Abstract
Bakgrunn
microRNAs (mirnas) er en klasse av korte ikke-kodende RNA som regulerer celle homeostase ved å hemme oversettelse eller nedverdigende mRNA av målgener, og dermed kan fungere som svulst suppressor gener eller onkogener. Rollen microRNAs i medulloblastoma har nylig blitt adressert. Vi antok at microRNAs forskjellig uttrykt ved normal CNS utvikling kan bli unormalt regulert i medulloblastoma og er funksjonelt viktig for medulloblastoma cellevekst.
Metodikk og hovedfunnene
Vi har undersøkt uttrykk for microRNAs i medulloblastoma og deretter undersøkt den funksjonelle rollen til en spesifikk en, MIR-128a, ved regulering av medulloblastoma cellevekst. Vi fant ut at mange microRNAs forbundet med normal neuronal differensiering er betydelig ned regulert i medulloblastoma. En av disse, MIR-128a, hemmer vekst av medulloblastoma celler ved å målrette den Bmi-en onkogen. I tillegg endrer MIR-128a den intracellulære redoks staten av tumorceller og fremmer cellealdringsprosessen.
Konklusjoner og Betydning
Her er vi rapportere romanen regulering av reaktive oksygenforbindelser (ROS) av mikroRNA 128a via den spesifikke inhibering av BMI-en onkogen. Vi viser at Mir-128a har vekst undertrykkende aktivitet i medulloblastoma og at denne aktiviteten er delvis mediert ved å målrette Bmi-en. Denne informasjonen har implikasjoner for modulering av redoks stater i kreftstamceller, som antas å være motstandsdyktig mot behandlingen på grunn av deres lave ROS-statene
Citation. Venkataraman S, Alimova jeg, Vifte R, Harris P, Foreman N, Vibhakar R (2010) mikroRNA 128a Øker Intracellulær ROS nivå av Targeting Bmi-en og Hemmer medulloblastoma kreft celle vekst ved å fremme senescence. PLoS ONE 5 (6): e10748. doi: 10,1371 /journal.pone.0010748
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 03.02.2010; Godkjent: 30. april 2010; Publisert: 21 juni 2010
Copyright: © 2010 Venkataraman et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Pediatric hjernesvulst Foundation (https://www.pbtfus.org/), de Bear Necessities Pediatric Cancer Foundation (https://www.bearnecessities.org) og National Institutes of Health-National Institute of nevrologiske lidelser og Stroke (NIH-ninds) stipend K08NS059790. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
medulloblastoma er den vanligste ondartet hjernesvulst av barndommen. Mens resultatene har bedret seg, det er betydelig terapi relatert sykelighet [1], [2]. I tillegg pasienter med høy risiko funksjoner fortsette å ha en dårlig prognose. Nylige fremskritt indikerer at medulloblastom oppstår fra lillehjernen granul celle forløpere eller neurale stamceller som ligger i lillehjernen [3], [4], [5], [6]. Mens de molekylære mekanismene som er involvert i medulloblastoma tumorigenesis ikke er godt definert, er det klart at det er unormal kontroll av normale utviklingsmessige mekanismer [7].
Nylig jobbe fra vår lab og andre har innblandet microRNAs som viktige regulatorer av medulloblastoma cellevekst [8], [9], [10]. MicroRNAs bestå av 18-22 nukleotid RNA-molekyler med post-transcriptional gene silencing aktivitet [11]. Hyppigst de kontrollere genekspresjon gjennom tilknytning til den 3′-ikke-translaterte området (3 «UTR) av gener og hemme proteintranslasjon [12]. MicroRNAs kan også destabilisere og megle degradering av RNA transkripsjoner [13]. I tillegg til sin rolle i normal utvikling, er microRNAs også forbundet med karsinogenese [14], [15]. Mange microRNAs er under uttrykt i humane svulster i forhold til normalt vev, mens noen er over uttrykt [16]. Viktigere, feilregulering av mikroRNA prosessering gir forbedret tumorigenesis [17]. I tillegg er et økende antall microRNAs forbundet med spesifikke kreft hos mennesker. For eksempel er mikroRNA 21 (MIR-21) over uttrykt i glioblastom, og hemming av MIR-21 hemmer glioblastom vekst
in vitro Hotell og
in vivo product: [18]. Andre har vist at MIR-137 og MIR-124 induserer differensiering av gliom stamceller [19]. Vi har tidligere vist at MIR-124 fungerer også som en tumor suppressor i medulloblastoma celler, mens andre nyere studier har innblandet Mir 17-92 polycistron som et onkogen i sonisk pinnsvin mediert medulloblastoma [9], [10], [20].
Disse og andre nyere studier tyder på at microRNAs er kritiske regulatorer av tumordannelse og at deres bidrag til medulloblastoma tumorigenesis er viktig. Derfor bestemte vi oss for å undersøke mikroRNA funksjon i medulloblastoma. Vi har utforsket muligheten for at ekspresjon av hjerne-anrikede microRNAs er endret i medulloblastom, og at noen av disse microRNAs kan spille en viktig regulatorisk rolle i denne tumor. Vi fant at flere microRNAs forbundet med normal neuronal differensiering er betydelig ned regulert i medulloblastoma. Av disse mikroRNA 128a (MIR-128a) ble sterkt nedregulert. Mens rollen til mir-128a har blitt undersøkt i astrocytic tumorer så som glioblastoma, er dens rolle i neuronal tumorer så som medulloblastoma ikke kjent. Her beskriver vi den funksjonelle rollen MIR-128a i medulloblastoma for første gang. Vi fant ut at Mir-128a hemmer vekst av medulloblastoma celler ved å målrette den Bmi-en onkogen og dermed øke steady-state nivåer av superoksid og fremme cellealdringsprosessen.
Resultater
Brain beriket microRNAs er forskjellig uttrykt i medulloblastoma
Som et første skritt til å ta rollen som mikroRNA i medulloblastoma vi utførte mikromatrisebasert analyse av mikroRNA i medulloblastoma celler og sammenlignet det med normal voksent menneske lillehjernen. Vi valgte å undersøke primær medulloblastoma celle explants ved passering 2 i kulturen for å unngå støy fra forurensende elementer av normal hjerne i biopsiprøver. Ut av de 385 menneskelige microRNAs analysert, 167 ble uttrykt på lavere nivåer i medulloblastoma i forhold til normal lillehjernen. Hierarkisk gruppering av mikroRNA uttrykket fullstendig adskilt på vanlig cerebellum fra medulloblastom prøvene (figur S1-A). Ytterligere analyse viste at redusert ekspresjon av 90 microRNAs i medulloblastom var statistisk signifikant (p 0,05). Denne listen ble deretter undersøkt for å skille microRNAs som ble uttrykt i alle tre lillehjernen prøver og statistisk redusert i alle tre medulloblastoma prøver. Dette snevret listen over statistisk signifikante menneskelige microRNAs med redusert uttrykk i alle tre medulloblastoma prøvene til 30 microRNAs (Figur S1-B). Av notatet, mange av de microRNAs hadde tidligere blitt identifisert som blir beriket i normal hjerne [21]. Noen, men ikke alle disse microRNAs ble også rapportert tidligere som blir redusert i medulloblastom sammenlignet med normal cerebellum [8], [9]. Sammenligning av datasettene med redusert microRNAs rapportert tidligere, og våre data viste at bare fem microRNAs ble påvist ved alle tre grupper (fig S2). Dette er MIR-124, MIR-129, MIR-138, MIR-150 og MIR-323. Vi har tidligere vist at MIR-124 er funksjonelt viktig i medulloblastoma mens biologi av de andre fire vanlige Mirs er ennå ikke klart [10]. Ferretti
et al
hadde ytterligere 12 microRNAs til felles med våre data satt der som Northcott
et al
hadde bare 3 ekstra microRNAs til felles med oss (figur S2). Videre var det 10 flere microRNAs som bare ble identifisert av oss som blir betydelig redusert i medulloblastoma (figur S2).
neste utføres real time RT-PCR på en kohort av disse miRNA i ytterligere prøver å validere vår microarray data (figur 1A). Sammenligning av primære medulloblastoma celler til både voksne og barn normal cerebellum avdekket en betydelig nedregulering av hjernen beriket microRNAs i medulloblastoma. Det er fire svært ned regulert microRNAs nemlig MIR-125, MIR-128a, MIR -139 og la 7g. Av disse fire microRNAs, ble MIR-139 identifisert av oss, men ikke i to tidligere rapporter [8], [9]. Videre kan vi samt Ferretti
et al
men ikke Northcott
et al
oppdaget MIR-128a som sank i medulloblastoma. Interessant voksen lillehjernen hadde høyere ekspresjon av mange av disse microRNAs i forhold til pediatrisk cerebellum. Ekspresjonen av høyt fortrengte microRNAs ble ytterligere bekreftet i et panel av medulloblastoma cellelinjer. I likhet med de primære eksplantater alle fire microRNAs ble redusert i cellelinjene når sammenlignet med normale cerebellum (figur 1B). I samsvar med tidligere publiserte data vi også funnet miR17-5p å være over-uttrykt i medulloblastoma [9].
A) mikroRNA varmekart profilering av medulloblastoma pasientprøver og sammenlignet med normal lillehjernen. B) undertrykkelse av MIR-125, MIR-128, MIR-139, la-7g og økt uttrykk av miR17-5p i medulloblastoma cellelinjer. C) Relativ uttrykk for microRNAs i medulloblastoma pasientprøver.
Neste vi undersøkte uttrykk for la-7g, MIR-125 og MIR-128a i primær medulloblastoma svulster og normal lillehjernen vev. Bruke qRT- PCR fant vi at alle tre mirnas er betydelig redusert i uttrykket i 10 arkiv medulloblastoma pasientprøver (ANOVA, p 0,001, figur 1C). Gitt den lille prøvesett, er det vanskelig å utvikle noen sammenheng med tumor sub-type eller pasientens utfall. Imidlertid ble prøvene ikke Gli1 høy, og således ikke i SHH underkategori [9], [22]. Disse data indikerer at disse microRNAs kunne ha en viktig biologisk rolle i medulloblastom. Basert på graden av MIR-128a trykt i medulloblastoma i motsetning til sin høye uttrykk i normal cerebellum, valgte vi å undersøke nærmere den funksjonelle rollen MIR-128a i medulloblastoma.
Re-uttrykk for MIR-128A avtar Daoy medulloblastoma cellevekst
for å avgjøre om gjen uttrykk for microRNAs endrer tumorcellevekst, transfektert vi Daoy medulloblastoma celler med mikroRNA forløper oligonukleotider. Disse mikroRNA forløpermolekyler er utformet for å etterligne endogene microRNAs. Re-ekspresjon av MIR-128a reduserte medulloblastom cellevekst som målt ved hjelp av MTT-analysen (figur 2A). Lignende funn ble registrert i D283 medulloblastoma cellelinje (data ikke vist). For ytterligere å evaluere veksthemmende virkning av MIR-128a, transfektert vi Daoy celler med kontroll MIR eller MIR-128A oligonukleotider og telte celler i 5 dager med trypan blått fargestoff eksklusjon metoden. I samsvar med MTT-data, redusert MIR-128a Daoy cellevekst på en doseavhengig måte (figur 2B).
A) MiR-128a inhiberer medulloblastom celleproliferasjon, målt ved MTT-analyse. (P 01) B) Antall Daoy celler som målt ved trypan blå eksklusjon fargestoff assay. C) Redusert kolonidannelse i MIR-128A transfekterte celler (øverste rad er MIR-128a vektor, er nederste rad kontroll vektor). D) kimtall i tre eksemplarer av 2 uavhengige eksperimenter. (P 0,001)
For å bedre evaluere virkningen av microRNAs på medulloblastoma celler vi brukte en lentiviral plasmid som uttrykker Mir-128a kassett og utførte kolonidannelse analyser. Som vist i figur 2C og D, transfeksjon med MIR-128a potent inhiberte kolonidannelse ved medulloblastom celler som indikerer at MIR-128a er en antatt tumor suppressor i medulloblastom. I tillegg MIR-128a potent redusert evne Daoy celler til å vokse i soft agar videre foreslå en svulst undertrykkende rolle for MIR-128a i medulloblastoma (figur S3).
mikroRNA 128a ned regulerer Bmi-1 i medulloblastoma celler
Vi neste utført en analyse av mulige mikroRNA målse bruker to brukte prediksjon algoritmer, TargetSCAN (https://www.targetscan.org) og PicTar (https://pictar.bio.nyu.edu) [23], [24]. Begge algoritmer spådde polycomb genet Bmi-en for å være et mål for MIR-128a. Målet nettstedet oppfyller frø kamp kriterier (figur 3A). For å eksperimentelt teste om våre spådd målene ble regulert av MIR-128a, ble Bmi-en målområde klonet i 3’UTR av Renilla luciferase genet i siCHECK vektor. Daoy celler ble transfektert med kontroll eller MIR-128A oligonukleotider. Kotransfeksjonen med MIR-128a sunket betraktelig Renilla luciferase aktivitet i BMI-1 mål språk vektorer, men ikke i de muterte språk vektorene (figur 3B). Disse dataene antyder at BMI-en er et mål på MIR-128a. En annen fersk studie av MIR-128a i glioma rapporterte også at Bmi-en er et mål for MIR-128a [25]. Dette er spesielt spennende siden polycomb gener spiller en viktig rolle i stamcelle fornyelse under embryogenese og er også kjent for å være biologisk viktig i neural celleproliferasjon og medulloblastoma patogenesen [26] -. [27]
A) speil 128a målområde i Bmi-en 3’UTR. B) Luciferase reporter-analyser tyder på at MIR-128a funksjonelt er rettet mot wt BMI-1 3’UTR, * p 0,01 C) Western blot-analyse bekrefter at MIR-128a, men ikke kontroll MIR (CM), hemmer protein ekspresjon av BMI -1 i medulloblastoma celler. D) Kvantifisering av Western blot band. (P 0,01)
For ytterligere å validere Bmi-en som et mål av MIR-128a, utførte vi immunoblot analyse av kontroll eller MIR-128a transfekterte celler. Daoy celler ble transfektert med kontroll eller MIR-128A oligonukleotider og høstet 48 timer senere. Western blot-analyse ble utført ved anvendelse av anti-BMI-1-antistoff. MiR-128a redusert Bmi-1 proteinnivåer i Daoy celler i samsvar med luciferase data. (Figur 3C, D).
mikroRNA 128a hemmer Bmi-en mediert signale
Bmi-1 er kjent for å undertrykker p16 uttrykk [28]. I fravær av BMI-1, p16 opp reguleres i nerve stamceller redusere celleproliferasjonen [26]. Dessuten har det vist seg at BMI-1-mediert represjon av p16 kan føre til økt aggressiv oppførsel av melanoma stamceller [29]. Daoy og ONS76 medulloblastoma celler transfektert med MIR-128a oppregulert p16 som oppdaget av vestlige blotting (Figur 4A). De samme cellelinjer når transfektert med Bmi-en helt fortrengt p16 uttrykk. For ytterligere å bekrefte at Mir-128a hindrer undertrykkelse av p16 ved å hemme Bmi-en, både Daoy og ONS76 cellelinjer ble ko-transfektert med MIR-128a og BMI-en. Dette resulterte i en moderat økning i p16-protein-nivå sammenlignet med celler transfektert bare med BMI-1.
A) Western blot-analyse viste økt p16-ekspresjon i Daoy celler transfektert med MIR-128a i forhold til den av kontroll vektor, pVETL. Nivået av p16-ekspresjon ble fullstendig hemmet i Daoy celler som ble transfektert med den BMI-1-vektoren alene, mens beskjeden inhibering ble observert i celler ko-transfektert med MIR-128a. B) Redusert E2F1 aktivitet i Daoy celler transfektert med MIR-128a målt ved luciferaserapportørplasmid analyser. (P 0,01)
Tidligere studier tyder på at Bmi-1 hemmer p16 og forsterker dermed E2F1 aktivitet [30]. E2F transkripsjonsfaktorer spiller en viktig rolle i reguleringen av mobilnettet spredning og terminal differensiering. Derfor er virkningen av MIR-128a på E2F1 transkripsjonen aktivitet ble undersøkt. Det ble funnet at transfeksjon av MIR-128a inn i Daoy cellene betydelig redusert E2F1 aktivitet som målt ved hjelp av luciferase reporter-aktivitet, p 0,05 (figur 4B). Dette er i tråd med våre funn at Mir-128a reduserer Bmi-en og øker p16.
Bmi-en er en funksjonell del av MIR-128a mediert medulloblastoma cellevekst arrest
For ytterligere å vurdere om bmi-en undertrykkelse er en funksjonell del av MIR-128a vekst arrest fenotype vi undersøkt om bmi-en kan redde MIR-128a vekst arrest i medulloblastoma celler. Medulloblastom-celler ble transfektert med MIR-128a, MIR-128a og BMI-en eller de tilsvarende kontroller og cellene utsettes for kolonien fokus analysen. Co-transfeksjon av MIR-128a med Bmi-en resulterte i demping av MIR-128a mediert vekst arrest i begge Daoy celler (figur 5A og B). Daoy celler ko-transfektert med Bmi-en mangler sin 3’UTR og MIR-128a også reddet spredning av celler som hemmet av MIR-128a alene (Figur S4A). Dette tyder klart på at Mir-128a rettet Bmi-en og redusere celle overlevelse. En annen medulloblastoma cellelinjen viste ONS76 celler også den samme trenden i plating effektivitet når transfektert med MIR-128a og BMI-en (figur S4B). Denne informasjonen funksjonelt plasserer Bmi-en i MIR-128a kaskade.
A) Co-transfeksjon av Daoy celler med MIR-128a og BMI-en økt antall kolonier dannet sammenlignet med MIR-128a alene . B) Kvantitativ analyse av antall kolonier dannet ved Daoy celler etter forskjellige transfeksjoner, inkludert BMI-1 som mangler sin 3’UTR. pBABE-puro er en styrevektor for hele lengden BMI-1. * P 0,05 for MIR-128a vs. pVETL og ** p 0,001 for MIR-128a vs. MIR-128a + Bmi-en
mikroRNA 128a øker steady-state nivå av superoksid. i Daoy celler
Nylig har det blitt vist at fravær av Bmi-1 fører til økt (ROS) nivåer reaktive oksygenforbindelser i celler avledet fra Bmi-1 knockout mus [31]. ROS er vel kjent for å modulere en rekke forskjellige cellulære funksjoner inkludert kreft cellebiologi [32]. Gitt at MIR-128a redusert Bmi-1 protein nivåer, ønsket vi å teste om en lignende økning i ROS-nivåer var tydelig i Daoy celler behandlet med MIR-128a. Vi utførte spin fangst av frie radikaler og elektron paramagnetisk resonans (EPR) spektroskopi for å avdekke om det var en økning i ROS-nivå i cellene re-uttrykke MIR-128a. Spinnfelle, DMPO ble valgt på grunn av sin lave cytotoksisitet, tilgjengelighet til cellen, og omsetning med hydroksylradikaler (° OH) under dannelse av en særegen DMPO-OH sentrifuge adduktet [33]. Omsetningen av DMPO med superoksid gir et produkt (DMPO-OOH) som omdannes til DMPO-OH ved GPX i celler. Derfor er DMPO en nyttig probe for deteksjon av oksygen-sentrert radikaler som oppstår fra superoksid og H
2o
2. EPJ-spektra viser en typisk 1:2:2:1 DMPO-OH kvartett (lukkede sirkler, figur 6A-ii). EPR resultater viser klart en økning i DMPO-OH kvartett intensitet i Daoy celler som uttrykker MIR-128a sammenlignet med den tomme vektoren (figur 6A-i). For å identifisere nøyaktig hvorvidt den DMPO-OH kvartett signal kan skyldes direkte til superoksyd eller til H
2o
2, Daoy celler transfektert med MIR-128a ble inkubert med CuZn SOD i 30 minutter før tilsetningen av DMPO. Tilsats av SOD betydelig redusert EPR-signal høyde som tyder på at den DMPO-OH-signalet er direkte skyldes superoksyd (figur 6A-iii). Den kvantitative analysen av kvartett signal høyde (figur 6B) viste en signifikant økning (p 0,05) av superoksyd i celler forbigående transfektert med MIR-128a i forhold til celler behandlet med kontrollvektor. Denne økningen i signalintensitet ble inhibert ved tilsetning av SOD. Det er derfor klart at Mir-128a øker steady-state nivå av superoksid i medulloblastoma celler. For ytterligere å bekrefte at økningen i ROS skyldes hemming av Bmi-en, Daoy celler ble ko-transfektert med Bmi-1 og MIR-128a. Dette resulterte i en redusert ROS nivå i celler, sammenlignet med den i MIR-128a alene (figur 6A-iv). Rednings eksperimenter med Bmi-en mangler sin 3’UTR også avdekket at Mir-128a rettet Bmi-en og dermed fører til økning i ROS-nivå i celler (figur S5)
A) Økte superoxide radikaler dannes i Daoy celler som ble transfektert med MIR-128a som oppdages ved hjelp av EPJ spektra av DMPO-OH spinn addukt (stengt sirkler i (ii)). De innsamlede spektra er et signal gjennomsnitt på 15 skanninger. Den 1:2:2:1 (lukkede sirkler) kvartett signal sett skyldes dannelsen av DMPO-OH. Cellene behandlet med MIR-128a har ~3 gangers økning i ROS signalintensitet (ii) sammenlignet med den tomme vektoren (i). Co-transfeksjon av celler med MIR-128a og BMI-1 resulterte i en redusert ROS nivå sammenlignet med den MIR-128a alene (iii). Behandlingen av SOD i MIR-128a-transfekterte celler opphevet signalene viser at radikalet som dannes er hovedsakelig superoksid (iv). B) Den kvantitative analyse av EPR topphøyde normalisert til celleantall. * P. 0,05 miR128a vs. pVETL og MIR-128a + SOD
mikroRNA 128a induserer celle senescence i Daoy celler
reaktive oksygenforbindelser, et biprodukt av oksidativt stress kan forårsake irreversible cellevekst arrest og senescence [34]. Videre de opphører celler har vesentlig flere ROS i forhold til apoptotiske celler [35]. I tillegg p16 uttrykk er en av hall merker av mobilnettet senescence [36]. Gitt at vi har funnet MIR-128a transfekterte celler Daoy viste økt i den stabile tilstand nivået av ROS, økte i p16-proteinnivå og demonstrerte en cellevekstarrest, utførte vi en analyse for begynnende alderdom. Fem dager etter transfeksjon med MIR-128a, et økt antall av senescens-assosiert β-galaktosidase ble observert (SA-β-gal) positive celler (figur 7A). Det var en femdobling i senescent celler etter MIR-128a transfeksjon av celler i forhold til tom vektor transfekterte celler (figur 7B) Lignende data ble observert i ONS 76 medulloblastoma celler (figur S6).
En ) MiR-128a induserer senescence i medulloblastoma celler som oppdages av SA-beta galaktosidase farging (mørk blå celler, eksempler angitt av røde piler). B) Celletall pr høy drevet Field of β-gal-positive celler i kontrollvektor (pVETL) eller MIR-128a transfekterte celler, * p = 0,003. C) Western blot-analyse som viser økt nivå av H3K9me2 protein i Daoy celler transfektert med MIR-128a når sammenlignet med den tomme vektoren. Actin brukes som en intern kontroll.
For ytterligere å støtte vårt funn at Mir-128a transfeksjon fører til mobilnettet senescence, vi undersøkte metylering nivåer av histon 3, lysin 9 (H3K9) av western blotting. Senescence-forbundet heterochromatin foci er forbundet med metylering av histoner 3 lysin 9 (H3K9me2). Interessant, re-uttrykk for MIR-128a resulterte i økt metylering av histoner 3 lysin 9 (H3K9me2), en annen mark av fortrengte genuttrykk mediert av BMI-en polycomb repressor komplekse (figur 7C). Alle disse resultatene tyder sterkt på at den veksthemmende virkning fra Mir-128a er på grunn av alderdom-signalveien som utløses av økningen i ROS
Diskusjoner
Her er vi rapportere romanen regulering av reaktiv oksygen arter av mikroRNA 128a via spesifikk hemming av Bmi-en onkogen. Den funksjonelle rollen til mikroRNA 128a i medulloblastom har ikke tidligere blitt beskrevet.
Vi har funnet betydelig nedregulering av flere microRNAs kjent for å være involvert i CNS-utvikling i medulloblastom ,. Våre data er i tråd med tidligere studier som har beskrevet redusert uttrykk for microRNAs i medulloblastoma [8], [9]. Ferretti
et al
fant 55 microRNAs å bli nedregulert i medulloblastoma med forskjeller i uttrykk blant de store histologiske subtyper [8]. Tilsvar Northcott
et al
funnet 61 microRNAs å bli redusert i medulloblastoma sammenlignet med normal cerebellum [9]. Interessant når videre klassifisert i 4 molekylære grupper det var signifikante forskjeller i mikroRNA uttrykk. For eksempel Sonic Hedge Hog (SHH) drevet svulster hadde redusert uttrykk av 10 microRNAs men ingen som overlappet med microRNAs identifisert av oss eller av Ferretti
et al
. Faktisk sammenligning analyse viste signifikante forskjeller mellom de microRNAs detektert av de tre gruppene (figur S2). Disse forskjellene er sannsynligvis relatert til plattformene som brukes av hver gruppe, tumor kilde og kilden og alder på normal cerebellum anvendes. Vi brukte primære celle eksplantater i kultur ved passasje 2, mens de to andre gruppene anvendt biopsimateriale. Videre våre pasient vev var alle av klassisk histologi, og ikke har et gen uttrykk signatur for SHH. Av notatet både vår studie og rapport fra Ferretti
et al.
Fant at Mir-128a ble betydelig redusert i uttrykk i medulloblastoma sammenlignet med normal lillehjernen.
Vi viser at dette reduserte uttrykket er en egenskap av primære tumorprøver, samt et panel av vanlig brukte medulloblastom cellelinjer. Denne informasjonen vil være av særlig bruk som mikroRNA funksjon er videre analysert i medulloblastoma. Av merk miR17-5p klyngen ble over uttrykt i våre prøver, som er i samsvar med tidligere rapporter [9].
Analysen av re-uttrykke MIR-128a i medulloblastoma celler viste at Mir-128a hemmet veksten av medulloblastoma celler mest sannsynlig ved å redusere spredning. MiR-128a demonstrert kreft undertrykkende effekter av potent hemme koloni dannelsen av medulloblastoma celler. Videre analyser av mulige mekanismer avdekket at BMI-en onkogen var en antatt mål av MIR-128a. Vi demonstrerte at BMI-1-proteinet blir nedregulert ved MIR-128a, som i sin tur fører til en økning i p16 en cellecyklus-inhibitor. Regulering av Bmi-en ved microRNAs er spennende gitt at Bmi-en er over-uttrykt i medulloblastoma og kritisk for normal lillehjernen utvikling [27]. Bmi-en er også avgjørende for neural stamcelle selvfornyelse [26]. Bmi-en ble også nylig vist seg å være et mål av MIR-128a i glioblastom [25]. Våre data utvider denne observasjonen ved å vise at hemming av Bmi-en er funksjonelt avgjørende for Mir-128a vekst undertrykkende funksjon. Gjenopprette Bmi-1 uttrykk i MIR-128A uttrykker celler redder medulloblastoma celler fra vekst arrest. Vi ønsket å utforske videre mekanismen av MIR-128a-Bmi-en sti i medulloblastoma.
Nyere data tyder på at Bmi-1 regulerer reaktive oksygenforbindelser [31]. Vi viser at mikroRNA 128a induserer intracellulær superoksid generasjon, muligens ved å regulere Bmi-1-nivå og at Bmi-en re-uttrykk reverserer superoksid generasjon. Nylige bevis antyder at kreft stamceller er mer motstandsdyktig mot behandling på grunn av en lavere total redox state [37]. Dermed modulerende reguleringsmekanismer av ROS generasjon i kreftstamceller kanskje en nyttig strategi for å ødelegge disse cellene. Vi ser for oss et scenario der mikroRNA 128a kan brukes til å indusere ROS i medulloblastoma stamceller og dermed gjøre dem mer radiosensitive. Nøkkelen er å modulere homeostase av ROS. Ved normale konsentrasjoner, ROS spille en rolle i cellefunksjoner som involverer signaltransduksjon. Imidlertid, til en ubalanse mellom generering av ROS og kapasitet av antioksidanter nøytralisere ROS kan resultere i en forstyrrelse av celle redoks-status, som fører til oksidativt stress. Vår observasjon av økt steady-state nivå av ROS, og induksjon i p16 kan bidra til tidlig-senescence i celler som uttrykker Mir-128a (figur S7).
I sammendraget beskriver vi den funksjonelle rollen mikroRNA 128a i medulloblastoma. Vi viser at mikroRNA 128a reduserer medulloblastoma cellevekst gjennom mekanismer som involverer ROS og begynnende alderdom. Vi undersøker nå hvilken rolle mikroRNA 128a i radio-sensibiliserende medulloblastoma bruker
in vivo
ortotopiske xenograft modeller.
Materialer og metoder
celler, vev og kultur
Daoy og D283 medulloblastom-celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Rockville, Md.) og dyrket i DMEM-medium (Gibco, Grand Island, NY) supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco) i henhold til leverandørens anbefalinger . Cellelinje ONS76 ble vennlig levert av Dr. James T. Rutka (University of Toronto, Canada) og ble dyrket i DMEM inneholder 10% FBS. D341 ble oppnådd fra ATCC og dyrket i DMEM med 20% FBS og 1% natrium-pyruvat og L-glutamin. Primære cellekulturer ble avledet fra biopsiprøver av medulloblastoma pasienter under en protokoll godkjent av Institutional Review Board ved University of Iowa sykehus og klinikker. Skriftlig samtykke fra alle pasienter ble oppnådd som bestemt ved University of Iowa IRB. Kulturer ble opprettholdt ved lave passasjenummer (P2-P4) i DMEM-medium supplert med 20% føtalt bovint serum. Normale menneskelige lillehjernen og medulloblastoma pasientprøver ble innhentet fra Pediatric Co-operative menneskelig vev Network (Columbus, Ohio) under en University of Iowa IRB godkjent protokoll. Alle prøver ble oppnådd i en anonym måte som bestemt ved IRB. Prøvene vi Normal lillehjernen prøvene var fra nonmalignant pediatriske og voksne hjernen. Alle medulloblastoma prøvene var fra pediatriske pasienter. Detaljer om pasientprøver er tidligere beskrevet [38]. Kort fortalt alle prøvene var fra ikke-metastaserende (M0) svulster med klassisk medulloblastoma histologi.
mikroRNA Isolasjon og kvantitativ PCR-analyse
Små RNA ble isolert ved hjelp av Mirvana RNA isolering kit (Ambion).
mikroRNA uttrykk ble målt ved kvantitativ PCR hjelp av en ABI 7700 termisk-cycler. MikroRNA primere og prober ble kjøpt fra Applied Biosystems (Foster City, CA) og analysene er utført i henhold til produsentens anbefalinger med flere modifikasjoner for å gjøre oss i stand til å oppdage lav overflod microRNAs. For revers transkripsjon (RT) reaksjon 20 nanogram total RNA ble benyttet. For qPCR reaksjon resulterende cDNA ble fortynnet 1:02. Hver RT-trinnet ble utført i duplikat og qPCR i tre eksemplarer for hvert RT reaksjon. U6b og U66 små RNA ble brukt som endogene kontroller og relativ mikroRNA kvantum beregnet av ΔΔCT metoden.
Transient transfeksjon av Daoy celler med MIR-128a og analyse av celleproliferasjon og levedyktighet
Celleproliferering ble målt ved MTT-analyse og cellelevedyktigheten ble bestemt ved trypan blå eksklusjon fargestoff assay. Til analyse for celleproliferasjon ble medulloblastoma celler transfektert med kontroll Mir, Mir-9 eller MIR-128a oligonukleotid på 24 brønners plater ved hjelp av LT1 reagens (Mirus, Madison WI). 6, 000 celler /brønn ble deretter sådd ut i triplikat i 96-brønners plater i 100 ul medium. Etter 2 dager, ble 100 ul av celle Titer vannløsning (Promega, Madison, WI) tilsatt og cellene ble inkubert i 1 time og absorbansen målt ved 490 nm ved anvendelse av en mikroplateleser i henhold til produsentens anbefalinger. Relative celleantall ble beregnet ved normalisering av absorbansen til ubehandlede celler.
assay for celle-levedyktighet, Daoy celler ble sådd i en 6-brønns plate og 24 timer senere ble cellene transfektert med kontroll MIR eller med to forskjellige konsentrasjoner av
