Abstract
chemokin CXCL12 og reseptor CXCR4 har dukket opp som lovende terapeutiske mål for eggstokkreft, en sykdom som fortsetter å ha en sturen prognose. CXCL12-CXCR4 signale stasjoner spredning, overlevelse, og invasjonen av eggstokkreft celler, som fører til tumorvekst og metastasering. Pleiotrope effekter av CXCR4 i flere viktige skritt i eggstokkreft tyder på at blokkering denne veien vil forbedre resultatene for pasienter med denne sykdommen. For å kvantifisere CXCL12-CXCR4 signalering i cellebaserte analyser og levende musemodeller av eggstokkreft, har vi utviklet et klikk bille rød luciferase complementation reporter som oppdager aktivering av CXCR4 basert på rekruttering av cytosoliske adapter protein β-arrestin 2. Både i to- dimensjonale og tre-dimensjonale cellekulturer, etablerte vi at bioluminescence fra denne reporteren måler CXCL12 avhengig aktivering av CXCR4 og hemming av denne veien med AMD3100, en klinisk-godkjent lite molekyl som blokkerer CXCL12-CXCR4 bindende. Vi brukte denne bildesystem for å kvantifisere CXCL12-CXCR4 signalering i en musemodell for metastatisk kreft i eggstokkene, og viste at behandling med AMD3100 avbrutt denne veien
in vivo
. Kombinasjonsbehandling med AMD3100 og cisplatin betydelig redusert tumorbyrde i mus, selv om forskjellene i total overlevelse ikke var vesentlig større enn behandling med enten middel som monoterapi. Disse studiene etablere en molekylær avbildning reporter system for å analysere CXCL12-CXCR4 signalering i eggstokkreft, som kan brukes til å undersøke biologi og terapeutiske målretting av denne veien i cellebaserte analyser og levende mus
Citation. Salomonnson E , Stacer AC, Ehrlich A, Luker KE, Luker GD (2013) Imaging CXCL12-CXCR4 signale i Ovarian Cancer Therapy. PLoS ONE 8 (1): e51500. doi: 10,1371 /journal.pone.0051500
Redaktør: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 23 august 2012; Godkjent: 01.11.2012; Publisert: 23 januar 2013
Copyright: © 2013 Salomonnson et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forsknings var støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (NIH R01CA136553, R01CA136829 og P50CA093990) og Department of Defense (W81XWH-09-1-0128). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
chemokin CXCL12 (SDF-1) og dens reseptor CXCR4 er sterkt innblandet som viktige faktorer som bestemmer startfasen og intraperitoneal metastasering av eggstokkreft [1]. CXCL12 skilles ut av ≈70-90% av eggstokkreft celler, samt mesothelial celler i peritoneum hos mennesker og mus [2] [3] [4] [5]. Pasienter med de høyeste nivåene av CXCL12 uttrykk i eggstokkreft celler har en betydelig dårligere prognose, med vekt på biologisk betydningen av dette signalmolekyl i sykdomsprogresjon [6]. Effekter av CXCL12 på ovarial cancer ser ut til å være formidlet av CXCR4, en av to kjente reseptorer for dette kjemokin. Forsterkning av CXCR4 er en tidlig hendelse i ondartet transformasjon av eggstokkene epitelceller, som tyder på at CXCL12-CXCR4 er kritisk for patogenesen av denne sykdommen [7]. Omtrent 60% av pasienter med eggstokkreft har CXCR4 på ondartede celler, og disse pasientene har betydelig redusert total overlevelse [4]. CXCL12 signaliserer gjennom CXCR4 fremmer spredning, invasjon og metastasering av eggstokkreft celler, som alle bidrar til en mer aggressiv sykdom. Bivirkninger av CXCL12 på eggstokkreft kan også skyldes effekter på stromal rommet av svulsten mikromiljøet, inkludert forbedret angiogenese og rekruttering av immundempende celler [8] [9] [10] [11].
Central funksjoner av CXCL12-CXCR4 signalering i maligne celler og svulsten mikromiljøet posisjon dette signaliserer aksen som et hovedmål å bedre behandling for pasienter med eggstokkreft. I musemodeller, har vi og andre vist at blokkering CXCL12-CXCR4 signalering med RNA interferens mot CXCL12 eller et lite molekyl hemmer av CXCL12-CXCR4 binding (AMD3100) begrenser veksten av eggstokkreft celleimplantater [12], [13], [14 ]. Hemme CXCL12-CXCR4 signale strekker seg også overlevelsen av mus med kreft i eggstokkene. Men effekten av monoterapi terapi er beskjedne, noe som tyder på at målretting CXCL12-CXCR4 i kombinasjon med et annet middel kan være mer gunstig.
Etablering at et sammensatt treffer effektivt sin tiltenkte målet er avgjørende for legemiddelutvikling i pre-klinisk modeller og kliniske studier. Å analysere farmakodynamikk av midler rettet mot CXCL12-CXCR4 signalering i musemodeller av eggstokkreft, har vi utviklet et klikk bille luciferase complementation reporter til bilde og kvantifisere aktivering og hemming av denne veien
in vivo
. I dette systemet er CXCR4 og cytosoliske adapter protein β-arrestin to smeltet til inaktive amino (CBRN) og karboksy (CBC) terminale fragmenter av smellere rød luciferase. Reporteren måler CXCL12 aktivering av CXCR4 signale basert på rekruttering av cytosoliske adapter protein β-arrestin 2 til denne reseptoren. Rekruttering av β-arrestin 2 er en vanlig, tidlig begivenhet i aktivering av kjemokinreseptorer og den større familie av syv transmembran-reseptorer [15]. Med luciferase complementation system, til interaksjoner mellom CXCR4 og β-arrestin 2 Tilbered aktiv smellere luciferase produsere lys, som gir en avbildning metrisk for CXCR4 signalering i intakte celler, tredimensjonale sfæroide kulturer og leve mus. Spheroids er en viktig mellomting mellom standard to-dimensjonale cellekulturanalyser og tumorxenotransplantater siden svulst kuler reprodusere begrenset spredning av forbindelser i svulster og dannelse av eggstokkreft kuler i ascitesvæske fra pasienter. Siden luciferase complementation er reversibel, kan dette bilde reporter også brukes til å måle effekter av forbindelser som blokkerer CXCL12-CXCR4 signale
in vitro Hotell og
in vivo
.
Vi brukte denne bildebehandling reporter å analysere CXCL12-CXCR4 signalering i eggstokkreft og fastslå at AMD3100, et lite molekyl hemmer av CXCR4, blokker reseptor aktivering i svulsten mikromiljøet. Ved hjelp av denne imaging system, fant vi ut at kombinasjonsbehandling med AMD3100 og cisplatin betydelig redusert samlet tumorbyrde i en musemodell for menneskelig eggstokkreft med intraperitoneal metastaser. Disse resultatene etablere en ny molekylær avbildning metode for å analysere CXCL12-CXCR4 signalering i eggstokkreft og foreslå mulige terapeutiske nytten av å kombinere selektiv hemming av denne kjemokinreseptoren vei med standard cellegifter.
Materialer og metoder
Plasmider
for å generere fusjoner av CXCR4 med den N-terminale fragment av smellere rød luciferase (CBRN) (Promega), forsterket vi CXCR4 ved PCR og klonet produktet inn i Xhol og AgeI områder av EGFP-N1 (Clontech). Vi brukte PCR å forsterke DNA-sekvensen for aminosyrer 2-413 av smellere rød luciferase (CBRN) og klonet dette produktet i AgeI og Noti- områder av EGFP-N1 [16]. Dette kloning strategi fjerner EGFP fra vektoren. Vi forsterket sekvens for aminosyrene 395-542 av smellere luciferase (CBC) ved PCR og klonet produktet inn i AgeI og Notl områder av EGFP-N1 å lage en fusjon til den C-terminale ende av β-arrestin 2 (gave Robert Lefkowitz). Slik overfører du konstruerer fra EGFP-N1 ryggrad til lentiviral vektor FUW, brukte vi PCR å forsterke target DNA-sekvensen og legge Xbal nettsider for kloning. Konstruksjoner brukt for dette studiet er oppsummert i figur 1 (fig. 1A), og PCR-primere anvendt for kloning er oppført i tabell 1.
A) Panel viser lentivirale vektorer og stabilt transduserte celler som anvendes for bildediagnostikk. B) Skjematisk fremstilling av smellere rød komplemente system. N- og C-terminale fragmenter av smellere rød luciferase er fusjonert til C-termini av CXCR4 og β-arrestin 2, henholdsvis. CXCL12 binding til CXCR4 fører rekruttering av β-arrestin 2 til aktivert reseptor, rekonstituering smellere rød luciferase å produsere lys.
Cells
HeyA8 eggstokkreft celler (forut av Gordon Mills, MD Anderson Cancer Center) ble stabilt transduced med rekombinante lentiviruses for CXCR4-CBRN og Ar-CBC (HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC) [17]. Vi brukte lentiviral transduksjon å etablere populasjoner av HeyA8 celler som stabilt uttrykker CXCL12 smeltet til
Gaussia
luciferase (HeyA8-CXCL12-GL), unfused
Gaussia
luciferase (Hey-GL), og ildflue luciferase og grønt fluorescerende protein (GFP) (HeyA8-FL /GFP) [18], [19]. Vi har også omformet HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC og HeyA8-CXCL12-GL celler med fluorescerende protein eqFP650 [20]. Figur 1 viser en liste over stabilt transduserte celler brukt i denne studien (Fig. 1A). Alle celler ble opprettholdt i DMEM med 10% føtalt bovint serum, 1% glutamin og 0,1% penicillin /streptomycin.
Strømningscytometri
Intakte celler som ble farget med et antistoff til CXCR4 (klon 12G5 , R eller 2) HeyA8-FL /GFP-celler kombinert med et likt antall av begge HeyA8-CXCL12-GL eller HeyA8-GL-celler, henholdsvis, for undersøkelser av celle-levedyktighet i respons til cisplatin. For eksperimenter med AMD3100, økende konsentrasjoner av forbindelse ble tilsatt til sfæroidene en dag etter utsåing i hengende dråpe platene. Vi inkubert sfæroider med AMD3100 eller bærer for en eller to dager før kvantifisering bioluminescens. HeyA8-FL /GFP-celler i kuler med enten HeyA8-CXCL12-GL eller HeyA8-GL-celler ble behandlet i en eller to dager med økende konsentrasjoner av cisplatin. Vi kvantifisert fluorescens fra eqFP650 på en IVIS Spectrum før kvantifisering bioluminescence etter tilsetting 6 mikrogram /ml luciferin til hver spheroid. Vi normalisert bioluminesens foton flux til fluorescens utstråling å gjøre rede for forskjeller i celle tall.
Dyrestudier
Alle dyr prosedyrer ble godkjent av University of Michigan utvalget for bruk og stell av dyr. Dyrene ble byttet til klorofyll-fri chow (Forskning dietter) for alle studier for å redusere bakgrunns fluorescens i imaging studier. 2,5 × 10
5 celler hver av HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC og HeyA8-CXCL12-GL celler ble injisert intraperitonealt i 100 ul 0,9% NaCl i 5-7 uker gamle kvinnelige NOD /SCID
IL2rγ
– /- hunnmus (Taconic). For å hindre CXCL12 binding til CXCR4, vi brukte 5-dagers, 1,0 mL /time osmotiske pumper (for eksperimentet er vist på Fig. 5) eller 14 dager, 0,5 pl /time osmotiske pumper (for eksperimentet er vist på Fig. 6) (Alzet) lastet med 25 mg /ml AMD3100 eller 0,9% NaCl kjøretøy kontroll. Disse pumpene leverer 1,25 eller 0,625 ug AMD3100 /g /time for hver mus. Pumper ble implantert til tider angitt i teksten for hver figur. For behandlingsstudier er vist i figur 6, injiserte vi mus med 4 mg /kg cisplatin eller matchet kjøretøy i.p. hver 5. dag. Cisplatin eller PBS kjøretøy injeksjoner fortsatte gjennom de to-ukers periode som osmotiske infusjonspumper var på plass. Alle mus fikk virkestoff (AMD3100 og /eller cisplatin) eller matchet kjøretøy for begge rutene levering (osmotisk infusjonspumpe og intraperitoneal injeksjon). Som eksempler kjøretøy kontrollmusene mottok osmotiske pumper med 0,9% NaCl og i.p. injeksjoner av PBS, mens mus i AMD3100 behandlingsgruppen hadde osmotiske pumper med AMD3100 og i.p. PBS.
Mus bildebehandling
Bioluminesens bildebehandling ble utført på en IVIS Spectrum (Perkin Elmer). Fluorescens bildebehandling og bille luciferase bildebehandling med luciferin ble utført som beskrevet tidligere [23]. Imaging data ble kvantifisert som fluorescens utstråling eller foton flux, henholdsvis. Data for smellere rød luciferase complementation ble normalisert til total tumorbelastning vurderes av fluorescens fra eqFP650.
statistikker
Grafer og statistiske analyser ble utarbeidet med GraphPad Prism. Cellekulturstudier ble utført 3-5 ganger, mens dyrestudier ble utført to ganger. Data ble plottet som middelverdier med standardavvik av gjennomsnittet (SEM). Par av data ble analysert ved Mann-Whitney U-test for å bestemme statistisk signifikante forskjeller. Kaplan-Meier overlevelseskurver ble analysert ved Gehan-Breslow-Wilcoxon test.
Resultater
Klikk bille complementation reporter for samhandling av CXCR4 og β-arrestin 2
CXCL12 binding til reseptor CXCR4 resultater i rekruttering av cytosoliske adapter protein β-arrestin 2 til reseptor. Å image og kvantifisere dette viktig steg i signaltransduksjon, brukte vi en nylig beskrevet proteinfragment complementation analyse basert på smellere rød luciferase [16]. I dette system blir CXCR4 fusjonert til den N-terminale fragment av smellere luciferase (CXCR4-CBRN) og β-arrestin 2 til den C-terminale fragment av dette enzym (Ar-CBC) (Fig. 1B). Rekruttering av β-arrestin 2 til CXCR4 bringer også sammen luciferasepreparater fragmenter å produsere bioluminescence som et kvantitativt mål for dette proteinet samhandling i CXCR4 signalering.
Vi omformet HeyA8 ovarian kreft celler med lentiviral vektorer for CXCR4-CBRN og Ar- CBC. HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC-celler fosforylert AKT i respons til inkubasjon med CXCL12, bestemt ved Western blotting, som viser at disse cellene aktivert på kjent nedstrøms effektor av CXCL12-CXCR4 (fig. 2A). Sammenlignet med foreldre HeyA8 celler, HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC celler viste større aktivering av AKT svar på CXCL12, i samsvar med transducing ekstra funksjonell CXCR4 inn i bilde reporter celler. Vi demonstrerte også at HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC-celler viser tidsavhengig aktivering av kinaser ERK1 /2, som ble hemmet ved en konsentrasjon metnings (1 uM) av CXCR4 inhibitor AMD3100 (Fig. 2B). HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC celler overuttrykke β-arrestin 2-CBC forhold til endogent protein som bestemmes av Western blotting.
A) HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC og foreldre HeyA8 cellene behandlet med økende konsentrasjoner av CXCL12 i 10 minutter. Western blot av totale cellelysater viser fosforylert og total AKT, respektivt. Vi brukte GAPDH som en lasting kontroll. Grafen viser relative bandet intensiteter for fosforylert AKT i hver cellelinje normalisert til total AKT og GAPDH. B) HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC-celler ble behandlet med 100 ng /ml CXCL12-α for 0, 5, 15 eller 30 minutter i fravær eller nærvær av 1 uM AMD3100. Totale cellelysater ble analysert for fosforylert ERK1 og total /2, henholdsvis. Lysater ble også analysert ved hjelp av Western blot for ekspresjon av β-arrestin 2-CBC og endogen β-arrestin 1 og 2. GAPDH er vist som en lasting kontroll. C) Strømningscytometri av CXCR4 ekspresjon i forskjellige cellelinjer HeyA8 brukt i denne studien. Mørk linje og stiplede linjer i histogram tomter betegne isotypekontrollantistoff og farging med CXCR4 antistoff.
Vi brukte flowcytometri for å vurdere celleoverflaten uttrykk for CXCR4 på HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC celler, som samt foreldre HeyA8 celler og celler som stabilt transduced med
Gaussia
luciferase (HeyA8-GL), CXCL12 smeltet til Gaussia luciferase (HeyA8-CXCL12-GL), eller ildflue luciferase og GFP (HeyA8-FL-GFP). Alle celler uttrykte lignende nivåer av celleoverflate-CXCR4 (Fig. 2C). Selv om transdusert med CXCR4-CBRN, HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC-celler hadde nivåer av celleoverflate-CXCR4 som var sammenlignbare med foreldre HeyA8 celler, sannsynligvis på grunn overekspresjon av β-arrestin 2 forårsaker internalisering av denne reseptoren fra celleoverflaten. [24], [25].
CXCL12 stasjoner complementation mellom CXCR4 og β-arrestin 2
For å fastslå at bioluminescence fra HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC celler tiltak aktivering av CXCR4 signale , behandlet vi monolagskulturer av disse celler med økende konsentrasjoner av CXCL12 i 60 minutter. Vi behandlet parallelle kulturer av celler med en inhiberende konsentrasjon (1 uM) av CXCR4 inhibitor AMD3100 eller bærerkontroll under inkubasjonsperioden [26] [27]. Behandling med CXCL12 frembrakte en konsentrasjonsavhengig økning i bioluminescens fra foreningen av CXCR4-CBRN og Ar-CBC, nådde topp 3-gangers induksjon ved 1 ug /ml CXCL12 (fig. 3A). Til sammenligning, celler behandlet med AMD3100 viste bare basal bioluminescens med ingen respons på CXCL12.
A) HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC-celler ble sådd ut som to-dimensjonale kulturer i 96-brønners plater og inkubert med økende konsentrasjoner av CXCL12-α i nærvær av 1 uM AMD3100 eller bærerkontroll. Data ble fremstilt grafisk som middelverdier for luminescens forhold til cellene ikke behandlet med CXCL12 (n = 4 per tilstand). Feilfelt betegne SEM. B) HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC-celler ble behandlet med 100 ng /ml CXCL12 for å øke tidsperioder i nærvær av 1 uM AMD3100 eller bærerkontroll. Data ble fremstilt grafisk som middelverdier ± SEM for luminescens forhold til cellene ikke inkubert med CXCL12 (n = 4 per tilstand). *, P 0,05; **, P. 0,01
Vi har også inkubert HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC celler med 100 ng /ml CXCL12 og 1fiM AMD3100 eller kjøretøy kontroll for å øke perioder gjennom 4 timer før måling luciferase aktivitet. I forhold til ubehandlede celler, ble celler inkubert med 100 ng /ml CXCL12 og bærerkontrollen viste tidsavhengig økning av bioluminescens, med en topp ved omtrent 2 ganger induksjon i 2 timer og deretter synkende beskjedent (Fig. 3B). AMD3100 fullstendig blokkert effekten av CXCL12 på bioluminescence complementation mellom CXCR4-CBRN og Ar-CBC. Kollektivt, disse studiene viser at bioluminescence fra HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC celler reagerer på CXCL12 og fastslå at denne reporteren systemet kan kvantifisere hemming av CXCL12-CXCR4 signalering.
Narkotikavirkninger i spheroid kultur
Nyere studier tyder på at kuler og lignende tredimensjonal cellekultursystemer er mer fysiologiske modeller av narkotika målretting og effekt, på grunn av faktorer, inkludert direkte intercellulære interaksjoner og begrenset spredning av forbindelser [28], [29]. I tillegg eggstokkreft celler hos pasienter danne kuler i ascites, utgjør en potensiell barriere for levering av legemidler [30]. For å modellere svulsten mikromiljøet av eggstokkreft
in vivo
, brukte vi kuler av HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC celler kombinert med likt antall HeyA8-CXCL12-GL celler, reprodusere menneskelig eggstokkreft hvor svulsten cellene skiller CXCL12 og /eller uttrykke CXCR4. Mens sperre HeyA8 celler ikke uttrykker CXCL12, bestemt ved QRT-PCR (data ikke vist), HeyA8-CXCL12-GL-celler utskiller omtrent 12 ng /ml CXCL12 i en 24 timers periode, noe som er sammenlignbare med verdiene rapportert for andre eggstokkreft celler som utskiller denne kjemokin endogent [19] [31]. Vi behandlet kuler med økende konsentrasjoner av AMD3100 i 24 timer før kvantifisering bioluminesens. I forhold til kuler behandlet med kjøretøy kontroll, AMD3100 hemmet bioluminesens fra sammenslutning av CXCR4-CBRN og Ar-CBC. Luciferase aktivitet fra komplemente reporter redusert med ≈50% i kulene behandlet med 1 mikrometer AMD3100 (p 0,05) (figur 4A.). Vi observerte lignende resultater når vi utvidet inkubasjoner til to dager med AMD3100 (data ikke vist). Inhibering av CXCR4, som kvantifiseres ved komplementering assay, var mindre effektiv i sfæroidene sammenlignet med monolagskultur, noe som tyder på at tredimensjonal arkitektur grenser gjennomtrengning av AMD3100 til alle celler. Men ser vi at sfæroide kulturer teste effekten av kronisk eksponering for CXCL12 snarere enn akutt tillegg av chemokine som gjøres i to-dimensjonale kultur, noe som også kan bidra til forskjeller i effekt av AMD3100.
A) spheroid kulturer HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC og HeyA8-CXCL12-GL-celler ble behandlet i 24 timer med økende konsentrasjoner av AMD3100. Data ble fremstilt grafisk som middelverdier ± SEM for luminescens for smellere complementation forhold til kuler behandlet kun med kjøretøykontroll (n = 10 kuler per tilstand). B) HeyA8-FL-GFP-celler ble dyrket som sfæroider med HeyA8-CXCL12-GL eller HeyA8-GL-celler og deretter behandlet med økende konsentrasjoner av cisplatin i 24 timer. Data ble fremstilt grafisk som middelverdier ± SEM for ildflue luciferase luminescens i forhold til kuler ikke behandlet med cisplatin (n = 10 kuler per tilstand). *, P. 0,05
Vi testet beskyttende effekten av CXCL12 mot cytotoksisitet fra cisplatin, en standard kjemoterapeutisk stoff for eggstokkreft. For disse analyser har vi brukt HeyA8-FL-GFP-celler som uttrykker endogent CXCR4 (se fig. 2C). Ildflue luciferase-aktivitet er direkte proporsjonal med antall av tumorceller, noe som gir en lettvint assay for celle-levedyktighet i intakte kuler [32]. Vi genererte sfæroider som kombinerer HeyA8-FL-GFP-celler med HeyA8-CXCL12-GL eller HeyA8-GL-celler, henholdsvis, og deretter behandlet kuler med økende konsentrasjoner av cisplatin i 24 timer. I kuler som inneholder HeyA8-CXCL12-GL-celler, ble HeyA8-FL-GFP celler beskyttet beskjedent mot cytotoksiske effekten av cisplatin, selv om bare 10 mikrometer vi oppdage signifikante forskjeller i cytotoksisitet i forhold til kuler som inneholder HeyA8-GL celler (p 0,05) (fig. 4B). Omfanget av cytotoksisitet sammenlignbar følgende medikamentelle behandlinger i 48 timer (data ikke vist). Disse studiene viser at CXCL12 overfører meget beskjeden beskyttelse mot cisplatin i kuler som består utelukkende av eggstokkreft celler.
In vivo
avbildning av CXCR4 og β-arrestin to komplemente i eggstokkreft
Vi brukte en human tumor xenograft modell av metastatisk intraperitoneal eggstokkreft å bestemme i hvilken grad komplemente mellom CXCR4 og β-arrestin to oppdager CXCR4 aktivering og hemming
in vivo
. Vi co-injisert like mange HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC og HeyA8-CXCL12-GL celler intraperitonealt i mus og brukes bioluminesens bilde å kvantifisere rekruttering av β-arrestin 2 til CXCR4. Under baseline forhold, vi lett observeres bioluminescence fra complementation mellom HeyA8-CXCR4-CBRN og Ar-CBC (Fig. 5A), noe som indikerer aktiv CXCR4 signalering i ondartede celler. Vi deretter tilfeldig delt mus i grupper behandlet for fem dager med enten AMD3100 eller kjøretøy kontroll levert fra osmotiske infusjonspumper. Det var ingen fenotypiske tegn på toksisitet i mus behandlet med AMD3100. Mus behandlet med AMD3100 hatt relativt mindre vekst av eggstokkreft celler enn dyrene som fikk bare kjøretøy kontroll som kvantifisert ved fluorescens fra langt rød fluorescerende protein eqFP650 uttrykt i ondartede celler (figur 5B.) (P 0,05). Ved hjelp av fluorescens fra eqFP650 å normalisere for forskjeller i totalantall eggstokkreft celler, bioluminesens fra samspillet av CXCR4-CBRN med Ar-CBC var signifikant lavere hos mus som fikk AMD3100 i fem dager sammenlignet med kjøretøykontroll. Til sammen viser disse data nytten av dette avbildningssystem for å måle farmakologisk målretting av CXCL12-CXCR4 signalering og resulterende virkninger av tumorvekst
in vivo plakater (figur 5C). (P 0,05).
A) Representative bilder av mus med intraperitoneale implantater av HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC og HeyA8-CXCL12-GL celler. Bilder ble tatt før og etter 5 dager med behandling med osmotiske pumper som inneholder AMD3100 eller kjøretøy kontroll. Scale bar viser områder av foton flux verdiene som vises på pseudocolor bilder. B) Fluorescens fra eggstokkreft celler ble målt i levende mus behandlet med AMD3100 eller kjøretøy kontroll. Diagrammet viser gjennomsnittsverdier + SEM for fluorescens i forhold til verdier målt på dag 0 før behandlingsstart. Pilene viser den perioden da osmotiske pumper var på plass. C) kvantifiserte foton flux data for smellere rød komplemente i mus behandlet med AMD3100 eller kjøretøy kontroll, henholdsvis. Data ble normalisert til tumor fluorescens for hver mus og tegnes som middelverdier ± SEM (n = 7 mus per gruppe). *, P. 0,05
Kombinasjonsbehandling med AMD3100 og cisplatin reduserer tumorbelastning
Vi har tidligere vist at monoterapi behandling med AMD3100 alene beskjedent forbedrer overlevelsen av mus med intraperitoneal disseminert eggstokkreft [14]. Vi antok at kombinert behandling med AMD3100 og et standard kjemoterapeutisk medikament vil i betydelig grad forbedre tumorkontroll og overlevelse, basert på studier i leukemi viser at CXCL12 i tumoren mikromiljøet gir resistens mot standard cytotoksiske medikamenter [33]. For å teste denne hypotesen, implantert vi mus med HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC og HeyA8-CXCL12-GL celler. En uke etter implantasjon svulster vi randomisert mus til fire behandlingsgrupper: 1) kontroll kjøretøy; 2) AMD3100 levert av to-ukers osmotisk infusjonspumper; 3) cisplatin administrert som 4 mg /kg i.p. hver 5. dag; og 4) kombinert AMD3100 og cisplatin. Vi fortsatte cisplatin injeksjoner gjennom to-ukers levering periode AMD3100 pumper og deretter avviklet all behandling.
Vi brukte bioluminescence fra HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC å analysere CXCR4 signale
in vivo
og fluorescens bildebehandling for eqFP650 å kvantifisere tumorbelastning over tid. Vi beregnet areal under kurven for Bioluminescens og fluorescens og brukt forhold mellom disse parameterne for å vurdere inhibisjon av CXCR4 over tid (fig. 6A). Mus behandlet med AMD3100 eller kombinasjonen av AMD3100 og cisplatin hadde signifikant lavere bioluminescence fra CXCR4-CBRN og Ar-CBC complementation forhold til generelle tumorbyrde, som viser at dette stoffet vellykket blokker CXCR4 signalering i eggstokkreft celler
in vivo
(p 0,01)
A) Areal under kurven analyse av bildedata for prosenter av smellere rød luciferase complementation for CXCR4 og β-arrestin 2 normalisert til eqFP650 fluorescens (tumorbelastning) i mus implantert med HeyA8. -CXCR4-CBRN /Ar-CBC og HeyA8-CXCL12-GL celler. Data er vist for grupper behandlet med kjøretøy kontroll, AMD3100, cisplatin, eller begge AMD3100 og cisplatin i to uker begynner en uke etter implantering celler. Diagrammet viser gjennomsnittsverdier ± SEM (n = 7 mus per gruppe). *, P 0,05. B) Areal under kurven analyse av fluorescens fra eqFP650 produsert av implanterte eggstokkreft celler i løpet av forsøket. Grafen viser middelverdier + SEM. *, P 0,05, **, p 0,01. C) Kaplan-Meier kurver for overlevelse av mus behandlet med kjøretøyet, AMD3100, cisplatin, eller AMD3100 og cisplatin. Alle behandlingsgrupper avvike fra kjøretøykontroll (p 0,05)., Men ikke fra hverandre
Mus behandlet med monoterapi AMD3100 eller cisplatin hadde beskjeden, men signifikant, reduksjon i tumorbelastning målt ved fluorescens bildebehandling løpet i løpet av forsøket (p 0,05) (figur 6B.). Til sammenligning kombinasjonsbehandling med både AMD3100 og cisplatin betydelig redusert totale antallet HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC celler i forhold til kjøretøykontroll eller enten stoffet alene (p 0,01 og p 0,05, henholdsvis). Disse forskjellene var tydelig selv om mus fikk bare to ukers behandling med disse legemidlene. Mus implantert med HeyA8 eggstokkreft kreftceller utviklet ascites, men det var ingen forskjell i total kroppsvekt mellom ulike behandlingsgruppene (data ikke vist). Det var en trend mot forbedret overlevelsen hos mus behandlet med både AMD3100 og cisplatin (Fig. 6C). Men forskjellene mellom AMD3100, cisplatin, og kombinert AMD3100 og cisplatin var ikke signifikant, selv om alle behandlinger forbedret overlevelse i forhold til kjøretøykontroll (p 0,05).
Diskusjoner
Eggstokkreft er fortsatt den ledende dødsårsak fra gynekologiske kreftformer med en samlet fem års overlevelse av ≈50%. Dårlig prognose av eggstokkreft skyldes delvis det faktum at de fleste pasienter til stede med fremskreden sykdom assosiert med intraperitoneal, lever, eller systemiske metastaser [34]. Eggstokkreft utgangspunktet er følsomme for kjemoterapi med platinabaserte legemidler, selv om de fleste pasientene tilbakefall med resistente kreftceller innen omtrent ett år.
