Abstract
Benmorfogenetiske proteiner (BMP) er sterkt konservert morphogens som er avgjørende for normal utvikling. BMP-2 er høyt uttrykt i de fleste ikke-småcellet lungekarsinom (NSCLC), men ikke i normalt lungevev eller godartede lungesvulster. Virkningene av BMP signalkaskade på veksten og overlevelsen av kreftceller er dårlig forstått. Vi viser at BMP-signalering er basalt aktiv i lungecancercellelinjer, som kan effektivt inhiberes med selektive antagonister av BMP type I-reseptorer. Lungecancercellelinjer uttrykker alk2, alk3, og alk6 og inhibering av en enkelt BMP reseptor ble ikke er tilstrekkelig til å redusere signalering. Inhibering av mer enn en type I-reseptoren var nødvendig for å redusere BMP signalisering i lungecancercellelinjer. BMP-reseptor-antagonister og stanse av BMP type I-reseptorer med siRNA-indusert celledød, inhiberte cellevekst, og forårsaket en signifikant reduksjon i ekspresjon av inhibitor av differensiering (Id1, ID2, og ID3) familiemedlemmer, som er kjent for å regulere cellevekst og overlevelse i mange typer kreft. BMP-reseptor-antagonister har også redusert klonogene cellevekst. Knockdown av ID3 betydelig redusert cellevekst og indusert celledød av lungekreftceller. H1299-celler som stabilt overuttrykker ID3 var resistente mot veksthemming og induksjon av celledød indusert av BMP-antagonist DMH2. Disse studiene tyder på at BMP signale fremmer cellevekst og overlevelse av lungekreftceller, som er mediert gjennom sin regulering av ID-familiemedlemmer. Selektive antagonister av BMP type I reseptorer representerer en potensiell betyr for farmakologisk behandling av NSCLC og andre karsinomer med en aktivert BMP signalkaskade
Citation. Langenfeld E, Hong CC, Lanke G, Langenfeld J (2013) Bone Morfogenetisk protein Type i-reseptorantagonister Nedgang Vekst og indusere celledød av Lung Cancer Cell Lines. PLoS ONE 8 (4): e61256. doi: 10,1371 /journal.pone.0061256
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt 27. januar 2012; Godkjent: 11 mars 2013; Publisert: 12. april 2013
Copyright: © 2013 Langenfeld et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. forfatterne har følgende interesse. De små molekyler som brukes i eksperimentet representerer potensielle medikamenter for å behandle pasienter med kreft. En previsionary patentsøknad er innlevert på den potensielle bruken av disse molekylene i kreft. Det er ingen andre patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Benmorfogenetiske proteiner (BMP) er medlemmer av den transformerende vekstfaktor-superfamilien (TGF). BMP er phytogenetically konserverte proteiner som kreves for embryoutvikling fra insekter til mennesker. Omtrent 20 BMP ligander er identifisert og kategorisert i flere underklasser. BMP-2 og BMP-4 deler 92% homologi og har utskiftbare biologisk aktivitet. BMP utskilles proteiner som signaliserer gjennom trans serin /treonin kinaser kalles type I og type II-reseptorer [1]. Den type I-reseptorer er alk 1, alk2 (ActR-1), alk3 (BMPR-IA), og alk6 (BMPR-IB) [1]. Den type II-reseptorer er BMPR-II og activin type II-reseptorer ActR-II og ACR-IIB [1]. BMP-reseptorer er promiskuøse, og kan aktiveres av flere BMP-ligander [1], [2]. Hver BMP ligand er også i stand til å aktivere forskjellige reseptorer [1], [2]. Binding av ligander til BMP den type I reseptor fører til fosforylering av konstitutivt aktiv type II-reseptoren. Den reseptorkomplekset fosforylerer Smad-1/5, som så aktiverer transkripsjonen av nedstrøms målgener [3].
I løpet av embryonisk utvikling, BMP regulerer celle skjebnen avgjørelser, celleoverlevelse, og vaskulogenese [4], [5 ], [6], [7], prosesser som også er vanlig i kreftutvikling. Faktisk er BMP-2 overuttrykt i 98% av NSCLC og andre karsinomer [8], [9]. BMP uttrykk inverst korrelert med overlevelse [10] og høy ekspresjon er assosiert med metastatisk spredning [11], [12]. BMP-2 forbedrer tumor angiogenese [13], [14], [15] og stimulerer tumorinvasjon [8]. Ektopisk ekspresjon av BMP-2 i A549 lungekreftceller sterkt forbedret metastatisk vekst i en murin modell av lungekreft etter haleveneinjeksjon [16]. Studier ved hjelp av rekombinante proteiner eller BMP-knockdown av en enkelt BMP reseptor har antydet at BMP-signalering i kreftceller ikke fremmer cellevekst og kan også fungere som en tumor suppressor (16-19). Virkningene av inhibering av flere BMP-reseptorer på cellevekst og overlevelse hos kreftceller er ikke blitt undersøkt. Derfor er den biologiske betydning av et basalt aktiv BMP signalkaskade i kreftceller ikke kjent.
I løpet av utvikling av inhibitorer av DNA-bindende /differensiering (Id) er direkte mediatorer av BMP signalering. Det er 4 Id familiemedlemmer (ID1, ID2, ID3, og Id4). BMP responselementer (BRE) på ID1, ID2, og ID3 arrangører aktiveres ved Smad 1/5/8 (20-23). ID-proteiner hemme avstamning engasjement ved å binde og avsette grunn HLH transkripsjonsfaktorer [17]. Id familiemedlemmer har vært implisert i onkogen transformasjon i flere typer kreft [18] [19], [20]. Id1 er blitt rapportert å regulere invasjon, spredning, overlevelse, og den metastatisk spredning av kreftceller [18], [21], [22]. Id familiemedlemmer er ofte uttrykt i ikke-småcellet lungekarsinom [23], [24] og over-ekspresjon er assosiert med et kortere sykdomsfri overlevelse [25]. Disse studiene tyder på at målretting signalveier som regulerer uttrykket av Id familiemedlemmer kan ha viktige terapeutiske implikasjoner. Selv rekombinante BNIP2 proteiner induserer en forbigående økning i uttrykket av Id1 i lungekreft celler [8], rollen som BMP signalkaskade i å regulere basale uttrykk nivåer av ID familiemedlemmer i kreftceller er ikke utredet.
Formålet med denne studien var å fastslå i lungekreftcellelinjer, som ikke har blitt stimulert med en rekombinant BMP protein, enten celler har et basalt aktiv BMP signalering og bestemme dens effekt på cellevekst, overlevelse, og uttrykk for Id familiemedlemmer. Selektiv BMP type I-reseptor-antagonister og siRNA målretting BMP type I-reseptorer viser at basalt aktiv BMP signalering i lungecancercellelinjer er vekstfremmende og en viktig regulator av ekspresjonen av ID-familiemedlemmer. BMP-signalering er mediert gjennom flere enn en type I BMP reseptor. DMH2 forårsaket størst hemming av BMP signalisering og induserte den største reduksjonen av cellevekst og uttrykk for Id familiemedlemmer.
Resultater
BMP Type I-reseptorantagonister Reduser Smad 1/5/8 signale
Ved hjelp av en BMP-responsive luciferase reporter (BRE-Luc), undersøkte vi effekten av de ulike BMP typen reseptorantagonister på Smad 1/5/8 aktivitet i H1299 celler. Dorsomorphin, DMH1, DMH2, og LDN alle forårsaket en signifikant reduksjon i ekspresjon av BRE-Luc reporter på H1299-celler, noe som indikerer en reduksjon i Smad 1/5/8 aktivitet (figur 1A). Immunoblot analyse viste at selektiv BMP type I reseptorantagonister redusere fosforylering av Smad 1/5/8 i H1299 og A549 celler (figur 1B og figur S1). Fosforylering av Smad 1/5/8 ble redusert innen 24 timer etter behandling og vedvarte i minst 48 timer etterpå.
(A) H1299 celler ble transfektert med BRE-luciferaseaktivitet reporter. Etter 48 timer ble cellene behandlet med DMSO, 10 uM Dorsomorphin, eller 1 uM DMH1, 1 uM DMH2, eller 1 uM LDN i 48 timer. BRE-luciferaseaktivitet blir rapportert som prosent av kontroll DMSO behandlede celler. Dataene representerer gjennomsnittet av 3 forsøk in triplo. Gjennomsnittet av kontrollcellene ble sammenlignet med gjennomsnittet av de behandlede celler. * P 0,05. (B) immunoblotanalyse for fosforylerte Smad 1/5/8 av H1299 celler behandlet med 1 mikrometer DMSO, DMH1, eller DMH2 for 12, 24 og 48 timer.
BMP Type I-reseptorantagonister Nedgang uttrykk av Id familiemedlemmer
Kvantitativ RT-PCR ble benyttet for å bestemme hvorvidt BMP signalkaskade regulerer uttrykket av Id familiemedlemmer i lunge kreft cellelinjer. Dorsomorphin, DMH1, og DMH2 betydelig redusert Id1, ID2, og ID3 uttrykk i A549 og H1299 cellelinjer (figur 2A-B). BMP-antagonister forårsaket en større reduksjon av Id familiemedlemmer i H1299 cellene i forhold til A549 celler. Ved Western blot-analyse, Dorsomorphin, DMH1, DMH2, og LDN forårsaket en reduksjon i proteinnivåer Id1 og ID3 i A549 og H1299-celler (figur 2C-D og figur S2). BMP antagonister redusert uttrykk av Id familiemedlemmer innen 12 til 24 timer som vedvarte i minst 48 timer. DMH1 og DMH2 forårsaket en større reduksjon av Id1 i H1299-celler i forhold til A549-celler. DMH2 gående forårsaket en større reduksjon av Id1 protein ekspresjon enn DMH1.
(A-B) Kvantitativ RT-PCR for Id1, ID2, ID3 og på (A) og A549 (B) H1299-celler behandlet med DMSO, 10 mm Dorsomorphin, 1fiM DMH1, eller 1fiM DMH2 i 48 timer. Dataene representerer gjennomsnittet av minst 3 eksperimenter utført i duplikat, og presentert som prosent av kontroll-behandlede celler. Gjennomsnittet av kontrollcellene ble sammenlignet med gjennomsnittet av de behandlede celler. * P 0,05. (C-D) Western blot-analyse for Id1 og ID3 på (C) A549 og (D) H1299 celler behandlet med 1 uM DMSO eller 1 uM av selektiv BMP type I reseptor antagonist for 12, 24 og 48 timer. Disse studiene ble utført minst 3 ganger.
Multiple BMP Type I reseptorene medierer signale
Neste, vi vurdert om en bestemt BMP type I reseptor formidler basalt aktiv BMP signalisering i lungekreft cellelinjer. Ved kvantitativ RT-PCR, ble ekspresjon av BMP type I-reseptorer undersøkes. Alk1 ble ikke uttrykt i enten A549 eller H1299 celler (figur 3a). Som forventet, ble alk 1 uttrykt i humane endotelceller (data ikke vist). Alk2, alk3, og alk6 mRNA er uttrykt i A549 og H1299 cellelinjer (figur 3a). Ved hjelp av siRNA, ble ekspresjonen av hver type I reseptor redusert med omtrent 40% eller høyere (figur 3B). For å teste spesifisitet av siRNA, knockdown av hver type I reseptor ble utført og RT-PCR utføres for alk 2, alk3, og alk6. Knockdown av alk2 forårsaket en signifikant økning i ekspresjonen av alk6 (figur 3C). Knockdown av alk3 og alk6 forårsaket en liten nedgang i uttrykket av de andre type I reseptorer (figur 3C). Kvantitativ RT-PCR viste at stanse av alk2 og alk3 i H1299 cellene forårsaket en 20-25% reduksjon i ekspresjonen av mRNA Id1 (figur 3D), mens tie av alk6 tendens til å forårsake en økning i Id1 uttrykk. Dempe både alk 2 og alk3 forårsaket en betydelig større reduksjon i Id1 uttrykk enn knockdown av enten reseptor alene (figur 3D). Western blot analyse viste at knockdown av en enkelt type IA-reseptoren alene ikke redusere Id1 uttrykket (figur 3E). Stanse av både alk 2 og alk3 eller stanse all alk 2, alk3, og alk6 gjorde føre til en reduksjon i Id1 protein uttrykk (figur 3E). Kvantitativ RT-PCR viste at knockdown av multiple reseptorer ført en reduksjon i alle type BMP-reseptorer, som var større enn det som ble sett for enkelt reseptor knock-out (figur 3F).
(A) kvantitativ RT-PCR av A549 og H1299-celler som viser ekspresjon av alk2, alk3, og alk6 men ikke alk 1 (n = 3). (B) H1299-celler ble transfektert med siRNA rettet mot hver type I BMP reseptor og kvantitativ RT-PCR ble utført for at BMP reseptor. (C) knockdown av hver BMP type I reseptoren i H1299-celler ble utført og kvantitativ RT-PCR utført for alle tre type I-reseptorer. (B-C) Dataene representerer gjennomsnittet av 2 eksperimenter utført i duplikat. (D) knockdown i H1299 celler av en enkelt BMP type I-reseptor eller begge alk2 og alk3. Etter 48 timer ble ekspresjon av Id1 ble undersøkt ved kvantitativ RT-PCR. Dataene representerer gjennomsnittet av 3 eksperimenter utført i duplikat. (E) Western blot-analyse for Id1 på H1299-celler med knockdown av en enkelt type I BMP-reseptoren eller en kombinasjon av knockdown alk2 og alk3, eller alle tre BMP type I-reseptorer. Studiene ble gjort minst 2 ganger. Studier viser tie mer enn en reseptor er nødvendig for å redusere Id1 uttrykk. (F) Kvantitativ RT-PCR av type I BMP-reseptorer etter knockdown av alk2 og alk3, eller alle tre BMP type I-reseptorer. Studier utført 3 ganger i duplikat rapportert som prosent av kontroll. (G) H1299-celler ble ko-transfektert med insertless vektor, konstitutivt aktiv alk3 (CA-alk3), eller konstitutivt aktiv alk6 (ca-alk6) ekspresjonsvektorer og BRE-luciferase reporter. Cellene ble deretter behandlet med 1 uM DMSO eller 1 uM BMP-reseptor-antagonist i 24 timer og luciferaseaktivitet ble målt. Dataene viser den midlere av minst 3 uavhengige eksperimenter er vist som prosent av kontroll.
Et annet sett med siRNA rettet mot hver BMP type I reseptoren ble brukt for å vurdere BMP signale ytterligere. Disse siRNA også forårsaket en signifikant reduksjon i ekspresjon av den målrettede reseptoren i A549 og H1299 celler (figur S3). Å undersøke spesifisiteten av disse siRNA også vist at knockdown av en enkelt reseptor forårsaket noen nedregulering av den andre type I BMP-reseptorer (figur S3). Disse dataene tyder på at det er kryss regulering mellom de forskjellige type I BMP-reseptorer. Igjen, knockdown av en enkelt type I BMP reseptor var ikke tilstrekkelig til å redusere Id1 ekspresjon i enten A549 og H1299 celler (figur S3). For ytterligere å undersøke BMP reseptor signalisering, ble hver reseptor taushet og Smad 1/5/8 aktivitet bestemmes ved hjelp av BRE-luciferase assay. Dempe bare en BMP type I reseptor ikke føre til en reduksjon i Smad-1 /5/8 aktivitet (figur S3). Ved QRT-PCR, knockdown av alle tre type I BMP-reseptorer i A549 cellene forårsaket en vesentlig reduksjon i ekspresjonen av Id1 (figur S3). Knockdown av alle typer jeg BMP reseptorer (alk 2, alk3, og alk6) ble bekreftet av QRT-PCR (figur S3). Western blot-analyse viste igjen at knockdown av en enkelt reseptor på H1299-celler var ikke tilstrekkelig til å redusere ekspresjonen av Id1 (figur S3). I samsvar med våre andre sett av siRNA, knockdown av alk 2 + alk3 eller alk 2, alk3, og alk6 forårsaket en reduksjon i protein uttrykk for Id1 (figur S3). Disse data understøtter den BMP-signalering er mediert gjennom flere enn en type I BMP reseptor i lungecancercellelinjer.
I C2C12 mus myoblast cellelinje, hemmet DMH1 alk2 og alk3 aktivitet, men ble rapportert å ha ubetydelig inhibitoriske effekter på alk6 [26]. DMH2 er kjent for å hemme alk2 og LDN hemmer effektivt alk2, alk3, og alk6 [26]. For å teste reseptor selektivitet DMH1, DMH2, og LDN i lunge kreftceller, konstitutivt aktiv alk3 (ca-alk3) eller alk6 (ca-alk6) ble ko-transfektert med BRE-luciferaseaktivitet reporter i H1299 celler (figur 3G). DMH2 forårsaket en større reduksjon av alk3 aktivitet enn DMH1 og LDN i H1299 celler. BMP-antagonister forårsaket noen hemming av alk6 men mindre enn det man ser for alk3 (figur 3G).
Hemming av BMP type I reseptorer Reduserer cellevekst
Deretter effekten av å blokkere BMP type I reseptorer på celleveksten ble undersøkt ved å utføre celletellinger. BMP type I-reseptor-antagonister forårsaket en signifikant reduksjon i antallet celler etter 7 dager i både A549 og H1299 cellelinjer (figur 4A). De selektive BMP-reseptor-antagonister som skyldes en større reduksjon i cellevekst i de H1299-celler i forhold til A549-celler. DMH2 forårsaket betydelig mer veksthemming enn DMH1 i begge cellelinjer (figur 4A). For å fjerne eventuelle BMP-ligander i cellekulturmediet, de H1299 cellene ble dyrket i serumfritt medium og behandlet med DMH2. DMH2 også forårsaket signifikant inhibering av cellevekst av H1299 celler dyrket i serumfritt medium (SFM) (figur 4B), som antyder at BMP signale mai forekommer i en selv autonom måte. Proliferasjon ble undersøkt ved å bestemme bromdeoksyuridin (BrdU) inkorporering. DMH2 forårsaket en doseavhengig reduksjon i proliferasjon av de H1299 celler i løpet av 24 timer (figur 4C) og en mer dyptgripende virkning ble observert etter 48 timer (figur 4C). Knockdown av alle tre type I BMP-reseptorer (alk2, alk3, og alk6) i H1299 cellene også forårsaket en signifikant reduksjon i BrdU-inkorporering (figur 4D). Knockdown av alk2, alk3, og alk6 ved hjelp av det andre settet av siRNA også forårsaket en signifikant reduksjon av proliferasjon i H1299-celler (figur S3). Kvantitativ RT-PCR viste at med dette andre settet med siRNA rettet mot alle tre type I BMP reseptorer i H1299 cellene forårsaket nedregulering av alk 2 og alk6 men ikke alk3 (figur S3). Dette tyder på at hemming av alk2 og alk6 er tilstrekkelig til å redusere BMP signalering i H1299 celler.
(A) A549 og H1299 celler dyrket i DMEM 5% FCS ble behandlet med DMSO, 10 mm Dorsomorphin, 1fiM DMH1, 1 mikrometer DMH2, eller 1fiM LDN i 7 dager og celletelling utført. (B) H1299 celler dyrket i SFM ble behandlet med 1 uM DMSO eller 1 uM DMH2 i 7 dager, og celletellinger foretas. (C) BrdU-inkorporering av H1299 celler behandlet med DMSO eller 1 uM eller 5 uM DMH2 i 24 og 48 timer. (D) BrdU-inkorporering av H1299-celler transfektert med siRNA målretting av alle type I BMP-reseptorer eller siRNA kontroll. (C-D) Data er middel av 3 forsøk in triplo rapportert som prosent av kontroll-behandlede celler. (E-G) Colony vekst av A549 og H1299 celler behandlet med 1 uM DMSO eller 1 uM av selektiv BMP reseptor-antagonist. (E) Fotografi av en representant eksperiment. (F-G) Dataene viser den midlere av minst 3 uavhengige eksperimenter rapportert som prosent av kontroll. (G) DMH1 reduserer forankringsuavhengig vekst av lungekreftcellelinjer. A549 og H1299-celler i bløt agar ble behandlet med 1 pM DMS0 eller 1 uM DMH1 i 2 uker, og antallet kolonier telles. Dataene som vises er gjennomsnittet av 3 uavhengige forsøk rapportert som prosent av kontroll.
BMP Type I-reseptorantagonister Reduser klonogene Vekst
Effekten av BMP-reseptorantagonister på klonogene cellevekst ble undersøkt. DMH1, DMH2, og LDN alle forårsaket en signifikant reduksjon av klonogene vekst i både A549 og H1299 cellelinjer (figur 4E-G). Klonogene vekst ble hemmet mer av DMH2 og LDN enn DMH1 (figur 4E-G). For å vurdere virkningene av DMH1 på klonogene vekst videre, ble forankringsuavhengig vekst undersøkt. DMH1 betydelig redusert forankringsuavhengig vekst i både A549 og H1299 celler (figur 4H). Disse dataene viser at basalt aktiv BMP signale stimulerer spredning og forbedrer klonogene vekst av lungekreftceller.
Hemming av BMP Type I reseptorene celledød
Effekten av BMP signalering på celle overlevelse ble undersøkt . Celledød ble kvantifisert ved hjelp av en etidiumbromid opptaksanalyse. Etidiumbromid blir bare tatt opp av celler som har tapt membranintegritet, som oppstår når cellene dør ved nekrose eller apoptose [27]. BMH2 indusert celledød i H1299-celler i løpet av 12 timer, og etter 48 timer alt av antagonistene forårsaket en signifikant økning i prosentandelen av døde celler (figur 5A). Innen 48 timer, Dorsomorphin, DMH1, og DMH2 forårsaket en signifikant økning i celledød i A549-celler (figur 5B). For å vurdere ytterligere celledød, ble H1299-celler dyrket i DMEM 5% FCS behandlet med DMH2 i 4 dager og prosentandelen av døde celler bestemmes ved trypanblått farging. DMH2 forårsaket en betydelig økning i celledød, som var doseavhengig (figur 5C). Prosenten av døde celler var enda høyere i H1299-celler dyrket i SFM (figur 5D). Et amin-reaktivt fluorescerende fargestoff ble anvendt for å detektere celledød, noe som også viste at DMH2 indusert celledød i H1299-celler (figur 5E). For ytterligere å bekrefte at BMP-antagonister indusere celledød ved hemming av BMP signalering, trippel knockdown av alk 2, alk3, og alk6 reseptorer ble utført. Knockdown av alk 2, alk3, og alk6 reseptorer forårsaket en betydelig økning i andelen av døde celler i forhold til siRNA kontroll behandlede celler (figur 5F). Et annet sett med siRNA rettet mot alk 2, alk3, og alk6 forårsaket også en betydelig økning i andelen av dødsceller (figur S3). Disse studiene viser at antagonisere aktiviteten av BMP type I-reseptorer induserer celledød i lungecancerceller.
(A-B) H1299 og A549 dyrket i DMEM 5% FCS ble behandlet med DMSO eller en BMP reseptor antagonist (10 mm Dorsomorphin eller 1fiM av selektiv antagonist). Prosentandelen av celler som tar opp etidiumbromid ble deretter bestemt. Dataene er rapportert som gjennomsnittet av minst 3 uavhengige eksperimenter. (C) H1299-celler dyrket i DMEM 5% FCS ble behandlet med DMSO, 1 uM og μ5 M av DMH2 i 7 dager, farget med Typan blå, og celletelling gjennomført. Dataene representerer gjennomsnittet av 4 forsøk som er rapportert som prosent døde celler. (D) H1299-celler dyrket i SFM ble behandlet med DMSO eller 1 uM av DMH2 i 7 dager, farget med Typan blå, og celletelling gjennomført. Dataene representerer gjennomsnittet av 5 forsøk som er rapportert som prosent døde celler. (E) Celledød ble bestemt ved anvendelse av flowcytometri detektere opptak av et amin-reaktivt fluorescerende fargestoff i H1299 celler behandlet med DMS0 eller DMH2 i 4 dager. Data representerer gjennomsnittet av 3 uavhengige eksperimenter. (F) Den H1299 celler ble transfektert med kontroll siRNA og siRNA rettet mot alk2, alk3, og alk6. Etter 2 dager prosentandelen av celler farging for etidiumbromid ble bestemt. Dataene er rapportert som gjennomsnittet av 6 uavhengige eksperimenter.
BMP Signalering er regulert i en selvstyrte Manner
induksjon av celledød og veksthemming indusert av BMP-reseptorantagonister av lungekreft cellelinjer som vokser i SFM antydet at BMP signalering oppstår i en selv selvstendig måte. Tidligere undersøkelser har vist at lungecancer-cellelinjer fremstille den modne BNIP2 protein, som er den aktive formen [8]. For å sikre at lungekreftceller utskiller BNIP2, ble en ELISA av cellekulturmedier utført. BNIP2 protein ble ikke påvist i DMEM med 5% føtalt kalve (FCS) eller i serumfritt medium (SFM) (figur 6A). BNIP2 ble påvist i mediet når lungekreft cellelinjer ble dyrket i enten SFM eller DMEM med 5% FCS (figur 6A). Siden andre BMP kan være i FCS, ble virkningen av BMP-reseptor-antagonister for regulering av BMP signale undersøkt i SFM. Fosforylert Smad 1/5 og Id1 ekspresjon ble påvist i H1299-celler dyrket i serumfritt medium (figur 6B). BMP type I-reseptor antagonister redusert pSmad 1/5 og Id1 ekspresjon av H1299 celler dyrket i SFM (se figur 6B).
(A) En BNIP2 Elisa ble utført på DMEM 5% FCS og SFM i fravær av -celler (medium). En BNIP2 Elisa ble utført på DMEM 5% FCS og SFM cellekulturmedium inneholdende A549 og H1299-celler i 48 timer. Eksperimenter representerer gjennomsnittet av minst 5 eksperimenter utført i tre eksemplarer. (B) BMP-antagonister redusere BMP signalisering av lungekreft celler dyrket i SFM. H1299 celler dyrket i SFM ble behandlet med 1 mikrometer DMSO, 1fiM av DMH2 eller 1fiM av LDN i 48 timer og Western blot analyse utført. (C) Kvantitativ RT-PCR for BNIP2 uttrykk 48 timer etter transfeksjon H1299 celler med kontroll siRNA eller siRNA målretting BNIP2. Data representerer prosent av kontroll av gjennomsnittet av 4 uavhengige eksperimenter. (D) Western blot-analyse av H1299-celler i SFM 48 timer etter at de er transfektert med kontroll siRNA eller siRNA målretting BNIP2. BNIP2 knockdown fører til en reduksjon i uttrykket av pSmad 1/5 og Id1. (E) knockdown av BNIP2 induserer celledød. H1299 celler i SFM ble transfektert med kontroll siRNA eller siRNA målretting BNIP2. Etter 48 timer ble prosentandelen av døde celler ble bestemt ved etidiumbromidfarging. Dataene representerer gjennomsnittet av 4 uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer.
For ytterligere å undersøke selvstyrte signalering av BMP signalkaskade, ble BNIP2 uttrykk slått ned ved hjelp av siRNA. Kvantitativ RT-PCR viste at siRNA målretting BNIP2 forårsaket en større enn 60% reduksjon i ekspresjonen av BNIP2 (figur 6C). Knockdown av BNIP2 av H1299 celler dyrket i SFM forårsaket en reduksjon i protein ekspresjon av fosforylert Smad 1/5 og Id1 (figur 6D). BNIP2 knockdown forårsaket en signifikant økning i prosentandelen av døde lungekreftceller som vokser i SFM (figur 6E). Disse studiene tyder på at basal BMP aktivitet av lungekreftcellelinjer er stimulert i en selv selvstendig måte, noe som kan bli hemmet ved å motvirke BMP type I reseptorer.
knockdown av Id1 og ID3 Reduserer cellevekst og induserer celle død
Deretter undersøkte vi om Id1 og /eller ID3 regulerer celle overlevelse og vekst av lungekreft celler. Knockdown av Id1 hjelp siRNA førte til en reduksjon i proteinnivået Id1 men ikke ID3 (figur 7A). Knockdown av ID3 forårsaket en reduksjon på ID3 protein nivåer uten å påvirke uttrykket av Id1 (figur 7A). Kvantitativ RT-PCR viste også en reduksjon i Id1 og ID3 henholdsvis (figur 7B). Knockdown av Id1 eller ID3 i H1299 celler forårsaket en signifikant økning i prosentandelen av døde celler som bestemt ved etidiumbromidfarging (figur 7C). Celletall ved hjelp av Trypan blå farging viste at knockdown av Id1 redusert cellevekst og indusert celledød, men nådde ikke statistisk signifikans (figur 7D, F). Knockdown av ID3 har føre til en meget betydelig bort i cellevekst og induksjon av celledød når sammenlignet med kontroller (figur 7D, F). Disse studiene tyder på at reduksjon av Id uttrykk er i det minste delvis den mekanismen som BMP-reseptor-antagonister indusere celledød og redusere cellevekst. I H1299 celler, kan ID3 ha en større rolle i å regulere BMP signale enn Id1.
(A) Western blot analyse for Id1 og ID3 48 timer etter H1299 celler ble transfektert med kontroll siRNA og siRNA rettet mot Id1 eller ID3. (B) Kvantitativ RT-PCR for Id1 og ID3 etter H1299 celler ble transfektert med kontroll siRNA og siRNA rettet mot Id1 eller ID3. Data representerer prosent kontroll av gjennomsnittet av 2 forsøk. (C) H1299 celler ble transfektert med kontroll siRNA eller siRNA rettet mot Id1 eller ID3. Etter 48 timer ble prosentandelen av celler farging for etidiumbromid ble bestemt. Dataene er rapportert som gjennomsnittet av 4 uavhengige eksperimenter. (D-F) H1299 celler ble transfektert med kontroll siRNA og siRNA rettet mot Id1 eller ID3. Etter 7 dager ble cellene farget med trypanblått og antall levende og døde celler ble bestemt. Dataene representerer den prosentvise endring fra siRNA kontroll av (D) i live eller (F) døde celler. (E) representerer prosentandelen av celler som var døde. Dataene representerer gjennomsnittet av 4 uavhengige eksperimenter.
Cells overekspresjon ID3 er motstandsdyktig mot DMH2
For ytterligere å definere om Id1 og ID3 megle BMP signalering, ID1 og ID3 ekspresjonsvektorer var stabilt transfektert inn H1299 celler. Tvunget uttrykk for Id1 medført en økning i proteinuttrykk av Id1 men ikke ID3 (figur 8A). Tvunget uttrykk for ID3 medført en økning uttrykk for ID3 men ikke Id1 (figur 8B). Det var en liten økning i aktin uttrykk i H1299 /ID3 celler. Siden aktin kan bli opp regulert av ID3 overekspresjon, ble uttrykket av GAPDH undersøkt. Ved Western blot analyse viste at GAPDH uttrykket var den samme mellom vektoren kontrollceller og H1299 /ID3 celler. DMH2 forårsaket en tilsvarende reduksjon i cellevekst i H1299 /ID1 celler sammenlignet med de vektorkontrollcellene (figur 8C). DMH2 ikke føre til veksthemming (figur 8C) eller indusere celledød (figur 8D) av H1299 /ID3 celler. Disse dataene støtter videre at de biologiske effekter mediert av BMP-reseptorantagonister innebærer ID-proteiner.
H1299 celler ble stabilt transfektert med ID1 og ID3 ekspresjonsvektorer eller insertless vektor. (A-B) Western blot-analyse som viser økt ekspresjon av (A) Id1 eller (B) ID3 i den transfekterte cellelinjen. (C-D) H1299 /ID1 og H1299 /ID3-celler ble behandlet med 1 uM DMSO eller 1 uM DMH2 i 7 dager og prosent levende og døde celler bestemmes. (C) DMH2 forårsaket veksthemming av vektor kontroll og H1299 /ID1 celler, men ikke H1299 /ID3 celler. (D) DMH2 indusert celledød i vektorkontrollcellene (H /con), men ikke i H1299 /ID3 celler (H /ID3). Dataene representerer gjennomsnittet av minst 3 forsøk er rapportert som prosent av kontroll-behandlede celler. (E) DMH2 deceases cellevekst av udødeliggjorte normale humane bronkiale epitelceller (HBEC), men ikke humane endotelceller fra aorta (HAEC). Cellelinjer som vokser i SFM ble behandlet med 1 mikrometer DMSO eller 1fiM DMH2 for 7 dagers og celletelling utført. Dataene representerer gjennomsnittet av minst 3 forsøk er rapportert som prosent av kontroll-behandlede celler. (F) Western blot-analyse som viser økt ekspresjon av pSmad 1/5 og Id1 i HBEC forhold til HAEC. 1fiM av DMH2 i 48 timer redusert uttrykk for pSmad 1/5 og ID1 i HBEC men ikke HAEC.
DMH2 undertrykker vekst av Normal Bronkial Epitelceller men ikke endotelceller
BNIP2 signalkaskade er avgjørende for tidlig lunge utvikling med høy uttrykk i epitel og vaskulære forfedre [28]. Ved fullførelse av lunge morfogenese BMP signalerings avtar med knapt påvisbar ekspresjon i voksen normalt lungevev [9], [28], [29]. BMP-signalering er re-aktiveres i normale voksne bronkiale epitelceller ved inflammasjon og skade vev [28], [29]. For ytterligere å definere spesifisiteten av BMP-reseptorantagonister, undersøkte vi om normale menneskelige bronkiale epitelceller (HBEC) udødeliggjort uten virale oncoproteiner [30] og normale menneskelige aorta endotelceller (HAEC) er lydhør overfor DMH2. Som forventet DMH2 forårsaket en signifikant reduksjon i veksten av H1299-celler (57%) og en tilsvarende reduksjon i HBEC (42%) (figur 8E). DMH2 forårsaket bare en 15% reduksjon i cellevekst av HAEC (figur 8E). HBEC hadde et høyere nivå av ekspresjon av pSmad 1/5 og Id1 enn HAEC (figur 8F). DMH2 forårsaket en reduksjon i uttrykket av pSmad 1/5 og Id1 i HBEC men ikke i HAEC. BMP-antagonister også redusert Id1 uttrykk og indusert vekst hemming av den normale menneskelige bronkial epitelceller udødeliggjort med SV40 stort T-antigen gen (BEAS-2B celler) [31] (figur S4 og data ikke vist).
