksjon i ImageJ programvare.
For 3D invasjon analyse, 1325 celler /190 ul ble sådd på 3D mictrotissue
® plater (Sigma) på dag 0 [55,56]. Etter sfæroide dannelse, ble mediet erstattet med basalmembran ekstrakt (BME) (Cultrex). Spheroid bildene ble tatt ved hjelp Progres
® CapturePro 2.7.7 (jenoptik) sett med Axio observatør A1 mikroskop (Zeiss). Invasjonen ble målt som lengde og antall fremspring i media ved hjelp ImageJ.
Western blotting analyse
For Western blotting 20 ug av exosome eller cellelysat protein ble analysert ved 10% SDS PAGE. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av en microBCA kit (Pierce) i henhold til produsentens anbefalinger. Alix (3A9) (Cell Signaling Technology, Cat # 2171, 1: 1000 fortynning), GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Cat # sc-32233, 1: 200 fortynning), Snail (C15D3) (Cell Signaling Technology, Cat # 3879, 1: 1000 fortynning), ZEB1 (H-102) (Santa Cruz Biotechnology, Cat #: Sc-25388, 1: 200 fortynning), og Beta-Tubulin (Cell Signaling Technology, Cat # 2128, 1: 1000 fortynning). Anti-kanin-IgG-pepperrot peroksidase, anti-geit IgG-pepperrot peroksydase og anti-mus IgG-pepperrot peroksidase ble anvendt som sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology). Kjemiluminescens deteksjon ble utført ved hjelp av Super Signal West Femto maksimal følsomhet substrat (Thermo Scientific) i henhold til produsentens anbefalinger. Image Capture ble utført ved hjelp av en ChemiDoc bildesystem (Bio-Rad).
immunfluorescens
For immunfluorescens av shHOTAIR og shScramble TCC-SUP cellene ble fiksert i 4% paraformaldehyde og blokkert i 0,5% normalt geiteserum i PBST (0,3% Triton X-100 i PBS) i 1 time ved romtemperatur. Celler ble inkubert i ZEB1 (H-102) antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Cat #: Sc-25388, 1:50 fortynning i PBST) over natten ved 4 ° C, vasket tre ganger med PBS og deretter inkubert med sekundært antistoff geit anti- kanin IgG (H + L) Alexa Fluor
® 594 konjugat i 2 timer ved romtemperatur (Thermo Scientific Catalog #: A-11012, 1: 200 fortynning i PBST). Etter tre vasker i PBS, ble fargede celler montert i Vectashield HardSet Antifade Mounting Medium DAPI. ICC bildebehandling:
Celler ble farget og behandlet samtidig. Celler ble fotografert ved hjelp av en FV1000 Olympus laserskanning konfokalmikroskop med et 20x objektiv i URSMD lysmikroskopi delt ressurs. Laser og spenningsinnstillinger ble justert slik at intensitetsnivåer av DAPI og Alexa 594 uttrykk var innenfor den lineære området for alle bilder og innstillinger forble identisk for alle bilder. Få og offset ble justert for den første kontrollen bildet og deretter brukes på alle bildene. Et sideforhold på 1024 x 1024 og et Kalman midling av to ble anvendt. Alle innstillinger var identisk for alle fire grupper. Mønstrene er publisert i dette manuskriptet har blitt gjengitt i to separate eksperimenter og dataene representerer reproduserbare resultat av behandlinger og flekker for disse proteinene.
Elektronmikros
5 ul av exosome forberedelser ble plassert på 200 mesh kobbernett belagt med formvar /carbon og inkubert i 1-2 minutter. Rister ble farget med 20 ul av 2,0% fosfowolframsyre (pH 6,5) og fikk tørke. En Hitachi 7650 transmisjonselektronmikroskop på 80kv ble brukt til å vise eksempler. Representative elektronmikroskopi ble tatt med en Gatan Erlangshen 11 megapiksel digitalkamera.
RNA forberedelse
Urin ble samlet inn fra HG pasienter i operasjonsstuen etter induksjon av generell anestesi. Urin ble samlet fra friske frivillige ved poliklinikkene. Urin ble behandlet umiddelbart etter fjerning av celle detritus og store ekstracellulære vesikler med serie lav hastighet og høy hastighet sentrifugering [40]. Urin ble deretter alikvotert inn i 40 ml prøver og lagret ved -80 ° C inntil den endelige patologi ble bestemt.
Kun prøver fra pasienter som hadde slutt cystektomi tumorpatologi pT2-pT4 ble ytterligere bearbeidet for RNA ved bruk av urin Exosome RNA isolasjon kit som per produsentens instruksjoner (Norgen). RNA ble sendt umiddelbart etter isolering for RNA-sekvensering. Den gjenværende RNA ble lagret ved -80 ° C til RNA-sekvenseringsdata ble gjort tilgjengelig og RNA som var nødvendig for bekreftelse av RNA-sekvenseringsresultatene.
Cellelinje exosome RNA ble fremstilt ved anvendelse av TRIzol (Thermo Fisher Scientific) så henhold til produsentens anbefalinger. Cellelinje RNA ble utarbeidet etter den RNeasy mini pluss kit (Qiagen) i henhold til produsentens anbefalinger. Tissue RNA ble isolert med RNeasy FFPE kit (Qiagen) i henhold til produsentens anbefalinger. I alle tilfeller ble RNA fremstilt og umiddelbart anvendt for cDNA-generering og etterfølgende QRT-PCR.
cDNA ble generert med Bio-Rad iScript cDNA syntese kit. QRT-PCR ble utført med Bio-Rad SYBR-grønn og Bio-Rad CFX96 Real-Time system. Hus holde gener inkludert GAPDH og 18S, som begge er pakket inn i exosomes [57]. Den Normfinder programmet ble brukt til å finne riktig rengjøring genet for normalisering av QRT-PCR data. Basert på vurdering av beta-aktin, GAPDH, og 18S, analysen valgt enten GAPDH eller 18S. Den valgte husholdningsgenet er dokumentert i hver figur legende [58]. Primer sekvenser er oppført i S1 tabell.
Resultater
UBC cellelinjer inneholde tumorassosiert mRNA og lncRNA
For å identifisere mål lncRNA for analyse i UBC vi skjermet valgt lncRNAs og mRNA involvert i tumorprogresjon i andre epiteltumorer. Vi valgte fem lncRNAs (hotair, Hoxa-AS-2, lincRNA-ROR, MALAT1, og ANRIL) og tre mRNA Homeobox A13 (HOXA13), SRY-box 2 (SOX2) og POU klasse 5 homeobox 1 (POU5F1 /OCT4) innblandet i en rekke kreftformer, inkludert UBC.
for eksempel har Hoxa-AS-2 vist å undertrykke apoptose i promyelocytisk leukemiceller [59]. Den lincRNA-RoR ble vist å indusere EMT i bryst og hepatocellulære kreft [60]. Spesielt hotair ble vist å bli pakket inn i exosomes og derved påvirke kjemosensitivitet og overlevelse etter hypoksiske forhold i mottakercellene [16].
MALAT1 har vist seg å være en prediktor for metastase i en rekke kreftformer, inkludert UBC [61 , 62]. ANRIL øker celleproliferasjon og apoptose avtar i UBC-celler [63]. Mens HOXA13 øker både proliferasjon og invasjon, så vel som inhiberer apoptose i glioblastoma multiforme-celler [64]. Transkripsjonsfaktorene SOX2 og OCT4 kjøre normalt pluripotency av embryonale stamceller, men har nå blitt implisert i opprettholdelse kreft stamceller, som kan tjene som tumor-celler for å initiere et stort antall tumorer [65].
I forhold til nivået av ekspresjon av disse valgt lncRNA og mRNA i styre SV-40 udødelig ikke-tumorigen urothelial cellelinjen SV-HUC, fant vi forhøyet ekspresjon av varmluft, Hoxa-AS-2, ANRIL, og HOXA13 i T24 UBC cellene . Mens i TCC-SUP UBC cellelinje vi fant hotair, HOX-AS-2, ble Linc-RoR, ANRIL og HOXA13 forhøyet (figur 1A og 1B, henholdsvis).
QRT-PCR ble utført på cellelysatene fra et utvalg av UBC cellelinjer og styre SV-40 udødeliggjort urothelial cellelinjen SV-HH. Nivået av mRNA og lncRNA ekspresjon ble først normalisert til GAPDH og folde-change av genekspresjon i enkelte UBC cellelinjer ble sammenlignet med kontrollen SV-HUC celler. (A) T24 cellelysatene (B) TCC-SUP cellelysater. (C) QRT-PCR av hotair i UBC cellelinjer normalisert til SV-høgskolens cellelinje transkripsjonsnivåer. (n = 3 forsøk). Student t-tester ble brukt for alle eksperimenter for å identifisere statistisk signifikans i uttrykk mellom UBC og kontroll SV-høgskolens celler (fig 1A-1C) * p 0,05, ** p 0,001, *** p. 0,0001
Gitt betydningen av hotair i tumorprogresjon vi evaluert sitt uttrykk i antall UBC cellelinjer fra Grade II til Grad IV. Vi fant at UBC cellelinjer har et bredt spekter av varmluft uttrykk med TCC-SUP (grad IV) som har det høyeste og T24 (grad III) et mellomliggende nivå av ekspresjon (Fig 1C). Disse dataene støtter nylig publisert observasjoner av det brede utvalget av hotair uttrykk i UBC cellelinjer [66]. Gitt at T24 uttrykt middels nivå og TCC-SUP uttrykt relativt høyere nivåer av hotair sammenlignet med andre UBC cellelinjer (figur 1C), valgte vi disse to cellelinjer for å vurdere de funksjonelle rollene hotair i UBC.
hotair påvirker UBC celle migrasjon og invasjon
in vitro
hotair har vist seg å påvirke migrasjon og invasjon i bryst, mage, esophageal og kolorektal kreft [3,51,67,68]. For å vise at hotair har funksjonelle roller i UBC, vi først generert hotair knockdown cellelinjer med shRNA mot hotair i T24 og TCC-SUP celler. (S1 A og S1B figur, henholdsvis). Knockdown av hotair i T24 og TCC-SUP UBC cellelinjer førte til redusert migrasjon i en standard ripe sår analysen (figur 2A og 2B).
Avstand fra migrasjon ble målt etter ripe sår analyse av lentiviral shRNA knockdown av hotair vs. kontroll shScramble (A) T24 og (B) TCC-SUP UBC cellelinjer. Trans-invasjon godt assay av shHOTAIR vs. kontroll shScramble (C) og T24 (D). TCC-SUP cellelinjer (E) 3-D invasjonen analysen som sammenligner shScramble kontroll TCC-SUP celler til shHOTAIR TCC-SUP celler. Cellene blir sådd i microtissue
® generert caster gels og lov til å danne kuler. Etter at sfæroidene er dannet, blir BME forsiktig lagt over trinsen gel. Mørke sirkulære kuler vises og pilene peker på projeksjoner av invadere celler i det omkringliggende BME. F. Etter 7 dager med kultur, projeksjon lengder ble målt fra spheroid overflaten til den distale enden ved hjelp ImageJ og den gjennomsnittlige lengden av projeksjon bestemmes for hver celletype. T-test ble benyttet for å bestemme statistiske forskjeller i hvert eksperiment presentert (AF) * p 0,1, ** p 0,05, *** p. 0,01 (n = 3-6 eksperimenter /panel)
Invasion ble undersøkt av både trans-brønn og 3-D analysesystemer (microtissues
®). I 3-D kultur tumorceller spontant danne sfæroider. Det er godt etablert at celler dyrket som 3-D sfæroider maksimal celle-til-celle-interaksjoner og etterligne virkemåten nærmere endogent vev [55,56]. Hotair knockdown cellene var mindre invasiv både trans-brønn (Fig 2C og 2D) og 3-D-analyser (Fig 2E og 2F).
hotair påvirker epitel-til-mesenchyme overgang genekspresjon
EMT er tenkt å være en viktig onkogen overgang som kreftceller distansere fra epiteliale ark og invadere i omkringliggende vev. Hotair har vist seg å påvirke både aktivering og undertrykkelse av mange EMT pathway-medierende gener i flere epiteliale kreftformer [3,69,70]. EMT gener har vist seg å regulere tumorinvasjon i
in vitro
analyser som trans-godt-analysen og
in vivo
under tumorinvasjon i hver svulst undersøkt [71,72].
Vi forventet at redusert migrering og invasjon som vi observert i de UBC hotair knockdown-celler er vist i figur 2A-2F var på grunn av virkningene av varmluft for EMT genekspresjon. Hotair har vist seg å både indusere og undertrykke flere gener som er involvert i EMT inkludert SNAI1, LAMC2, LAMB3, ABL2, JAM2, PCDHB5, og PCDHB10 [3]. Men hotair ikke regulere disse genene i hver tumortype [48].
For å adressere hotair /EMT sti forhold i UBC, brukte vi QRT-PCR for å evaluere hotair målgener tidligere identifiserte i tillegg til flere andre EMT faktorer i shScramble kontrollceller sammenlignet med shHOTAIR UBC cellelinjer.
fig 3A og 3B viser at både shHOTAIR T24 og shHOTAIR TCC-SUP cellelinjer hadde redusert uttrykk for SNAI1, en mester regulator av EMT, samt som EMT pathway gener LAMB3 og LAMBC2 mRNA forhold til shScramble kontroller. Men vi fant ikke at hotair knockdown påvirket uttrykk for JAM2, ABL2, PCDHB5 eller PCDHB 10 (data ikke vist). Derfor sjekket vi basalnivået uttrykk for disse kjente hotair mål i T24 og TCC-SUP celle (S2 fig). Selv om de tidligere identifiserte målene for hotair ble uttrykt i både T24 og TCC-SUP, ble deres uttrykk ikke påvirket av tap av hotair (data ikke vist).
(A) QRT-PCR kjente hotair målgener og klassisk EMT faktorer mRNA i shHOTAIR T24 forhold til shScramble T24 UBC celler. (B) EMT target gen mRNA uttrykk i shHOTAIR TCC-SUP celler i forhold til shScramble TCC-SUP celler (i paneler A og B EMT mRNA nivåer ble normalisert til GAPDH). (C) siRNA rettet mot hotair eller GFP ble anvendt i T24-celler og EMT faktorer ZEB1 og SNAI1 mRNA ekspresjon evaluert ved QRT-PCR (mRNA ble normalisert til 18 år). (D) Immun av T24 siGFP og siHOTAIR celler som viser redusert proteinnivå ZEB1 og SNAI1. GAPDH er en lasting kontroll. Beta-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Student t-test ble anvendt for å bestemme statistiske forskjeller mellom kontroll og hotair knockdown celler i QRT-PCR-forsøk er presentert (AC) * p 0,1, ** p 0,05, *** p 0,01 (n = 3-6 eksperimenter /panel).
Viktigere er uttrykk for to andre klassiske markører for EMT, Sink-finger E-box binding homeobox 1 (ZEB1), og Twist familie BHLH transkripsjonsfaktor 1 (TWIST1) ble redusert i shHOTAIR knockdown UBC cellelinjer (figur 3A og 3B).
uttrykk for E-cadherin (CDH1) og vimentin (VIM) mRNA ble evaluert i shScramble og shHOTAIR T24 og TCC-SUP cellelinjer. Både CDH1 og VIM mRNA ble uttrykt ved svært lave nivåer, og var uendret mellom shScramble og shHOTAIR cellelinjer som indikerer at hotair mest sannsynlig ikke medierer UBC-cellelinje invasivitet via endringer i disse to EMT-spillere (data ikke vist). Disse dataene er i samsvar med tidligere publiserte rapporter som viser at CDH1 og VIM er minimal uttrykt i T24 og TCC-SUP [73,74].
Interessant, Matrix metallopeptidase 1 (MMP1) mRNA uttrykk ble redusert i shHOTAIR TCC- SUP UBC-celler (figur 3b). MMP-1 protein kløyver interstitiell kollagener i den ekstracellulære matrise, og dermed tilrettelegge for tumorinvasjon [75]. Motsatt, vi observert økt uttrykk av Tight krysset protein 1 (TJP1 /ZO1) mRNA i shHOTAIR TCC-SUP UBC celler sammenlignet med shScramble kontrollceller (Fig 3B). ZO-1 protein opprettholder inter tett veikryss essensielle for epitel ark integritet [76]. Korrelasjonen for tap av hotair med økt uttrykk av ZO1 antyder at shHOTAIR TCC-SUP cellene er å gå tilbake til en mer epitelial fenotype. Videre disse data tyder på at hotair kan spille en rolle i å undertrykke noen epitelceller relaterte gener i TCC-SUP celler.
For å støtte resultatene av shHOTAIR knockdown dataene vi brukte tidligere utgitt siRNA rettet mot hotair å generere siHOTAIR knockdown T24 UBC celler [51] (S3 fig). Siden uttrykk for SNAI1 og ZEB1 mRNA ble begge rammet av hotair knockdown i T24 og TCC-SUP UBC celler (figur 3A og 3B, henholdsvis), vurderte vi mRNA (Fig 3C) og proteinnivåer (Fig 3D) av SNA1 og ZEB1 i siGFP og siHOTAIR T24 celler. Begge mRNA og proteinnivåer SNA1 og ZEB1 ble redusert i siHOTAIR knockdown T24 celler (figur 3D). Samlet støtter disse dataene sammenhengen mellom tap av hotair uttrykk med redusert migrasjon og invasjon og EMT faktor uttrykk i UBC cellelinjer.
HGMI (pT2-pt4) UBC svulster er beriket i tumor-assosiert lncRNA og mRNA
Svulster og DNT fra kjemoterapi naive pasienter som gjennomgår cystektomi for HG sykdom (bekreftet endelig patologisk stadium pT2-pT4) ble isolert med IRB godkjennelse. Pasient kliniske egenskaper er omtalt i S2 tabell.
Vi brukte QRT-PCR til å identifisere tumorassosiert lncRNA og mRNA i tumorer sammenlignet med DNT epitel fra de samme pasientene (fig 4a). Vi fant ut at hotair, HOX-AS-2, MALAT1 og to mRNA OCT4 og SOX2 har høyere nivåer av uttrykk enn DNT (uttrykket nivået av enkelte svulster ble slått sammen og sammenlignet med sammenslåtte DNT uttrykk nivåer).
( A) QRT-PCR av tumor-assosierte mRNAer og lncRNAs i svulster fra pasienter som gjennomgikk cystektomi for HG sykdom (slutt patologi pT2-pT4). Tumor og distal normalt vev (DNT) mRNA eller lncRNA var normalisert til 18s og deretter forholdet mellom tumoren til DNT ble beregnet. Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av t-test for å sammenligne tumor til DNT normalisert uttrykk, * p 0,05. (n = 10 pasienter). chemotherapy.
doi:10.1371/journal.pone.0147236.s006
(DOCX)
Acknowledgments
Functional
