Abstract
Bakgrunn
Fas signal-aktivert signal sensorer og aktivatorer av transkripsjon 3 (STAT3) er nødvendig for Fascin oppregulering. Som en aktin-bunting protein, kan Fascin megle magekreft (GC) celle migrasjon.
Metoder
Gastric kreft AGS celler ble behandlet med anti-Fas (5 mikrogram /ml) i 2 timer , for å stimulere aktiveringen av Fas-signaliseringen.
in vitro
migrering av Fas signal-aktivert AGS celler ble vurdert ved hjelp av Transwell kamre. Nivåene av Fascin og fosforylert STAT3 ble oppdaget av Western blotting analyser. Nakne mus ble injisert intravenøst med AGS celler behandlet med anti-Fas eller behandlet med STAT3 inhibitor uten anti-Fas; tumorlungemetastaser ble målt. Fascin protein uttrykk i tumorvev ble oppdaget av immunhistokjemi. FAS og Fascin mRNA nivåer i tumorvev fra pasienter med GC ble målt ved real-time PCR og deres korrelasjon ble analysert.
Resultater
Aktivering av Fas signale fremmet celle migrasjon og resulterte i STAT3 avhengig Fascin oppregulering i AGS celler. Stat3 forbedret Fascin nivåer
in vivo
. Fascin var mellommann for Fas signale-indusert AGS celle migrasjon
in vitro Hotell og
in vivo
. Videre var det en positiv korrelasjon mellom Fas og Fascin mRNA nivåer i tumorvev fra GC pasienter.
Konklusjoner
Fas signale fremmer GC metastase gjennom STAT3 /Fascin veien, noe som kan gi en ny målet for GC terapi
Citation. Yang Y, Zhao Q, Cai Z, Cheng G, Chen M, Wang J et al. (2015) Fas Signa Fremmer Gastric Cancer Metastase gjennom STAT3-Dependent oppregulering av Fascin. PLoS ONE 10 (5): e0125132. doi: 10,1371 /journal.pone.0125132
Academic Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES
mottatt: 06.01.2015; Godkjent: 11 mars 2015; Publisert: 18. mai 2015
Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National Kina No. 81200014 til JLW (https://www.nsfc.gov.cn/); Foundation Natural Science i Zhejiang-provinsen No. LY14H160011 til YSY; Nei LY12C08002 til ZJC og nr LY12H13003 til MC (https://www.zjnsf.gov.cn/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er den fjerde vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreftrelaterte dødsfall på verdensbasis. Som de fleste kreftformer, er metastase den ledende årsak til svikt i klinisk behandling av GC. Diagnostisert på et tidlig stadium uten metastaser, kan GC bli utryddet ved kirurgi. Når metastase inntreffer, er prognosen for GC betydelig verre. Hos pasienter med omfattende metastase, resultatet av kirurgi i kombinasjon med kjemoterapi og immunterapi er langt fra optimale, med en samlet 5 års overlevelse være bare 24% [1,2]. Det er derfor et presserende behov for en bedre forståelse av mekanismen for GC metastaser for å utvikle en bedre terapeutisk strategi.
Fas-signalveien er en av de klassiske mekanismer for å indusere apoptose [3]. Etter ligering med sin naturlige ligand, Fasl, danner Fas-reseptoren dødsinduserende aliserte kompleks, forårsaker aktivering av kaspase-8, som i sin tur aktiverer nedstrøms caspaser, noe som resulterer i apoptose [4]. Det har blitt rapportert at Fas-mediert celledreping er ansvarlig for den anti-kreft funksjon av Fas-signalveien i prostatakreft [5]. Men i de fleste tumorer, i stedet for å indusere apoptose, fremmer Fas aliserte aktiveringen av tumorprogresjon [6,7]. Tumorceller ofte svare på Fas stimulering med forbedret spredning [8,9]. Flere studier har også vist at Fas signale kan fremme svulst celle migrasjon og invasjon [10-12]. I en fersk undersøkelse, har høy Fas uttrykk i GC-celler er vist å korrelere med forekomst av metastaser til regionale lymfeknuter [13], noe som tyder på at Fas signale fremmer metastasering av magekreft.
Fascin, en aktin -bundling protein, er blitt identifisert som et viktig molekyl i tumormetastase [14]. Fascin spiller en viktig rolle i tumorcellemigrering og ekspresjonen av Fascin økes i flere typer kreft, inkludert GC [15,16]. Fascin er en direkte STAT3 målgen i respons til IL-6 i både mus og humane brystcancerceller [17]. Fas signalering har blitt rapportert å være involvert i aktivering av STAT3 [18-20]. Derfor spekulerer vi at Fas signale fremmer GC celle migrasjon og påfølgende metastase gjennom STAT3 avhengige oppregulering av Fascin.
Denne studien var designet for å demonstrere involvering av Fas i reguleringen av Fascin uttrykk gjennom STAT3 aktivering i AGS celler. Vi forsøkte å knytte den forbedrede Fascin nivå med cellemotilitet og metastasering av AGS celler
in vivo
. Vi analyserte også sammenhengen mellom Fas og Fascin mRNA nivåer i tumorvev fra pasienter med GC. Det ble håpet at våre funn vil avsløre en ny mekanisme for GC metastasering, og gir et grunnlag for fremtidig utvikling av Fas-basert terapeutisk strategi for avansert GC.
Materialer og metoder
Menneskelig vevsprøver
Menneskelig GC vevsprøver ble samlet inn fra 23 pasienter (14 med metastaser og 9 uten metastaser) som gjennomgår kirurgi før kjemoterapi i Zhejiang Cancer Hospital (Hangzhou, Kina) mellom 2012 og 2014. Kliniske kjennetegn ved pasientene med GC er oppsummert i tabell 1. studien holdt reglene i Helsedepartementet av Kina og Verdens helseorganisasjon forskningsetikk omtale Komiteens internasjonale retningslinjer for forskning som omfatter mennesker og Helsinkideklarasjonen om etiske prinsipper for medisinsk forskning som omfatter mennesker. Studien Protokollen ble gjennomgått og godkjent av Institutional Review Board of Zhejiang Cancer Hospital. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver av pasientene tidligere for å studere oppstart.
Reagenser
Mus anti-human Fas (2R2) monoklonalt antistoff ble kjøpt fra eBioscience (San Diego, CA , USA). Mus anti-humant Fas-(CH11) monoklonalt antistoff og STAT3 inhibitor S3I-201 ble kjøpt fra Merck Millipore (Billerica, MA, USA). Kanin-anti-human STAT3 (79D7) og anti-human fosforylerte STAT3 (D3A7) monoklonale antistoffer ble innkjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Til mus anti-human Fascin (D-10) monoklonalt antistoff, human Fascin siRNA, STAT3 siRNA, negativ kontroll siRNA (NC siRNA), og STAT3 inhibitor, Stattic, ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Den CCK8 celleproliferasjon kit ble kjøpt fra Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan). Den annexin V-FITC apoptose deteksjon kit ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). De Transwell kamre (8-mikrometer porestørrelse) ble kjøpt fra Costar (Cambridge, MA, USA).
Dyr
Seks uker gamle atymiske nakne mus ble oppnådd fra SIPPR-BK Experimental Animal Co (Shanghai, Kina). Musene ble huset i en patogen-fri anlegg. De eksperimentelle protokollene ble gjennomgått og godkjent av Animal Care og bruk komité Zhejiang Cancer Hospital.
Celler og cellekultur
Den menneskelige GC cellelinjer AGS og MNK-45 ble hentet fra den amerikanske Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og opprettholdt i 1640 dyrkningsmedium inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C med 5% CO
2.
Western blot-analyse
totalt 20 pg rå proteiner ekstrahert fra cellelysatene ble separert ved 10% natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel-elektroforese og overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, Billerica, Massachusetts). Membranene ble blokkert med 5% BSA i Tris-bufret saltvann plus 0,05% Tween-20 og deretter inkubert med primære antistoffer tilsvarende ved 4 ° C over natten. Etter vasking med Tris-bufret saltvann plus 0,05% Tween-20, ble membranene inkubert med tilsvarende HRP-konjugerte sekundære antistoffer. Proteinene ble visualisert ved hjelp SuperSignal West Femto Maximum (Thermo, IL, USA).
Påvisning av celle apoptose
AGS celler (2 × 10
5 /ml) ble behandlet med en eller 5 ug /ml anti-Fas monoklonalt antistoff (anti-Fas) eller isotype antistoff (ISO) i 24 timer, ble de apoptotiske celler farget med Annexin V-FITC og propidiumjodid i 5 min ved 4 ° C i mørket og deretter analysert ved flowcytometri med en FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).
Kreft celle migrasjon analysen
in vitro
AGS celler (1 x 10
6 /ml) ble behandlet med 5 pg /ml av anti-Fas eller ISO i 2 timer ved 37 ° C. Deretter 2 x 10
5 AGS-tumorceller ble overført inn i 100 ul serumfritt medium og utsådd på toppen av kammeret Transwell kamre (8-um porestørrelse). Den nederste kammeret ble fylt med 800 ul av 1640 dyrkingsmedium inneholdende 20% FBS. Etter en 48-timers inkubasjon ved 37 ° C ble cellene fiksert med metanol i 20 minutter, og vasket med PBS tre ganger, 20 minutter hver. De fikserte celler ble farget med 10 mg /ml av DAPI i 30 min og vasket med PBS. De fargede celler ble undersøkt under et florescence mikroskop. For å bestemme effektene av STAT3 på cellemigrering ble 10 uM av Stattic tilsatt til kulturmediet. For å finne ut hvilken rolle Fascin i celle migrasjon, før anti-Fas stimulering, ble totalt 40 nM Fascin siRNA tomannsboliger transfektert inn i AGS celler (2 × 10
5 /brønn) med 3 mL INTERFERin siRNA transfeksjon reagens ( Polyplus, NY, CA, USA) på en 24-brønners plate. Effektiviteten av Fascin forbigående lyddemping ble bekreftet ved Western blotting.
celleproliferasjonsanalyse
AGS-celler ble behandlet med 5 pg /ml anti-Fas eller ISO for 24, 48 eller 72 timer, og 20 ul av CCK8 ble tilsatt til hver brønn og cellene ble inkubert i ytterligere 4 timer. Absorbansen for hver brønn ble avlest ved 450 nm. Celleproliferasjon ble beregnet ved å dividere OD av behandlede celler med OD av kontrollcellene.
real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert med TRIzol reagens og cDNA ble syntetisert ved anvendelse av en PrimeScript RT reagenssett (Takara Bio, Inc. Otsu, Shiga, Japan). De følgende PCR-betingelsene ble anvendt: en syklus ved 95 ° C i 30 s og deretter 40 sykluser med 5 s ved 95 ° C og 34 s ved 60 ° C. Real-time PCR ble utført på en Applied Biosystems 7500 real-time PCR system (Foster City, CA, USA). Resultatene ble normalisert mot β-aktin RNA. Sekvensene til PCR-primerne som ble brukt var som følger: forstand, 5′-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3 «og anti-sense, 5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′ for β-aktin; forstand, 5»-GTGAGGGAAGCGGTTTACGA-3 «og anti-sense, 5’AGATGCCCAGCATGGTTGTT-3′ for Fas; forstand, 5»-TGTCTGCCAATCAGGACGAG-3 «og anti-sense, 5′-CACGCCACTCGATGTCAAAG-3» for Fascin.
Lung metastaseanalyse
in vivo
AGS celler ( 5 x 10
6 per mus) forbehandlet med anti-Fas eller ISO i 2 timer ble injisert i 6-ukers-gamle nakne mus via en halevene. For å fastslå effekten av STAT3 på tumormetastase og Fascin uttrykk
in vivo
, AGS tumorceller (5 × 10
6 per mus) ble injisert intravenøst inn i 6-ukers gamle nakne mus og 24 timer senere , mottok musene intravenøs injeksjon av S3I-201 (5 mg /kg, hver 2 dager for totalt 3 ganger). Tre uker etter at celleinjeksjon ble musene bedøvet ved inhalering kloralhydrat og ofret, og lungene ble fjernet og antall lunge svulst foci ble telt under et dissekere mikroskop.
Immunohistochemistry
tumor foci fra lungene ble fiksert i 10% formalin, dehydrert i etanol, og innstøpt i parafin. Vevssnitt ble kuttet på 4 um, som er montert på objektglass og tørket ved 60 ° C i 4 timer. Etter kort proteolytisk fordøyelse og en peroksydase blokk av vev lysbilder ved hjelp av 2,5% hydrogenperoksyd i metanol i 30 minutter ved romtemperatur, ble platene inkubert med anti-Fascin-antistoff over natten ved 4 ° C. Etter vasking ble platene inkubert med peroksidase-merket polymer og substrat kromogen. Til slutt ble prøvene inkubert i fosfatbufret saltvann inneholdende diaminobenzidin i 5 min. En Olympus mikroskop ble ansatt for å visualisere farging av tumorvev.
Statistisk analyse
Resultatene ble sammenliknet med enveis ANOVA. Den Spearman rang for korrelasjon test ble anvendt for å undersøke korrelasjonen mellom nivåer av Fas og Fascin mRNA i tumorvev fra GC-pasienter. En p-verdi på 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
Aktivering av Fas signale fremmer migrasjon av AGS celler
Først fikk vi bekreftet uttrykk for. Fas reseptor i AGS og MNK-45 celler ved real-time PCR og Western blotting analyser og funnet MNK-45 cellene uttrykte høyere Fas reseptoren enn AGS celler gjorde (fig 1A). Begge cellelinjene viste også et høyt nivå av ekspresjon Fasl (data ikke vist). Vi neste undersøkt om ligering av Fas reseptor kan indusere apoptose i AGS og MNK-45 celler. Etter stimulering med anti-Fas eller ISO ved en konsentrasjon på 1 ug /ml eller 5 pg /ml, var det MNK-45, men ikke AGS-celler viste konsentrasjonsavhengig økning av apoptose (figur 1B). Derfor, undersøkte vi hvorvidt aktivering av Fas-signalisering kan føre til at andre virkninger på AGS celler i stedet for apoptose-induksjon i de følgende forsøk. Den AGS celle migrasjon Analysen ble utført
in vitro
og vi fant migrasjon av AGS celler ble betydelig økt etter stimulering med 5 ng /ml anti-Fas (fig 1C). For å utelukke muligheten for at økt migrasjon av AGS-celler ble forårsaket av deres forhøyet proliferasjon etter at anti-Fas-stimulering, undersøkte vi spredning av ACS-celler og fant ingen tydelig forskjell mellom celler behandlet med eller uten anti-Fas (Fig 1 D), noe som tyder på at økningen i cellemigrering var ikke et resultat av de proliferative egenskaper etter anti-Fas stimulering. Samlet utgjør disse resultatene indikerer at Fas signalering kan øke bevegelighet av GC-celler
in vitro
.
(A) Fas uttrykk i AGS og MNK-45 celler ble oppdaget av sanntid PCR (øverst) og Western blot (ned). (B) Følsomhet av AGS og MNK-45-celler til Fas-indusert apoptose ble målt ved farging med Annexin V og PI etter at begge celler ble stimulert med anti-Fas eller ISO ved de angitte konsentrasjoner i 24 timer (til venstre) og apoptotiske celler ble statistisk analysert (til høyre) (n = 3). (C) Etter stimulert med 5 ug /ml anti-Fas eller ISO i 2 timer, ble AGS cellene oppsamlet og utsådd i toppkammeret. Førti-åtte timer senere ble antallet celler på bunnen av Transwell filter avbildes (til venstre) og kvantifisert (høyre) (n = 5). Forstørrelse: 200 ×. (D) Spredning av AGS-celler ble målt ved hjelp av CCK8 assay etter stimulering med 5 ug /ml anti-Fas eller ISO i den angitte endepunktet. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (* P 0,05, *** p 0,001)
Aktivering av Fas signale oppregulert Fascin uttrykk i AGS cellene gjennom aktivering av STAT3
Det har blitt rapportert at Fas signalering er involvert i aktivering av STAT3 [18-20]. I denne studien undersøkte vi om aktivering av Fas signale ville føre STAT3 aktivering i AGS celler. Som vist i figur 2A, etter stimulering med anti-Fas for en kort periode, det fosforylerte STAT3 var signifikant økt i AGS-celler. Det har også blitt dokumentert at Fascin kan øke bevegelighet av tumorceller, og er et direkte mål gen av STAT3 [17]. Derfor vi har oppdaget uttrykk for Fascin i AGS celler etter stimulering med anti-Fas. Som vist i figur 2B, ble mRNA-nivåene av Fascin økt i en tidsavhengig måte og kulminerte etter 12 timer med anti-Fas-stimulering i AGS-celler. For ytterligere å bekrefte oppregulering av Fascin, vi har oppdaget at proteinnivået av Fascin og funnet økende Fascin protein nivåer i anti-Fas men ikke ISO behandlet AGS celler (figur 2C). For å vise forholdet mellom STAT3 og Fascin i AGS celler etter Fas signaleringsaktivering, behandlet vi AGS celler med Stattic, en spesifikk inhibitor av STAT3, før anti-Fas-stimulering og funnet at anti-Fas-indusert økning i Fascin protein ble fullstendig opphevet i nærvær av Stattic (figur 2D). Vi kunne også påvise aktivering av STAT3 i AGS celler etter anti-Fas-stimulering i 24 timer, men den aktiverte utstrekning var litt lavere enn det mottatte 2t av anti-Fas-stimulering (figur 2C og 2D). For ytterligere å bekrefte at STAT3 var involvert i reguleringen av Fascin uttrykk etter anti-Fas stimulering, vi banket ned STAT3 uttrykk ved å bruke STAT3 bestemt siRNA før anti-Fas stimulering og oppdaget STAT3-knockdown effekt ved Western blotting analyser. Som vist i figur 2E, STAT3 siRNA men ikke NC siRNA transfeksjon markert hemmet STAT3 ekspresjon i AGS-celler. Expectedly, den Fascin protein ble ikke indusert i Stat3-knockdown AGS celler etter anti-Fascin stimulering (Fig 2F). Disse resultatene foreslår at aktivert STAT3 er nødvendig for oppregulering av ekspresjonen Fascin forårsaket av Fas aliserte aktivering i AGS-celler.
AGS-celler ble stimulert med 5 ug /ml anti-Fas i de angitte tider. (A) Det fosforylerte STAT3 ble påvist ved Western blot. (B) Ekspresjon av Fascin mRNA ble analysert ved sanntids-PCR. (C) Etter stimulering med 5 ug /ml anti-Fas i 24 timer, proteinnivået av fosforylert STAT3 og Fascin i AGS-celler ble påvist ved Western blot. (D) De AGS-celler ble forbehandlet med 10 uM av Stattic i 2 timer og etterfølges av 5 ug /ml anti-Fas-stimulering i 24 timer; proteinnivået av fosforylert STAT3 og Fascin ble påvist ved Western blot. Etter transfeksjon med STAT3 siRNA eller NC siRNA i 36 timer, (E) STAT3 ekspresjon i AGS-celler ble påvist ved Western blot; (F) den AGS-celler ble deretter stimulert med 5 ug /ml anti-Fas i 2 timer, og den Fascin ekspresjon i cellene ble påvist ved Western blot. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Fas signale-forfremmet celle migrasjon avhenger STAT3 /Fascin sti
Det er vist at Fascin formidler svulst celle migrasjon [17]. I denne studien undersøkte vi om knockdown av Fascin ville hemme Fas signaliserer-indusert cellemigrasjon
in vitro
. Vi har funnet at en reduksjon i Fascin protein kunne påvises i AGS-celler transfektert med Fascin siRNA men ikke NC siRNA (figur 3A). Deretter utførte vi svulst celle migrasjon metoder for å detektere bevegeligheten av Fascin-knockdown AGS celler etter anti-Fas stimulering. Som vist i figur 3B, når anti-Fas-stimulering markant fremmet migrering av AGS-celler, denne effekten var åpenbart hemmet i celler behandlet med Fascin siRNA, men ikke NC siRNA. Siden STAT3 er nødvendig for Fas-signale-indusert Fascin ekspresjon i AGS-celler, vi neste analysert virkningene av STAT3 på Fas-mediert signalisering celle migrasjon i AGS-celler. Som vist i figur 3C, etter behandling med Stattic, Fas-signalisering forbedret cellemigrasjon var fullstendig avskaffet. I samsvar med dette resultatet, STAT3 siRNA også betydelig hemmet Fas signale forbedret AGS celle migrasjon (Fig 3D). Disse resultatene indikerer at Fas-signalisering fremmes cellemigrering og det avhenger av aktivering av STAT3 /Fascin svei.
(A) AGS-celler ble transfektert med Fascin siRNA eller NC siRNA i 36 timer, og Fascin ekspresjon i cellene ble oppdaget av Western blot. Etter (B) hemming av Fascin uttrykk av siRNA; eller (C) som ble behandlet med 10 uM Stattic i 2 timer; eller (D) hemming av STAT3 ekspresjon av siRNA, og stimulert med 5 ug /ml anti-Fas i 2 timer, ble antallet av AGS celler som migrerte til bunnen av Transwell filter kvantifisert (n = 5). Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (** P 0,01)
Fas signale fremmer celle metastaser in vivo gjennom aktivering STAT3 /Fascin sti
For ytterligere å demonstrere forholdet mellom Fas signalering og GC metastaser, overføres vi anti-Fas-stimulerte AGS-celler intravenøst inn i nakne mus og detektert tumoren foki i lungene. Vi har funnet en økning i tumor foki i lungene til mus som overføres med celler forhåndsbehandlet med anti-Fas men ikke ISO (figur 4A). For å klargjøre forholdet mellom Fascin og Fas signale-mediert tumormetastase, utførte vi immunhistokjemi påvisning av Fascin i tumorvev. Vi har observert en høyere Fascin ekspresjon i tumorvev fra mus som fikk anti-Fas-stimulerte AGS celler enn det fra mus som mottok ISO eller ikke-stimulerte celler (AGS Fig 4B). Siden STAT3 er nødvendig for den anti-Fas-indusert oppregulering av Fascin og økt bevegelighet i AGS-celler, undersøkte vi effekten av STAT3 på AGS cellemetastase
in vivo
. Etter behandling med S3I-201, en kjemisk sonde inhibitor av STAT3 aktivitet [21], svulsten foki i lungene betydelig redusert (figur 4C). I tillegg ble Fascin ekspresjon i tumorvev fra S3I-201 behandlede mus også inhibert (figur 4D), noe som tyder kontroll av Fascin ved STAT3
in vivo
. Samlet utgjør disse resultatene indikerer at Fas signale kan fremme celle metastaser
in vivo
, avhengig av aktivering av STAT3 /Fascin sti.
2 × 10
6 AGS tumorceller pre- stimulert med anti-Fas eller ISO i 2 timer ble injisert intravenøst nakne mus. (A) Antall lungetumor foci ble tellet (n = 5). (B) Ekspresjon av Fascin i tumorvev fra lunge ble detektert ved immunohistokjemi. 2 x 10
6 AGS-tumorceller ble injisert intravenøst inn i nakne mus, og 24 timer senere fikk musene intravenøs injeksjon av S3I-201 ved 5 mg /kg hver 2 dager for totalt 3 ganger. (C) Antall lungetumor foci ble tellet (n = 5). (D) Uttrykket av Fascin i tumorvev fra lungene ble oppdaget av immunhistokjemi (forstørrelse: × 100). Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter. (* P 0,05, *** p 0,001)
Fascin uttrykk er korrelert med Fas uttrykk i tumorvev fra pasienter med GC
Siden Fas signale fremmer Fascin uttrykk, vi fastslått om det var en sammenheng mellom Fas og Fascin uttrykk i tumorvev fra GC pasienter. Vi analyserte mRNA-nivåene av Fas og Fascin i tumorvev fra GC-pasienter. Som vist i figur 5, er mRNA-nivåene av Fas og Fascin viste en positiv korrelasjon. Dette resultatet gir bevis for forestillingen om at Fas signale fremmer Fascin uttrykk i GC.
Fas og Fascin mRNA uttrykk ble målt ved real-time PCR og normalisert til p-aktin mRNA (n = 23). Positiv korrelasjon ble oppnådd ved Spearman korrelasjonsanalyse.
Diskusjoner
Vanligvis følger trimerisering av Fas etter ligation med Fasl, apoptose er initiert. Fas klynge rekrutterer FADD adapter protein og danner dødsinduserende signal kompleks, forårsaker aktivering av caspase-8. Caspase-8, i sin tur, aktiverer nedstrøms kaspasene, slik som caspase-3, som kulminerte i apoptose [4]. I tillegg til å indusere celledød, Fas overfører også spredning og aktiveringssignaler i tumorceller [22]. Det har blitt rapportert at Fas mediere astric mucosal celleproliferasjon er ERK-avhengig [23], men aktivering av ERK signalveien ikke kan indusere proliferasjon av B16 musemelanomceller [24]. Derfor kan Fas indusere proliferasjon av noen, men ikke alle tumorcellene og den aktuelle mekanisme er fremdeles i stor grad ukjent. Heri, fant vi Fas var ugyldig på indusere AGS celleproliferasjon. Fas-signalering er også blitt vist å indusere motilitet av apoptose-resistente tumorceller via urokinase-plasminogen-aktivator [10]. I den foreliggende undersøkelse, rekkes vi en ny mekanisme for Fas-medierende tumorcelle motilitet, som var avhengig av oppregulering av Fascin via aktivering av STAT3.
Det antas generelt at for å unnslippe apoptose forårsaket av Fasl-positive T celler, har kreftceller utviklet flere måter å motstå Fasl-indusert celledød effekter. Tumorceller har blitt vist å nedregulere eller miste Fas-reseptor-ekspresjon [25] eller oppheve den intracellulære Fas-signalveien gjennom mutasjon i Fas [26]. Tumorceller kan også oppregulere cellulær FADD-lignende IL-1β-omdannende enzym-inhiberende protein eller fosforylere caspase-8 for å hemme aktiveringen av caspase-8 og blokkere nedstrømssignalveien fra Fas [27,28]. I denne studien fant vi aktivering av STAT3 i AGS celler etter anti-Fas stimulering. Aktiveringen av STAT3 har vist seg å beskytte cancerceller fra apoptotiske stimuli som kommer fra Fas-reseptoren [29]. Forbehandling av STAT3 inhibitor kan ikke initiere AGS celle apoptose etter Fas aliserte aktiverings (data ikke vist), noe som antyder at aktiveringen av STAT3 ikke er involvert i å hindre AGS-celler fra Fas-indusert apoptose.
Det har vært rapporterte at Lewis lunge carcinoma celler ble konstitutivt resistente overfor Fas-mediert apoptose, men overekspresjon av Fas på disse cellene gjør at Fas-mediert apoptose etter kryssbinding med agonist anti-Fas-antistoff [30], som tyder på at det er en kvalitativ forskjell i de aktiverte signal cellene får, som avgjør deres skjebne etter Fas signalerings. Nivået av Fas-ekspresjon er moderat i AGS-celler og stimulert med høy dose av anti-Fas (20 ug /ml); Vi fant at AGS celler viste noe økt apoptose (data ikke vist). Dette indikerer at apoptose-induksjon og migrering fremme signalering kan både bli aktivert etter at Fas-reseptoren ligering, noe som kan være relatert til nivået av anti-Fas brukes i slike forsøk. Dersom høye nivåer av Fas-signale levering kan ikke oppnås under fysiologiske forhold, vil migrasjon fremme signale ta over etter Fas reseptor ligation og forårsake økt GC metastaser.
For å implementere fjernmetastaser, kraftig bevegeligheten er nødvendig for tumorceller . Fascin, som en actin-bunting protein, er viktig for å opprettholde og stabiliteten av trådformede actin bunter, og derfor er involvert i celle motilitet [31]. I denne studien har vi avdekket at Fas signale var involvert i oppregulering av Fascin uttrykk. IL-6 er rapportert å oppregulere ekspresjon av Fascin GC-celler [32]. Fas-signalering er også blitt vist å fremme IL-6-sekresjon i tumorceller [33]. Disse bevis indikerer at Fas-signale sannsynligvis forsterker virkningen av Fascin oppregulering gjennom IL-6. Vi har videre demonstrert at FAS og Fascin uttrykk var nært beslektet i GC pasienter, styrking av viktigheten av Fas-Fascin akse i ferd med GC metastasering.
I samsvar med tidligere undersøkelser, har vi vist at Fas-indusert aktivering av STAT3 var nødvendig for oppregulering av Fascin. I naken mus lungemetastase modell, STAT3 inhibitor, S3I-201, kunne hemme Fascin ekspresjon i tumorvev. Murin rekombinant Fasl var ute av stand til å aktivere STAT3 aktivering (data ikke vist), noe som tyder på at aktivert signalering initiert ved Fasl på AGS cellene selv er tilstrekkelig for å mediere STAT3 aktivering og nedstrøms Fascin oppregulering. I tillegg til å regulere Fascin uttrykk, er STAT3 også involvert i cellevekst og overlevelse, onkogenese, og kreft metastase i GC [34-36]. En oralt biotilgjengelig små-molekyl STAT3 inhibitor har blitt oppdaget, og kan være et potensielt terapeutisk middel for kreft hos mennesker [37]. Vi spekulerer i at STAT3 inhibitor er et lovende middel som kan brukes i klinisk GC terapi i nær fremtid.
I konklusjonen, viser vi at Fas signalering er involvert i GC metastase gjennom STAT3 avhengig oppregulering av Fascin. Våre resultater tyder også Fas /STAT3 /Fascin veien kan være en molekylære mål for GC terapi.
Takk
Vi pris Dr. Hua Wang for å gi cDNA hentet fra tumorvev av GC pasienter . Vi har også verdsatt redaktør for Medjaden for endring av dette manuskriptet.
