Abstract
Stress-indusert phosphoprotein 1 (STIP1) er nylig blitt identifisert som en utgitt biomarkør i menneskelig eggstokkreft. I tillegg har STIP1 utskilt av humane eggstokkreft celler blitt vist å fremme tumorcelleproliferasjon ved å binde seg til Alk2 (aktivin reseptor A, type II-lignende kinase 2) og aktivere SMAD-ID3 signalveier. I denne studien ble totalt 330 ovarialcancer tumorprøver evaluert for STIP1 uttrykk ved immunhistokjemi og analysert for en mulig sammenheng med pasientens egenskaper og overlevelse. Kvantifisering av immunoreaktivitet ble oppnådd ved å anvende en immunohistokjemisk scoringssystem (histoscore). Pasienter med høyt nivå STIP1 uttrykk (histoscore ≥169) hadde en signifikant lavere overlevelse (høy STIP1, mener overlevelsestid = 76 måneder, lav STIP1, mener overlevelsestid = 112 måneder;
P
0,0001). Videre STIP1 histoscores var signifikant høyere i høy grad tumorer (grad 3) enn i lav grad (grad 1-2) maligniteter (
P
0,0001), noe som tyder på at STIP1 kan være en proxy for svulst aggressivitet. Resultatene av multivariabel analyse viste at høy STIP1 histoscores, avanserte stadier, histologiske typer, og tilstedeværelsen av restsykdom (≥2 cm) var uavhengige prediktorer for dårlig prognose. Tillegg av STIP1 histoscores bedre prediksjon av generelle og progresjonsfri overlevelse priser i multivariat Cox proporsjonal risikomodell. Behandling av eggstokkreft celler med rekombinante STIP1 stimulert celleproliferasjon og migrasjon, men samtidig behandling med anti-antistoffer STIP1 avskaffet denne effekten. Våre funn tyder på at STIP1 uttrykk kan være relatert til prognose og at STIP1 veien kan representere en roman terapeutisk mål for menneskelig eggstokkreft
Citation. Chao A, Lai CH, Tsai CL, Hsueh S, Hsueh C, lin CY, et al. (2013) Tumor Stress-Induced Phosphoprotein1 (STIP1) som en prognostisk Biomarker i eggstokkreft. PLoS ONE 8 (2): e57084. doi: 10,1371 /journal.pone.0057084
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
mottatt: 6 oktober 2012; Godkjent: 16 januar 2013; Publisert: 27 februar 2013
Copyright: © 2013 Chao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Science Council (NSC100-2314-B-182-016MY3 til THW), Chang Gung Medical Research Foundation (CMRPG391451 /2 til AC, CMRPG 391461/2 til THW), og Department of Health ( DOH101-TD-i-111-TM013 til THW, DOH101-TD-C-111-006 til AC og THW). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer er en av de mest dødelige kreftformer som påvirker kvinner [1]. Nesten 225 500 ovarialcancer nye tilfeller forekommer over hele verden hvert år, med ansvar for 140,200 dødsfall [2]. Ovariekarsinomer utgjør en heterogen gruppe svulster, de fire vanligste histologiske subtyper være serøs, endometrioid, klare celle, og mucinous [3]. Målingen av serum kreftantigen 125 (CA125) nivåer er blitt standard praksis for preoperativ evaluering av ovarian masser [4]. I tillegg har CA125 vist seg å være nyttig for å overvåke terapeutiske respons og i overvåking av pasienter med ovarialcancer [5]. Imidlertid er CA125 ikke forhøyet i alle ovarietumorer og ikke har tilstrekkelig positiv prediktiv verdi for populasjonsbasert risikovurdering eller tidlig deteksjon [6]. På grunn av begrensninger i CA125 som en sykdom markør, det er et presserende behov for nye biomarkører som kan brukes som prognostiske indikatorer i eggstokkreft å effektivt skille mellom aggressiv og mindre aggressiv sykdom.
Nyere teknologiske fremskritt, spesielt innen genomikk og proteomikk, er påskynde oppdagelsen av nye kreft biomarkører [7], [8]. Ved å sammenligne proteom av svulsten interstitiell væske (TIF) og normal interstitiell væske (NIF), har vi nylig identifisert stress indusert phosphoprotein 1 (STIP1) som kandidat biomarkør for menneskelig eggstokkreft [9]. Serum STIP1 nivåene er signifikant høyere hos pasienter med eggstokkreft enn i alderstilpassede friske kontroller [9] og minske betraktelig etter kirurgisk fjerning av svulsten [10]. I tillegg har den kombinerte målingen av CA125 og STIP1 vist seg å forbedre tidlig påvisning av kreft i eggstokkene [9], som støtter den kliniske nytten av STIP1 som en biomarkør i denne malignitet [11].
STIP1, også kjent som Hsp70 /HSP90 organiserende protein (HOP), transformasjon-sensitive protein IEF SSP 3521 (IEF-SSP-3521), P60, STI1, STI1L, (GeneID 10963; HPRD 05454), en 62,6 kDa protein, inneholder tre tetratricopeptide gjenta (TPR) domener [12] som er i stand til å interagere med varmesjokkproteiner for å danne komplekser som deltar i forskjellige biologiske prosesser som strekker seg fra RNA-spleising, transkripsjon, proteinfolding, signaltransduksjon, og cellesyklusregulering [13], [14]. I neuronale vev, binder ekstracellulære STIP1 til prionproteiner og utløser forskjellige signalveier – inkludert den endogene mitogen-aktivert protein kinase 1/2 (ERK1 /ERK2), proteinkinase A og fosfatidylinositol 3-kinase signaleringskaskader – til slutt fører til en økning i celleproliferasjon [15], [16], [17]. I eggstokk-kreft, har vi vist at STIP1 binder seg til et benmorfogenetisk protein (BMP) reseptoren – betegnet aktivin A-reseptoren, type II-lignende kinase 2 (alk2) – for å aktivere SMAD signalveien og den transkripsjonelle aktivering av ID3 (inhibitor av DNA-bindende 3) [10]. Samlet utgjør disse funnene tyder på at STIP1 skilles ut av menneskelig eggstokkreft celler fremmer kreft celleproliferasjon ved å opptre i en autokrin og /eller parakrint mote.
Selv om utgivelsen av STIP1 fra menneskelig eggstokkreft har blitt bekreftet av en uavhengig forskergruppen [18], er det få tilgjengelige data om nytten av STIP1 immunhistokjemisk analyse for å vurdere prognose i eggstokkreft [19]. I denne studien ble totalt 330 eggstokkreft tumorprøver evaluert for STIP1 uttrykk ved immunhistokjemi og analysert for en mulig sammenheng med pasientens egenskaper og overlevelse.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført i henhold til Helsinki deklarasjonen og ble godkjent av Institutional Review Board av Chang Gung Memorial Hospital (CGMH-IRB # 99-0112B og # 97-1444C).
Pasienter
Mellom 2000 og 2005, totalt 403 påfølgende pasienter diagnostisert med kreft i eggstokkene ved Linkou Medical Centre of Chang Gung Memorial Hospital ble inkludert i studien. De histologiske typer var som følger: serøs (n = 160), mucinous (n = 68), endometrioid (n = 73), klar cellecarcinom (n = 64), og blandede celletyper (n = 38). Eksklusjonskriteriene var som følger: (i) pasienter som gjennomgikk neoadjuvant behandling før definitiv kirurgi eller som ble henvist fra utenfor sykehus etter den første operasjonen; (Ii) pasienter som gjennomgikk laparoskopisk kirurgi som den primære behandling; (Iii) pasienter som ikke ble fulgt opp i de første tre månedene etter primærbehandling; (Iv) pasienter med udifferensiert karsinom som oppstår i teratomas; og (v) pasienter med patologiske utilgjengelig parafinblokker. Progresjonsfri overlevelse (PFS) ble beregnet som tidsintervallet (i måneder) fra datoen for operasjonen til datoen for dokumentert sykdomsprogresjon (retrospektivt definert basert på heving av serum CA125 og /eller radiografiske tegn på progresjon). Total overlevelse (OS) ble definert som tidsintervallet mellom datoen for kirurgi og dødsdato.
Immunohistochemistry
arkiver formalinfiksert, parafininnstøpte ovarialcancer vevsdelene var hentes som tidligere beskrevet [9], [20], [21]. Seksjonene ble farget med et muse anti-human STIP1 monoklonalt antistoff (Abnova Corp., Taipei, Taiwan, 1:1,800 fortynning) ved hjelp av en automatisert immunhistokjemi Stainer med Ventana Basic DAB (3,3-diaminobenzidin) Detection kit (Tucson, AZ, USA). Skinnene ble evaluert uavhengig av to patologer (S. H. og C. H.) som ble blindet til clinicopathological data og patients’identities. Den samlede poengsum immunhistokjemisk (histoscore) ble uttrykt som prosentandelen av positive tumorceller (0-100%) multiplisert med sin fargeintensitet (0 = negativ 1 = svak 2 = moderat 3 = sterk). Derfor er den totale histoscore varierte 0-300 [22]. Valideringen av anti-STIP1 antistoffspesifisitet ble utført ved å blokkere antistoffer med 400 nM av rekombinant humant STIP1 protein (rhSTIP1) under inkuberingstrinnet med anti-STIP1.
Cell Culture
Ovarian cancer-cellelinjer (BG1, MDAH2774) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Celler ble dyrket i 10% FBS, penicillin (100 enheter /ml), streptomycin (100 enheter /ml) og DMEM /F12 medium ved 37 ° C i en 5% CO
2 atmosfære.
cellemigrering Assay
BG1 og MDAH2774 celler (10
6 /brønn) – behandlet med enten rhSTIP1 (400 nM) eller bæreren alene – ble dyrket i serumfritt medium i 24 timer. Cellene ble deretter sådd ut i det øvre kammer av en Transwell (24-brønners, 8-um porestørrelse, Corning Inc., Corning, NY, USA). Det nedre kammer ble fylt med 800 ul DMEM /F12 og 0,5 ug /ml av fibronektin (Sigma, St. Louis, MO, USA). Etter 26 timers inkubering ble cellene som hadde migrert gjennom porer og festet til den nedre membranen farget med fluorescein og kalsein-AM (4 ug /ml, BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Antall levedyktige celler som var krysset filteret ble bestemt ved fluorescens-måling for hver prøve ved å bruke en Tecan Infinite M200 flere brønner leser (Tecan, Männedorf, Sveits). Nøytraliseringen av STIP1 ble utført ved anvendelse av et anti-STIP1 antistoff (800 nM). Alle analyser ble gjentas minst tre ganger.
lukking av sår analysen
For å undersøke effekten av STIP1 på celle migrasjon, MDAH2774 celler (10
6 /brønn) som enten ble behandlet med 400 nM av rhSTIP1 eller kjøretøyet ble sådd ut i 3,5-cm skåler etter 24 timer i kultur i serumfritt medium. Mediet ble deretter erstattet med en som inneholdt 0,4% FBS. Cellemigrering ble observert gjennom en åpning. Fase kontrast bilder av hullene ble tatt til fange ved baseline og etter 24 timer med behandling med en invertert mikroskop (forstørrelse, 10 ×). Den WimScratch programvare (Wimasis, Munchen, Tyskland) ble brukt for analyse av sårlukking [23].
celleviabilitet-analysen ved anvendelse av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5 difenyltetrazoliumbromid (MTT)
konverteringen av de gule tetrazoliumsalter til lilla formazon krystaller av mitokondrier ble brukt som en proxy for celle levedyktighet. I 48-brønners plater, 5 x 10
4-celler ble dyrket i 200 pl medium per brønn over natten. Tyve ul av MTT-reagens ble tilsatt til hver brønn, og etter 4 timer ble 200 ul solubilisering-løsning (10% SDS i 0,01 M HCl) per brønn tilsettes for over natten. Absorbansen ble bestemt ved 570 nm i en mikro spektrofotometer (PerkinElmer Life Science). For å teste effekten av knockdown av STIP1 på celle levedyktighet, ble eggstokkreft celler transfektert med 50 nm dobbeltrådet siRNA rettet mot STIP1 eller kontrollere siRNA i Lipofectamine RNAimas (Invitrogen, Calsbad, CA), som vi tidligere rapportert [10]. Etter 48 timer av transfeksjon ble cellene dyrket i platen for MTT-analyser.
bromdeoksyuridin (BrdU) inkorporering analysen
For å undersøke effekten av STIP1 på celleproliferasjon, BG1 og MDAH2774 celler (10
4 celler /brønn) ble dyrket i komplett medium i 24 timer, etterfulgt av 72 timer fra serum sult. Cellene ble deretter behandlet med enten 400 nM av rhSTIP1 eller kjøretøyet i 24 timer. DNA-syntese ble analysert med Cell Proliferation ELISA, BrdU Kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) ved hjelp av kolo påvisning i henhold til produsentens protokoll [21], [23]. Nøytraliseringen av eksogent STIP1 ble utført ved anvendelse av anti-STIP1 antistoff (800 nM).
Ki67 immunocytokjemisk analyse
BG1 og MDAH2774 celler ble serum-sultet i 72 timer og deretter behandlet med enten 400 nM av rhSTIP1 eller kjøretøyet i 24 timer. Den proliferativ aktivitet ble testet ved immunocytokjemisk farging av Ki67 å bruke et monoklonalt antistoff mot Ki67 (NeoMarker, Fremont, CA, USA).
Statistical Analysis
Forskjellene i histoscore mellom to grupper ble sammenlignet med Mann-Whitney
U
test. Den Kruskal-Wallis-test ble anvendt for å sammenligne mer enn to grupper. Evnen til STIP1 histoscores å diskriminere mellom overlevde og de avdøde pasienter ble vurdert ved å plotte mottaker operasjonelle egenskaper (ROC) kurve, som assosierer den sanne positive rate (følsomhet) til falsk positiv rate (1-spesifisitet) og ved å beregne Arealet under kurven (AUC). Tidsavhengig ROC-kurver ble brukt for å vurdere AUCene ved forskjellige tidspunkter [24]. Den Cox regresjonsanalyse ble brukt for å identifisere de uavhengige prediktorer for OS og PFS. Alle variablene med univariate foreninger på
P
0,05 ble inngått i multivariat modell. For å undersøke effekten av å tilsette STIP1 til den prognostiske Cox-modellen for pasienter med invasiv kreft i eggstokkene, subtrahert vi avviks av modellen med tillegg av STIP1 fra avviks av modellen uten STIP1. Forskjellen ble deretter testet mot en khikvadratfordeling med frihetsgrader lik differansen mellom frihetsgrader av de to modellene (enten med eller uten STIP1) [25]. Resultatene er presentert som justerte hazard ratio (HR) og 95% konfidensintervall (KI). Alle analyser ble utført ved hjelp av SPSS 17.0 statistikkpakken (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Vi brukte R-pakken
survivalROC product: (R versjon 2.15.1; R grunnlaget for Statistisk Computing, Wien, Østerrike) for beregning av tidsavhengige ROC kurver. To-tailed
P
verdier. 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant
Resultater
En høy STIP1 Immunhistokjemisk Expression er forbundet med høy-scenen, høy klasse, og Invasive eggstokkreft
resultatene av immunhistokjemi (IHC) viste at behandling med et overskudd av rekombinant STIP1 helt avskaffet immun-anerkjennelse av vev STIP1 av anti-STIP1, bekrefter spesifisiteten av anti-STIP1 antistoff brukes i denne undersøkelsen (figurene 1A-D). For den samme anti-STIP1 antistoff som brukes i IHC gjennom denne studien, western blot analyse av flere eggstokkreft cellelinjer også bekreftet sin spesifisitet i å gjenkjenne STIP1 (figur S1). Forskjellene i STIP1 immunhistokjemisk farging er vist i figurene 1E-G.
STIP1 uttrykt i cytoplasma av eggstokkreft celler er farget brun. Immunreaktiviteten til STIP1 til anti-STIP1 antistoff i kreftvev (A, C) ble opphevet ved tilsetning av 15 ug rekombinant human STIP1 under inkubasjon (B, D); Disse resultatene støtter spesifisiteten av anti-STIP1 antistoff. Intensiteten av STIP1 farging ble gradert som en (E), 2 (F), og 3 (G). Alle lysbildene som presenteres her var fra eggstokkene serøs karsinomer. De skala barer representerer 100 mikrometer (A, B) eller 20 mikrometer (C-G)
totalt 330 pasienter med kreft i eggstokkene (median alder 50,7 år,. Utvalg, 17-90 år ) ble inkludert i studien. De generelle karakteristikker av studien pasienter er presentert i tabell 1. Av de 50 pasienter med borderline ovarian tumorer (BOT), 49 (98%) var i stadium I eller II. I motsetning 146 (52,1%) av de 280 pasientene med invasiv kreft var i stadium III eller IV. Serøs karsinom var den vanligste histologiske subtype. Høyere STIP1 histoscores var signifikant assosiert med høyere alder (≥ 50 år), avansert stadium, tilstedeværelsen av ikke-mucinkjertler kreft (serøs, klarcellet eller endometrioid karsinom), klasse 3, invasiv kreft, høyere CA125 nivåer (≥35 U /ml), og suboptimal primær kirurgisk cytoreduksjon (restsykdom ≥2 cm) (tabell 1).
En høy STIP1 Immunhistokjemisk Expression er assosiert med redusert total overlevelse (OS)
median varighet av oppfølgingen var 69,3 måneder (range, 4-130 måneder). For å undersøke potensialet nytten av STIP1 immunhistokjemisk uttrykk som en biomarkør i eggstokkreft, vi brukte ROC kurven for å kvantifisere hvor godt ulike histoscores kunne brukes for prediksjon av overlevelse. Fordi et minimum oppfølging på 3 år var nødvendig for å overleve analyse bestemmes av ROC kurve, ble totalt 245 pasienter inkludert i denne analysen. Den optimale cutoff for STIP1 histoscore å skille mellom pasienter som overlevde (n = 191) og de som døde (n = 54) var 169 (følsomhet = 0,889, spesifisitet = 0,492). I analysen av alle studert pasienter inkludert både invasive (n = 280) og grensetilfeller (n = 50), den kumulative OS av pasientene med STIP1≤169 (n = 119) var signifikant høyere (
P
0,0001) enn de med en poengsum 169 (n = 211) i Kaplan-Meier analyse. De mener overlevelse perioder var 112 og 76 måneder, henholdsvis (figur 2A)
Kaplan-Meier kurve analyser for total overlevelse viste at kvinner med en STIP1 histoscore . 169 (rød linje) hadde signifikant lavere total overlevelse enn de med en STIP1 histoscore ≤169 (blå linje). Statistiske betydninger (
P
0.0001) ble påvist i analysene av (A) alle tilfeller (n = 330) inkludert invasiv kreft og borderline tumor (BOT), (B) invasiv eggstokkreft i alle celletyper (n = 280), og (C) bare invasiv serøs type eggstokkreft (n = 107).
Fordi border ovarietumorer er generelt preget av en god prognose og er ikke vanligvis inkludert i eggstokkene kreft kliniske studier, uavhengig prognostisk betydning STIP1 nivåer ble analysert bare i undergruppen av pasienter med invasiv kreft i eggstokkene (n = 280). Resultatene av multivariat analyse viste at STIP1 histoscores 169 var uavhengig, betydelig prognostisk faktor for OS (
P
0,005) og for PFS (
P
0,05) (Tabell 2 ). Kaplan-Meier analyser viser også at STIP1 histoscores 169 var signifikant assosiert med dårlig OS både i alle invasive tilfeller av denne studien (n = 280) (figur 2B) og i invasive serøs eggstokkreft (n = 170) (figur 2C) .
en høy STIP1 Immunhistokjemisk Expression er forbundet med høy grad av Svulster
Histologisk gradering er en viktig parameter for risikovurdering av pasienter med eggstokkreft. Som vist i tabell 1, de STIP1 histoscores var betydelig høyere i høy grad (grad 3) svulster enn i lav grad (grad 1-2) maligniteter (
P
0,0001). Vi undersøkt videre den kliniske betydningen av STIP1 immunoexpression i eggstokkreft i henhold til deres histologisk type og kvalitet. Flertallet av karakteren 3 svulster viste en STIP1 histoscore 169; Spesielt, 92,8% (77/83) av den serøs typen, 92,3% (12/13) av endometrioid, og 76,5% (13/17) av de blandete karsinomer viste en høy STIP1 uttrykk. Av de 57 klare celle eggstokkreft som vanligvis ikke gradert [3], 40 (70,2%) viste en STIP1 histoscore 169. De kumulative OS forekomst av pasienter med lavgradig (klasse 1-2) maligniteter var betydelig høyere enn de av pasienter med grad 3 maligniteter (
P
0,0001). De gjennomsnittlige overlevelses perioder var 102 og 66 måneder, henholdsvis (figur S2). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at høy STIP1 histoscores er forbundet med en spesielt aggressiv atferd i eggstokkreft.
Tilføyelsen av STIP1 Histoscores Forbedrer Prognostic Stratifisering av pasienter med invasiv eggstokkreft
For å teste enten STIP1 histoscores gitt informasjon i tillegg til tiden brukes svulst gradering og iscenesettelse, analyserte vi virkningen av STIP1 nivåer på klinisk overlevelse kun hos pasienter med de samme karakterene eller samme kliniske stadier. Hos pasienter med grad 3 eggstokkreft, pasienter med STIP1 169 (n = 102) hadde en signifikant (p = 0,022) dårligere 5-års overlevelse på 44,5% enn 63,6% i de med STIP1≤169 (n = 11). Hos pasienter med grad 1-2 eggstokkreft, tilfeller med STIP1 169 (n = 62) hadde en dårligere 5-års overlevelse på 73,8% enn 85,3% i de med STIP1≤169 (n = 48), selv om forskjellen nådde ikke statistisk signifikans ennå (P = 0,197). Videre i pasienter med avanserte stadier (III og IV) av serøs karsinom og ubestemt klasse 2-3 (n = 8), alle av dem hadde STIP1 169 og 7 av dem (87,5%) bukket under for sykdommen i løpet av oppfølgings opp for denne studien.
Vi utførte også en analyse av avvik og konstruerte den tidsavhengige ROC-kurver (enten med eller uten STIP1) for å undersøke om tilsetning av STIP1 histoscores kan forbedre den prognostiske lagdeling av pasienter med invasive eggstokkreft. I disse analysene, andre potensielle prediktorer inkludert i modellen var scenen, type, serum CA125, og tilstedeværelsen av restsykdom. Modellen av å legge til STIP1 histoscore til andre prognostiske faktorer betydelig bedre enn modellen uten STIP1 viser både høyere AUC og lavere avvik i begge OS (figur 3A,
P
= 0,0008) og PFS (figur 3B,
P
= 0,014). Sammen er disse resultatene indikerte at tumor STIP1 histoscoring hadde en prognostisk verdi i tillegg til gradering og staging.
Den tidsavhengige AUC (areal under kurve ROC) av modellen, inkludert STIP1 er rapportert som et rødt faststoff linje, mens AUC for modellen uten STIP1 er vist som en blå stiplet linje. Andre parametre som inngår scenen, type, serum CA125, og restsykdom. (A) Total overlevelse, (B) progresjonsfri overlevelse.
STIP1 stimulert spredning og migrasjon av eggstokkreft celler
For å undersøke de biologiske funksjonene STIP1, vi behandlet BG1 og MDAH2774 eggstokkreft celler med rhSTIP1 (400 nM). Behandlingen med rhSTIP1 induserte en 1,9-ganger stimulering i BrdU-inkorporering i begge eggstokkreft celler (figur 4A). Videre behandling med rhSTIP1 resultert i en økt Ki-67 farging, noe som tyder på at STIP1 induserer human eggstokkreft celleproliferasjon (figur 4B).
To eggstokkreft cellelinjer (BG1 og MDAH2774) ble behandlet med 400 nM av rhSTIP1 og analysert ved hjelp av BrdU-inkorporering (A) og Ki67-immunfarging (B). Ki67-positive celler er vist i brun farge; skala barer representerer 20 μ.
Behandlingen med rhSTIP1 betydelig stimulert eggstokkreft celle migrasjon (2,4 ganger økning i BG1 celler og 1,6 ganger økning i MDAH2774 celler, henholdsvis) (figur 5A). I overensstemmelse med de data som oppnås i transwell migrasjon assay resultatene av lukking av sår-analysen (figur 5B) analysert ved anvendelse av WimScratch programvaren indikerte en 1,8 gangers økning i den migrasjonshastigheten MDAH2774 celler behandlet med rhSTIP1 (data ikke vist).
behandlingen med rhSTIP1 fremmet celle migrasjon i henhold til resultatene av både Transwell migrasjon (A) og lukking av sår (B) analyser. Kvantitativ analyse av andelen trekkende MDAH2774 celler ved hjelp av WimScratch programvare viste at eksponering for rhSTIP1 induserte en 1,8 ganger økning i migrasjon (B). Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Viktigere, ble den observerte økning i celleproliferasjon og migrering indusert av rhSTIP1 opphevet ved samtidig behandling med anti-STIP1 antistoffer (figurene 6A og 6B). Disse resultatene ikke bare bekrefte at de observerte effektene ble indusert av STIP1, men også gi foreløpige bevis for å støtte den terapeutiske potensialet i anti-STIP1 antistoffer i eggstokkreft.
Når anti-STIP1 antistoffer (800 Nm) ble tilsatt til kreftceller tidligere eksponert for 400 nm rhSTIP1, ble celleformering (A) og migrering (B) hemmet. Data er presentert som gjennomsnitt ± standardfeil av de hjelp av tre uavhengige forsøk.
I eggstokkreft celler behandlet med rhSTIP1, siRNA knockdown av STIP1, eller anti-STIP1 antistoffer, vi også brukt MTT-analyser for å vurdere celleviabilitet som en proxy for celle nummer, med den forståelse at cellen nummeret er formet av styrkene til både celleproliferasjon og apoptose. Etter avtale med resultatene i Figur 4 og Figur 6A, behandling med rhSTIP1 signifikant (P 0,01) økte eggstokkreft celle nummer basert på MTT analysen (figur S3A), mens knockdown av STIP1 signifikant (P 0,005) trykt eggstokkreft celler (Figur S3b). I motsetning til den nøytraliserende effekt av anti-STIP1 på rhSTIP1-stimulert celleproliferasjon (figur 6A), direkte behandling av eggstokkreft celler med ulike kloner av anti-STIP1 ikke endre MTT målingene (figur S3C).
diskusjon
Denne studien viser for første gang at STIP1 er en prognostisk biomarkør i menneskelig eggstokkreft. Ifølge sine individuelle molekylære funksjoner, har biomarkører nylig blitt gruppert i følgende kategorier: karsinogenisitetsstudier biomarkører, utgitt biomarkører, respons biomarkører, og risiko biomarkører [11]. Basert på sin søknad i sykdom karakterisering, kan biomarkører også bli klassifisert som prognostiske, prediktive og risikomarkører [19]. I våre tidligere studier [9], [10], vi har demonstrert at STIP1 utskilles fra eggstokk-kreft i blodet, noe som antyder at dette molekyl kan tjene som en biomarkør utgitt av eggstokkreft. Spesielt våre nåværende funn indikerer at en høy STIP1 uttrykk er relatert til dårlig OS (figur 2, tabell 2). Og dårlig PFS priser (Tabell 2), og kan dermed representere en roman prognostisk markør
En viktig prognostisk faktor i eggstokkreft er histologisk grad (figur 2B); dessverre, kan gradering være subjektiv selv blant erfarne patologer og noen svulster ikke passer pent inn i en gitt klasse [26]. For eksempel har en betydelig inter-observatør variasjon blant patologer i gradering av brystkreft blitt rapportert [27]. For å møte dette forbeholdet, har klassifisering av brystkreft i molekyl undergrupper med karakteristiske genekspresjonssignaturer blitt foreslått som et middel for forståelsen av den molekylære basis av histologisk klasse [28]. I denne studien har vi vist at STIP1 histoscores kan være nyttig i å supplere patologen er histopatologiske gradering av eggstokkreft ved å gi objektive, kvantitative vurderinger. Spesielt kan STIP1 histoscores vise seg å være nyttig for å forutsi prognosen hos pasienter med lett cellekreft (som vanligvis ikke gradert) [3]. Våre analyser videre avdekket at, selv hos pasienter med samme svulst klasse, ble en høyere STIP1 nivå forbundet med en dårligere klinisk resultat.
Serum STIP1 nivåer ble ikke vist å signifikant forskjellig hos pasienter med 4 kliniske stadier av eggstokkreft kreft [9], men i denne studien tumor STIP1 histoscores var signifikant høyere i trinn III-IV (n = 147) enn stadiene i-II (n = 183) (tabell 1). Dette avviket kan bare forårsaket av den lille saksnummer (n = 43) i vår tidligere studie [9]. Funnene som høy STIP1 histoscores var signifikant forbundet med høye kliniske stadier (III-IV) og høy klasse (3) (tabell 1) også hevet muligheten for at høye histoscores kan være en funksjon av høy tumor karakterer og /eller høye kliniske stadier, som gjenstår å bli bevist i fremtidige studier av større saksnummer. Ikke desto mindre, tumor STIP1 histoscoring åpenbart utøver en prognostisk verdi i tillegg til de vanlig anvendte kliniske parametere (figur 3). Disse resultatene støtter kollektivt nytten av STIP1 histoscore som en prognostisk biomarkør.
Som et fosfoprotein, gjennomgår STIP1 en cdc2-kinase fosforylering, som er ledsaget av det cytoplasmatiske translokasjon av STIP1 [14]. Ekspresjonen av STIP1 i forskjellige typer av kreft [15], [29], [30], [31] antyder at dette molekylet har en anti-apoptotiske rolle og /eller fremmer celleoverlevelse kreft. Knockdown av STIP1 har vist seg å undertrykke den invasivitet av kreft i bukspyttkjertelen celler [31]. Vi har tidligere rapportert at STIP1 utskilles av eggstokkkreftceller i svulsten mikromiljøet og den systemiske sirkulasjonen [9]. Vi har også beskrevet de molekylære mekanismer som utskilte STIP1 stimulerer proliferasjonen av eggstokkreft celler [10]. Resultatene av denne undersøkelsen (figurene 4 og 5) ikke bare bekrefter rollen til STIP1 i å fremme tumorigenesis men også antyder at dette molekyl kan tjene som en prognostisk biomarkør (figurene 2 og 3, Tabell 2).
effektiv blokkering av rhSTIP1-stimulert celle-proliferasjon og migrering av ovarie-celler fremkalt av anti-STIP1-antistoffer (figur 6) viser at utskilt STIP1 fra cancervev kan være et mål for utvikling av terapeutiske antistoffer i eggstokkreft. STIP1 representerer en attraktiv kandidat for kreftbehandling. For eksempel, har en forbindelse som hindrer HSP90 fra å kommunisere med STIP1 nylig blitt utviklet og vist å forringe HSP90-avhengige reaksjonsveien folding, til syvende og sist utøver cytotoksiske effekter på brystkreftceller [32]. Dessuten har en novobiocin-avledet HSP90 C-terminal-inhibitor, KU135, vist seg å hemme proliferasjon og indusere apoptose i melanomceller [33]. Til slutt, en
in vitro
studie av Horibe et al. [34] har rapportert at en anti-TPR peptid som blokkerer interaksjonen av HSP90 med TPR2A domenet av STIP1 er i stand til å indusere celledød i pankreas, nyre, lunge, prostata, mage og kreftcellelinjer.
til tross for de inkrementelle forbedringer i kirurgi og kjemoterapi, de fleste pasienter med eggstokkreft dø av sykdommen innen fem år etter diagnose [3]. For egnede pasienter, tilsetning av målrettet terapi til kjemoterapi kan øke både sjansen for at svulsten ville svare godt til behandling samt øke varigheten at svulsten kan undertrykkes; sammen, kan dette føre til en viss forlengelse av livet. Hvis bekreftes av andre studier, våre data tyder på at STIP1 kan tjene som et lovende mål for antistoffbasert eggstokkreft terapi.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
