Abstract
Bakgrunn
Cancer stamceller representerer en befolkning på umodne kreftceller som finnes i de fleste solide tumorer. Deres særegne funksjoner gjør dem ideelle modeller for å studere legemiddelresistens og følsomhet. I denne studien har vi undersøkt om kreftstamceller isolasjon og in vitro følsomhet analysen er gjennomførbare i en klinisk setting.
Metoder
Cancer stamceller ble isolert fra effusjon eller frisk kreftvev av 23 pasienter som utviklet seg etter standardbehandling svikt. Spesifikke dyrkningsforhold valgt for umodne kreftceller som uttrykker markører for stemness. Disse cellene ble eksponert in vitro mot kjemoterapeutiske og målrettede midler.
Resultater
Cancer stamceller ble hentet fra levermetastaser i 6 tilfeller (25%), lunge knuter i to (8%), lymfeknutemetastaser i tre (12,5%) og pleural /peritoneal /perikardialeffusjon i 13 (54%). Cancer stamceller ble vellykket isolert i 15 pasienter (63%), inkludert 14 med lungekreft (93,3%). En sensitivitetsanalyse ble vellykket utført hos 7 pasienter (30,4%), med en median på 15 stoffer /kombinasjoner testet (range 5-28) og en median tid som er nødvendig for resultatet av 51 dager (range 37-95).
Konklusjon
den tilnærmingen som brukes for STELLA rettssaken tillatt isolering av kreft stamceller i en konsekvent andel av pasientene. Den lave andelen av saker som fullfører hele prosedyren og lang median tid for å oppnå resultater understreker behovet for en mer effektiv prosedyre.
Trial Registrering
ClinalTrials.gov NCT01483001
Citation: D’Arcangelo M, Todaro M, Salvini J, Benfante A, Colorito ML, D’Incecco A, et al. (2015) Cancer Stem Cells Sensitivity analyse (STELLA) hos pasienter med fremskreden Lung og tykktarmskreft: En mulighetsstudie. PLoS ONE 10 (5): e0125037. doi: 10,1371 /journal.pone.0125037
Academic Redaktør: Xiaoan Liu, The First Affiliated Hospital med Nanjing Medical University, Kina
mottatt: 6 august 2014; Godkjent: 10 mars 2015; Publisert: 8. mai 2015
Copyright: © 2015 D’Arcangelo et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir og tilhørende informasjon filer
Finansiering:. Denne studien ble delvis støttet av italiensk Association for Cancer Research (AIRC 5×1000) til MatildeTodaro, Giorgio Stassi og Federico Cappuzzo, av Fondazione Ricerca Traslazionale (ForRT) Federico Cappuzzo og ved Istituto Toscano Tumori til Federico Cappuzzo og Armida D’Incecco. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser finnes
Innledning
Kreft er den andre dødsårsaken etter hjerte- og karsykdommer over hele verden og lunge, bryst, og kolorektal tumorer er de tre store aktørene. Bryst (BC) og lungekreft (LC) er den ledende årsak til kreft dødsfall hos kvinner og menn, henholdsvis, mens tykktarmskreft (CRC) står for omtrent 10% av alle kreftforekomst og dødelighet [1]. Kirurgisk reseksjon og adjuvant behandling kan kurere tidlig stadium primære svulster. På den annen side, er metastatisk sykdom hovedsakelig uhelbredelig på grunn av dets systemiske natur og motstand mot terapeutiske midler. Faktisk kan mer enn 90% av kreftrelaterte dødsfall skyldes tilbakefall /tilbakefall og ikke til primære lesjoner [2,3]. I de siste to tiårene, har behandlingsresultat særlig forbedret takket være en bedre forståelse av kreft biologi, innføring av nye målrettede /kjemoterapeutika og, viktigst, valg av pasienter basert på biomarkører eller svulst baserte analyser. Men selv denne romanen tilnærmingen viste seg å være uegnet til å kurere pasienter med metastatisk sykdom [4-7]. Denne kliniske virkeligheten understreker behovet for å vurdere nye tilnærminger til behandling av kreftpasienter og for å utvikle nye kliniske verktøy for valg av det beste behandlingsalternativet for den enkelte pasient.
I de siste årene, en liten undergruppe av udifferensiert kreftceller med stamceller-lignende funksjoner ble identifisert innen svulster og oppkalt kreft stamceller (CSC) eller kreft initiere celler. De synes ansvarlig for kreft initiering, næring, progresjon og motstand mot antineoplastiske medikamenter [8]. Ifølge denne hypotesen, CSC stammer fra transformasjonen av normale stamceller. Faktisk, på grunn av deres levetid, stamceller akkumulerer multiple mutasjoner som er nødvendige for carcinogenesis. Støtte denne hypotesen, normale stamceller og CSC aksje flere viktige egenskaper, inkludert:
(a)
selvfornyelse,
(b)
differensiering,
(c)
aktiv telomerase uttrykk,
(d)
aktivering av anti-apoptotiske trasé,
(e)
økt membrantransportøren aktivitet og
(f)
evne til migrasjon og metastaserer [9] . Videre kreft vanligvis viser omfattende fenotypiske, funksjonell og molekylær heterogenitet som kan lett forklares med CSC teorien [10-12]. To modeller har blitt foreslått for å belyse de ulike egenskapene til kreftceller i en tumor: 1) den klonal evolusjon modell, og 2) den CSC modell. Mens de tidligere postulater at alle cellene i en kreftsvulst har potensial til å gi opphav til nye svulster, foreslår det sistnevnte som bare kreftceller med stamceller-lignende funksjoner kan opprettholde startfasen og progresjon [13-16]. Eksperimentelle bevis på en rekke forskjellige tumorer støtter sterkt CSC hypotesen. Betydningen av CSC i startfasen har blitt godt etablert i leukemi og nylig rapportert i en rekke forskjellige faste tumorer så som bryst, tykktarm, hjerne, prostata, ovarie, lunge cancer og melanom [17-24]. Vår gruppe har tidligere identifisert og karakterisert et CD133
+ svulst celle subpopulasjon utstyrt med selvfornyelse og multi-avstamning differensiering kapasitet akkurat som normale stamceller [25]. Denne lille undergruppe CSC beholder tumorigent kapasitet når transplantert inn immun-mangelfull mus [25,26]. De resulterende xenotransplantater er histologisk og molekylært ligner foreldre tumor hvorfra de stammer [27]. Dette spennende egenskapen gjør CSC en god modell for studiet av biologi og følsomhet for svulster i den enkelte pasient til antineoplastiske midler.
CSC-skjerm med høy uttrykk nivåer av ATP-bindende kassett (ABC) transportører, anti-apoptotiske faktorer , og en aktiv DNA-reparasjon kapasitet som gjør dem spesielt motstandsdyktig mot narkotika og giftstoffer [28-30]. I tillegg er det tilsynelatende tumor debulk oppnådd med kjemoterapi bidrar til CSC bassenget berikelse, og dermed øke risikoen for utvikling av mer resistente fenotyper [31]. Denne kollektive bevis tyder på at den felles inefficacy av konvensjonell terapi på stamcelle befolkningen kan delvis forklare kreft motstand mot tilgjengelige behandlinger. Derfor vet spekteret av følsomheten til CSC undergruppe av den enkelte svulst og målretting selektivt denne undergruppe kan gi betydelig bedring av behandlingsresultatene.
Med tanke på dagens mangel på spesifikke midler rettet mot CSC og tidligere rapportert observasjoner, vi gjennomførte en prospektiv ikke-randomisert studie (STELLA rettssaken, ClinicalTrials.gov: NCT01483001) for å vurdere om isolering og testing CSC mot et bredt spekter av antineoplastiske midler er gjennomførbart i klinisk setting. Videre studien søkt for å fastslå om en slik tilnærming kan potensielt identifisere medikamenter med
in vitro
aktivitet mot CSC avledet fra den enkelte pasient, og dermed gi nye personlige terapeutiske muligheter. Studien viste at testing av CSC kjemosensitivitet er gjennomførbart i klinisk setting, selv om en mer effektiv
in vitro
metoden er nødvendig.
Metoder
Valgbarhet, rekruttering og oppfølging
protokollen for denne rettssaken og støtte TREND sjekkliste er tilgjengelig som tilleggsinformasjon; se S1 Protocol og S1 TREND sjekkliste.
STELLA studien var en prospektiv, ikke-randomisert, åpen, klinisk studie som undersøkte mulighetene for intervensjon av CSC isolasjon og kjemosensitivitet analysen i klinikken (S1 Protocol). Studien ble godkjent av «Etikk Review Board for Investigation of Drugs» av Civil Hospital of Livorno. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient før innmelding. Pasienter som ble fulgt eller henvist til medisinsk onkologi Department of the Hospital of Livorno og som møtte kriteriene ble inkludert i studien. Kvalifiserte pasienter hadde bekreftet cytologisk eller histologisk diagnose av metastatisk lungekreft, brystkreft eller tykktarmskreft; forbehandlet med standardbehandling og uten ekstra standard terapeutiske alternativer; med en funksjonsstatus på 100% i henhold til Karnofsky poengsum; tilstrekkelige hematologiske, nyre- og leverfunksjoner. Hoved ineligibility kriterier inkludert manglende evne til å få frisk svulstvev eller neoplastisk effusjon egnet for CSC utvinning og komorbiditet potensielt interfererer med studien. Kliniske karakteristika for pasienter samt molekylære funksjoner i tumorer (når tilgjengelig) ble samlet og registrert i en elektronisk database ved Avdeling for medisinsk onkologi av borger Hospital of Livorno. To pasienter ble først diagnostisert med en CRC og inkludert i studien, men en patologi revisjon viste en annen histologi (kreft i bukspyttkjertelen og tynntarm adenokarsinom), og dermed representerer et avvik fra studieprotokollen.
Det primære målet for studien var å vurdere muligheten for en sensitivitetsanalyse på CSC i en klinisk setting, tar hensyn til prosentandelen av pasienter for hvem det var mulig å utføre analysen, og den periode for å oppnå følsomhetsresultater. Sekundære endepunkter var identifisering av LC, CRC og BC stamceller og evaluering av deres
in vitro
følsomhet for antitumormidler. Sistnevnte ble uttrykt som dødelighet, dvs. andelen av døde celler etter kjemosensitivitet analysen.
Pasientene ble registrert over en to måneders periode (06.12
th 2011-31 januar
st, 2012), og ble fulgt opp til død eller pasientens avslag (fra desember 2011 til desember 2013) med jevne mellomrom i henhold til klinisk behov og oppfatning av legen. Telefonintervjuer ble gjennomført i tilfelle pasienten var ute av stand til å delta på polikliniske besøk.
Tissue Collection, isolasjon og kultur av kreftceller
neoplastiske effusjon (hvis den finnes) eller svulstvev fra primær kreft eller fra den mest tilgjengelige metastatisk nettstedet ble innhentet fra alle kvalifiserte pasienter etter informert samtykke signatur i Civil Hospital of Livorno. Ferske prøver ble sendt over natten ved romtemperatur til celle- og molekylær patofysiologi Laboratory ved University of Palermo, Italia. Tumorstykkene ble intensivt vasket i PBS-løsning, og inkubert over natten i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM, Gibco) supplementert med penicillin (500 U /ml, GIBCO), streptomycin (500 ug /ml, GIBCO) og amfotericin B (1,25 ug /ml , GIBCO) for å unngå mikrobiell kontaminasjon. Tumorprøver ble enzymatisk spaltet med kollagenase og hyaluronidase og mekanisk ristet i en time ved 37 ° C. Alternativt ble neoplastiske effusjoner separert ved sentrifugering (1200 rpm, 10 min, 4 ° C). Oppsamlede celler ble dyrket i stamcelleserumfritt medium supplert med epidermal vekstfaktor (EGF 20 ng /ml, Sigma-Aldrich) og basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF, 10 ng /ml, Sigma-Aldrich) og sådd ut i ultra-low festeplate (Corning) som tidligere beskrevet [25]. Disse betingelser favoriserer vekst av høyt tumorigene stilk-lignende celler, mens en negativ seleksjon for mindre tumorigene differensierte tumorceller, som tidligere vist ved Eramo et al [24]. Overlevende umodne kreftceller sakte sprer og danner celle sfærer. Kule-avledede celler ble ekspandert ved mekanisk og /eller enzymatisk dissosiasjon og re-belagt i fullstendig frisk stamcelle medium. Cellekulturer ble opprettholdt ved 37 ° C i en 5% CO
2 fuktet inkubator.
Den studieprotokoll inkludert
in vivo
eksperimenter som aldri er blitt utført fordi alle tilgjengelige celler ble brukt for kjemosensitivitet tester i arbeidet med testing så mange medisiner som mulig og dermed identifisere en potensiell behandling for pasienten.
Immunofluorescensanalyse karakterisering av kuler
Sphere-avledet celler ble vist seg å være CSC etter immunfluorescens karakterisering for stemness membranmarkører. Kort fortalt kreftkuler ble mekanisk og enzymatisk dissosiert å skaffe enkeltceller. Celler ble fikset og permeablized som tidligere rapportert [25]. Cytospun Cellene ble vasket i PBS og eksponert over natten ved 4 ° C for å antistoffer mot CD133 (AC133, muse-IgG
1, Miltenyi), CD166 (mus lgG1, R 50% (tabell 3)
Pasienter behandling
studien ikke tenke på behandling av pasienter og dens endepunkter inkluderte ikke om
in vitro
resultatene korrelerer med klinisk respons. Men ingen gyldig terapeutisk alternativet var tilgjengelig for disse pasientene, og når det er mulig, tilbød vi dem en behandling med en av de testede stoffene. Den valgte regime var alltid den med høyest
in vitro
dødelighet. Siden det ikke er anerkjent cut-off verdien av
in vitro
resultat definere klinisk følsomhet /resistens, kan det ikke utelukkes at regimer med lav
in vitro
dødelighet kan gi kliniske respons og, derfor valgt regime kunne ha hatt en lav dødelighet. Som vist i tabell 3, av de 7 fagene for hvem en sensitivitetsanalyse var tilgjengelig, bare 3 mottok en behandling basert på testresultatene. observert den høyeste dødeligheten
in vitro
var 10% i to av disse pasientene og sykdommen utviklet seg kort tid etter behandlingsstart. Den første pasienten var en aldri røyker kvinne med en metastatisk lunge adenokarsinom uten molekylære driver aberrasjon. Hun mottok en kombinasjon av oksaliplatin og paclitaxel, men sykdommen utviklet seg etter bare to sykluser. Den andre pasienten var en tidligere røyker mann med
KRAS
mutert avansert adenokarsinom i lungene. Han fikk en kombinasjon av carboplatin og pemetrexed og hans sykdommen utviklet kort tid etter. På den annen side, i en ung mann med en metastatisk
EGFR
mutert adenokarsinom i lungene
in vitro
analysen viste en celle dødelighet på 40% for kombinasjonen av oksaliplatin og paclitaxel. Pasienten mottok 5 sykluser med de ovennevnte kjemoterapeutiske medikamenter, å oppnå en stabilisering av sykdom. Til tross for den gunstige effekten, med tanke på at pasienten allerede hadde fått 7 behandlingslinjer, bestemte klinikeren å stoppe behandling for økt risiko for toksisitet. De 4 andre pasienter hvor en sensitivitet test ble utført fikk ikke behandling fordi de døde før resultatene ble tilgjengelige. Samlet er disse anekdotiske funnene tyder på at høyere
in vitro
følsomhet kan slå ut i bedre klinisk resultat.
Diskusjoner
Samler bevis støtter eksistensen av cscs i humane tumorer. Disse cellene har kapasitet til å fornye seg selv og differensieres til modne tumorceller. De synes å kjøre startfasen, progresjon, og metastasering. Gitt sin høye motstand mot kreft narkotika, de er antatt å bidra betydnings til tilbakefall etter kjemoterapi og representerer en attraktiv terapeutisk mål til potensielt oppnå langvarig behandlingstiltak. Derfor har anerkjennelse av de mest aktive legemidler på CSC undergruppe potensial til å identifisere den beste behandling valget for den enkelte pasient eller nye behandlingstilbud for pasienter som utvikler seg på standardbehandling.
Tidligere studier har allerede beskrevet isolasjon prosedyren for CSC. Den STELLA Studien er den første prospektive studien som evaluerer anvendelsen av denne prosedyren i en klinisk setting med sikte på å teste
in vitro
følsomhet for CSC og potensielt identifisere nye terapeutiske muligheter for pasienten. Tatt i betraktning at mulighets var det primære endepunktet i studien var et begrenset antall individer registrert, de aller fleste med diagnosen LC, den hyppigste sykdommen henvist til vår institusjon. Studien viste at prosedyren var mulig i 65% av tilfellene, noe som fører til en chemo-følsomhet resultat i en tredjedel av pasientene i en median tid på 51 dager. Samlet denne foreløpige erfaringen ga oss meget relevant informasjon.
Først av alt, stedet for svulst prøvetakingen var avgjørende for å lykkes med isoleringsprosedyren siden neoplastiske effusjon var den mest dyktig til slike formål. Dette er også et aktuelt aspekt for klinisk praksis siden effusjon samling er forholdsvis lett og ofte nødvendig for symptomlindring, det har lav risiko og det er generelt godt akseptert av pasienter. Etter vår mening den prøvetype, enten det var frisk vevsprøver eller neoplastisk effusjon, var den faktoren som i hovedsak påvirket på den lave prosentandelen av pasientene har dratt nytte av testen. Andre faktorer, som for eksempel den type kulturmediet, kan ha hatt en mindre innvirkning.
Median tid mellom prøvetaking og følsomhet analyseresultatene var 51 dager. Dette er en forholdsvis lang tidsperiode for metastatiske kreftpasienter, som forklarer hvorfor mindre enn 50% av forsøks for hvem sensitivitetstesten var tilgjengelig mottok en terapi basert på resultatene. Hvorvidt dette bortfall av tid er tilstrekkelig til å ytterligere endre tumorcellebiologi og deres følsomhet for legemidler er ikke kjent, og for tiden er det ingen vitenskapelige bevis for dette. For å forkorte denne tidsrammen, basert på STELLA erfaring, er en pågående klinisk studie (LUCAS) med en annen analyse (Tecan Infinite F500 etter Cell Titer-Glo Lysende celleviabilitet Assay, Promega). Denne metoden bestemmer antallet levedyktige celler basert på kvantifisering av et luminescent signal som er proporsjonalt med mengden av ATP; det krever et mindre antall celler og gir nyttige resultater på bare 7 dager fra biopsi. Dette kan bidra til å oppnå resultater i en kortere periode, og teste flere legemidler for pasienter med langsom
in vitro
vekst av CSC. Videre leverer den kvantitative resultater, noe som eliminerer dårligere presisjon av de foregående semi-kvantitativ metode. Denne nye tilnærmingen kan også øke prosentandelen av pasienter hvor kjemosensitivitet testen kan med hell utføres. Faktisk, i STELLA studere følsomhet analysen ble utført i bare syv tilfeller hovedsakelig for de fattige
in vitro
cellevekst.
I vår studie CSC viste høy motstand mot tilgjengelige legemidler, inkludert standard kjemoterapi agenter og målrettet terapi, med bare ett tilfelle viser en dødelighet over 50%. Dette er ikke uventet med tanke på høy motstand fra CSC til brukte antitumormidler, fremhever det presserende behovet for mer effektive legemidler spesifikt rettet mot denne cellepopulasjon.
I konklusjonen, den tilnærmingen som brukes for STELLA rettssaken tillatt CSC isolasjon i en jevn andel av pasientene. Den lave andel av tilfellene fullføres fremgangsmåten i kjemosensitivitet analysen og den lange median tid for å oppnå de fullstendige resultater understreker behovet for en mer effektiv fremgangsmåte. I et slikt perspektiv vil det for tiden pågår LUCAS studie avklare potensielle kliniske implikasjonene av terapi målrettet på cscs.
Hjelpemiddel Informasjon
S1-protokollen. Studieprotokoll, informasjonsbrev for allmennlege og informert samtykke skjema
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125037.s001 product: (PDF)
S1 TREND Sjekkliste. . TREND sjekkliste
doi: 10,1371 /journal.pone.0125037.s002 product: (PDF)
