Abstract
Bakgrunn
Sodium butyrate, en histondeacetylase inhibitor har dukket opp som en lovende kreft narkotika for flere kreftformer. Nylige studier har indikert at natriumbutyrat kunne hemme utviklingen av prostatakreft; imidlertid er den eksakte mekanismen fortsatt uklart. Målet med denne studien var å undersøke mekanismene for natriumbutyrat handling i prostata kreft DU145 cellene.
Metoder
De hemmende effekter av NaB på cellevekst ble oppdaget av 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrrazolium bromid analysen. Celle apoptose ble bestemt ved strømningscytometrisk analyse av DU145 celler farget med annexin V og PI. Hoechst 33258 og fluorescensmikroskoper ble anvendt for å observere den kjernefysiske morfologi DU145-celler etter behandling med NaB. ANXA1 knockdown celler ble etablert gjennom transfeksjon med ANXA1 siRNA. ANXA1 mRNA-nivåer ble målt ved QRT-PCR. BCL-2, Bax, ANXA1, ERK1 /2 og pErk1 /2 ble oppdaget av western blot.
Resultater
NaB vesentlig hemmet vekst og induksjon apoptose av DU145 og PC3 celler i en dose -avhengig måte. Ekspresjon av anti-apoptose-genet Bcl-xl og Bcl-2 i DU145 cellene blir redusert og ekspresjon av det pro-apoptose-genet Bax og Bak økte etter NaB behandling. Videre studier har vist at NaB opp-regulert ekspresjon av ANXA1 og at tumorinhibering virkningen av NaB ble redusert markert gjennom knockdown av ANXA1 genet i DU145-celler. Videre siANXA1 cellene viste at økt celleproliferasjon og celle apoptose indusert ved inaktivering av ekstracellulære regulert kinase (ERK).
Konklusjon
Våre resultater støtter en signifikant korrelasjon mellom NAB funksjoner og ANXA1 uttrykk i prostatakreft, og legge til rette for ytterligere å studere den molekylære mekanismen for Nab handlinger i kreft
Citation. Mu D, Gao Z, Guo H, Zhou G, Sun B (2013) natriumbutyrat induserer vekst hemming og apoptose i human Prostate Cancer DU145 cellene ved oppregulering av Expression of Annexin A1. PLoS ONE 8 (9): e74922. doi: 10,1371 /journal.pone.0074922
Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 9 april 2013; Godkjent: 06.08.2013; Publisert: 23.09.2013
Copyright: © 2013 Mu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er en relativt vanlig ondartet kreft og andre hyppigst diagnostisert kreft hos menn [1]. Nylig, kan flere effektive behandlinger tilbys for klinisk behandling av prostatakreft; slik som kirurgi (radikal prostatektomi) og strålebehandling (ekstern-bjelke radioterapi, brakyterapi, eller begge deler) for pasienter med tidlig stadium sykdom og adjuvant systemiske behandlinger (kjemoterapi), som er effektive for avansert stadium sykdommen [2]; Imidlertid terapier alle har forskjellige sideeffekt profiler. Natriumbutyrat, en av de mest studerte histondeacetylase inhibitorer, har dukket opp som et lovende anticancer medikament ved å endre genekspresjon gjennom kromatin modifisering [3].
natriumbutyrat, natriumsaltet av smørsyre, er blitt rapportert å ha et bredt spekter av virkninger på dyrkede pattedyrceller, for eksempel induksjon av differensiering og hemming av celleproliferasjon, ved forholdsvis lave konsentrasjoner [4], [5]. Videre er det en mengde bevis som viser at natriumbutyrat kunne indusere apoptose i en rekke kreftceller [6], [7]. På grunn av sin vekst-inhiberende og apoptose-induserende aktivitet, natriumbutyrat, alene eller i kombinasjon med andre anti-kreft medikamenter, kan brukes til å behandle en rekke av ondartede svulster [8], [9]. Nylig, Degui Wang og kolleger vist at natriumbutyrat kan hemme formeringen av humane prostatacancercellelinjer og har en synergistisk effekt med anticancer legemidler for behandling av prostata cancer både
in vitro
og
in vivo
[10]. Den kliniske nytten av natriumbutyrat begrenset av virkningsmekanismen, som fortsatt er uklart. Et viktig nytt fremskritt har vært at natriumbutyrat har blitt funnet å oppregulerer ekspresjonen av annexin A1 (ANXA1) i humane tykktarm adenokarsinomceller [11].
Annexins er en familie av fosfolipid og kalsiumbindende proteiner hvilken består av 12 medlemmer i pattedyr. Annexins er allestedsnærværende og uttrykkes i en rekke forskjellige organismer, [12]. Det finnes bevis på at annexin familiemedlemmer har viktige roller i tumorutvikling og progresjon fordi disse proteinene kan påvirke invasivitet og spredning av kreftceller og vise feilregulering i en rekke kreftformer [13]. ANXA1, den første medlem av familien av annexins, er et intracellulært protein som spiller viktige roller i apoptose, proliferasjon, og kreft [14], [15]. En stor del av striden fortsatt eksisterer om uttrykk for ANXA1 i ulike typer kreft. Flere studier har vist at uttrykket av ANXA1 er nedregulert i cervical, bryst, hode og nakke, eller skjoldbruskkjertelkreft [16], [17], [18], [19], [20]. På den annen side er det også noen bevis på at en økning av ANXA1 uttrykk har funnet sted i andre typer av kreft, slik som bukspyttkjertelen, spiserøret, og gastrisk karsinom [21], [22], [23]. Det er en mangel på tilstrekkelig funksjonelle eksperimentelle bevis tydelig definere rollen annexins i prostatakreft. Flere nyere studier har indikert at annexin II ble redusert i prostata cancer og annexins A1 og A2 har allerede blitt assosiert med tumor suppresjon i prostata kreft [24]. Lecona og kolleger vist at butyrat kunne oppregulerer ekspresjonen av ANXA1 i humane tykktarm adenokarsinomceller [11]. Disse studiene markere mulige rolle natriumbutyrat som ANXA1 regulator for å hemme utviklingen av prostatakreft. Studien gir den første direkte bevis i prostatakreftceller som natriumbutyrat kan opp-regulerer uttrykket av ANXA1 fører til celle apoptose. Vi viser at natriumbutyrat hemmer cellevekst og induserer celle apoptose i prostatakreftceller med opp-regulerer uttrykket av ANXA1 gjennom ERK signalveien.
Materialer og metoder
Antistoffer
mus anti-Bcl-2 monoklonalt antistoff, mus anti-Bax monoklonalt antistoff, mus anti-Bcl-xl monoklonalt antistoff, mus anti-Bak monoklonalt antistoff, mus anti-ANXA1 monoklonalt antistoff og mus anti-β-actin monoklonalt antistoff var oppnådd fra Abcam (Cambridge, MA). Anti-fosfor-ERK (perk) monoklonalt antistoff, anti-ERK polyklonale antistoff og HRP-konjugert geit anti-mus IgG ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California).
Cell Culture
human prostatacancer cellelinje DU145-celler (HTB-4, ATCC, Rockville, MD) og PC3-celler (ATCC, Rockville, MD) ble dyrket ved 37 ° C under en fuktig atmosfære med 5% CO
2 og 95% luft og ble dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 1% penicillin-streptomycin, 1% glutamin.
celle~~POS=TRUNC assay
celle~~POS=TRUNC ble bestemt ved trypanblått eksklusjon assay, som beskrevet tidligere med mindre modifikasjoner [25]. Kort sagt ble DU145 og PC3-celler sådd ut hver for seg i 24-brønners plater ved 2 x 10
5-celler per brønn, dyrket i RPMI 1640-medium i 24 timer og deretter tilsatt til forskjellige konsentrasjoner av NaB til en endelig konsentrasjon på 0, 1 , 5, og 10 mmol. Bare dimetylsulfoksyd (DMSO) ble tilsatt til kontrollgruppen. Celler ble dyrket i en inkubator i forskjellige perioder. Cellesuspensjoner (10 ul) i PBS ble blandet med 40 ul trypanblått (Sigma, St. Louis, MO). Cellene ble deretter vasket tre ganger med DMSO før telling under et lysmikroskop. Celler som viser farveopptaks ble klassifisert som ikke-levedyktig.
MTT Proliferation Assay
DU145 og PC3 celleproliferasjon ble målt ved bruk av den tidligere beskrevne 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2 , 5-diphenyltetrrazolium-bromid (MTT) analyse [26]. I korthet, DU145 og PC3-celler (ca. 2 x 10
5) ble sådd separat i 24-brønners plater i 48 timer. MTT (20 ul, 5 mg /ml) ble deretter tilsatt til DU145 og PC3 kreftceller i 4 timer ved 37 ° C. DMSO (200 ul) ble tilsatt for å oppløse krystallene i 25 minutter ved romtemperatur. Den optiske tetthet (OD) verdi ble målt ved en bølgelengde på 490 nm med et spektrofotometer (Multiskan MK3, Thermo, Waltham, MA). Alle forsøkene ble utført minst tre ganger og ble beregnet under anvendelse gjennomsnittlige resultater.
Påvisning av apoptotiske celler ved strømningscytometri
Cellen apoptotiske-forholdet ble målt med annexin V-FITC og PI farging etterfulgt av analyse med flowcytometri (Beckman-Coulter, Brea, California). I korthet, 2 x 10
5 celler per brønn ble sådd ut i 24-brønners plater og deretter forskjellige konsentrasjoner av NaB ble tilsatt. Cellene ble trypsinert og høstet ved sentrifugering og deretter inkubert med Annexin V og PI i 15 minutter ved romtemperatur. Apoptose ble undersøkt ved hjelp av strømningscytometri ved bruk av Annexin V-FITC /PI kit (BD PharMingen, San Diego, CA). Etter 30 minutter ved 37 ° C cellene var klar for analyse av flowcytometri og cellen apoptotiske forholdet ble bestemt.
Nuclear Morfologisk Observasjon av NaB Behandlet DU145 kreftceller
Celler ble belagt i 24-brønners plater ved 2 x 10
4 celler per brønn og behandlet med NaB ved forskjellige konsentrasjoner. Celler ble fiksert ved anvendelse av 10% bufret formalin /4% formaldehyd, og ble deretter vasket to ganger med PBS og farget med Hoechst 33258 fargeløsning. Atom morfologi av DU145 cellene ble observert av reflektert fluorescens mikroskop (Nikon MF30 LED, Japan). Kvantifisering av apoptotiske celler ble utført ved å telle 500 DU145-celler, og deretter bestemme andelen av apoptotiske celler i minst fem tverrsnitt pr lysbilde. Forsøket ble gjentatt minst tre ganger.
kvantitativ real-time -PCR (QRT-PCR) Analyse
ANXA1
mRNA nivåene ble målt i prostatakreftcellelinjer DU145 bruke QRT-PCR-metoden. Total cellulær RNA ble isolert fra celler ved hjelp DU145 Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge produsentens protokoll. 2 mikrogram av total RNA ble utsatt for revers transkripsjon ved å bruke en høy kapasitet RNA til cDNA Kit (Applied Biosystems) i henhold til produsentens instruksjoner. QRT-PCR ble utført i en BioRad MyIQ ensfarget real-time PCR deteksjon system som bruker SYBR Grønn Supermix (BioRad, Carlsbad, California). Primersekvensene som brukes til QRT-PCR var som følger:
ANXA1
fremover, GAGCCCCTATCCTACCT TCA;
ANXA1
omvendt, GGTTGCTTCATCCACACCT;
ACTIN
fremover, TCCCTGGAGAAGAGCTACGA;
ACTIN
omvendt, AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG. Disse primere ble alle syntetisert av Sangon Biotech Co., Ltd (Shanghai, Kina). Sykkelforholdene var som følger: pre-inkubering: 95 ° C, 10 min; PCR: 94 ° C, 10 s og 60 ° C, 30 s, 45 sykluser; endelig forlengelse: 72 ° C, 10 min. Expression nivåer av de relative gener ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCT metoden [27] og med β-actin mRNA som en intern kontroll.
Western Blot analysen
Den totale protein av DU145 cellene ble hentet ved hjelp RIPA lysebuffer (Beyotime, Nantong, Kina) i henhold til driftsprotokoller. Proteinkonsentrasjonen i lysatene ble bestemt ved BCA-proteinanalysesett (Beyotime, Nantong, Kina). De proteiner (40 ug /spor) ble underlagt 10% SDS-PAGE og elektroforetisk overført til Immobilon P Millipore (Bedford, MA, USA). Mus monoklonale og polyklonale antistoffer ble anvendt som det primære antistoff og HRP-konjugert geit-anti-mus-IgG ble brukt som det sekundære antistoff. De bundne antistoffer ble visualisert ved anvendelse LumiGLo reagens (Pierce, Rockford, IL), og nivåene av proteinene i forhold til p-actin ble bestemt. Alle forsøkene ble gjentas minst tre ganger.
Små interfering RNA Transfeksjon
prostatakreft DU145 celler med ANXA1 protein ble transfektert med ANXA1 siRNA (siANXA10) eller kontroll siRNA (siMock) ( Takara, Dalian, Kina) under anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) i henhold til metoden ifølge Maxime [28], med mindre modifikasjoner. I korthet, en dag før transfeksjon, 2 x 10
5 prostata kreft celler ble sådd på en 60 mm plater i RPMI 1640 inneholdende 5% FCS. I alt ble 1,5 ug av plasmid-DNA transfektert inn i DU145 celler for RNA og protein utvinning. Stabile transfektanter av DU145-celler ble valgt med dyrkingsmediet inneholdende puromycin (Invitrogen, Carlsbad, CA). De levedyktige kolonier ble plukket opp og overført til nye retter etter 2 til 3 uker etter transfeksjon. De siANXA1 målsekvenser var: 5′-ATGCCTCACAG- CTATCGTGAA-3 «(sense), og 5′-TTCACGATAGCTGTGAGGCAT-3» (anti-sense). SiANXA1-transfekterte og siMock-transfekterte celler ble brukt for videre eksperimenter.
Statistical Analysis
Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). Forskjellene mellom kontroll og NaB behandlede grupper ble sammenlignet med Dunnetts test etter at ANOVA. En verdi på P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle forsøkene ble gjentas minst tre ganger.
Resultater
NaB hemmer spredning og celle overlevelse i DU145 Cells
Den cytotoksiske effekten av NaB på menneskelig prostatakreft DU145 og PC3 celler ble undersøkt med varierende konsentrasjoner av NaB og tider ved trypanblått eksklusjon assay (fig. 1 A og C). Resultatene viste at levedyktigheten til DU145 og PC3-celler ble alle redusert med NaB i en dose- og tidsavhengig måte. NAB induserte en tydelig reduksjon i antallet levedyktige vertsceller doseavhengig måte med en IC50 på 7,07 mmol /l
etter 48 timer i DU145-celler og IC
50 til 8,71 mmol /L etter 48 timer i PC3-celler . En doseområdet 0-10 mmol NaB behandling av prostata kreft DU145 celler og PC3 for 48 timer er vår forventet konsentrasjon og tid.
(A) NaB hemmer celle levedyktighet i et tids- og doseavhengig måte i DU145 celler. Kreftceller ble behandlet med medium alene eller i forskjellige konsentrasjoner av NaB (1, 5, 10 mmol) i forskjellige tids (12, 24, 48, 72, 96 og 120 timer). (B) Effekt av NaB på DU145 celleproliferasjon. Kreftceller ble behandlet med medium alene eller i forskjellige konsentrasjoner av NaB (1, 5, 10 mmol) i 48 timer. (C) NaB inhiberer cellelevedyktighet i PC3-celler. Kreftceller ble behandlet med medium alene eller i forskjellige konsentrasjoner av NaB (1, 5, 10 mmol) i forskjellige tids (12, 24, 48, 72, 96 og 120 timer). (D) Virkning av NaB på PC3 celleproliferasjon. Kreftceller ble behandlet med medium alene eller i forskjellige konsentrasjoner av NaB (1, 5, 10 mmol) i 48 timer. (E) Effekt av NaB i kombinasjon med DOC på cellelevedyktigheten til DU145 og PC3-celler. Kreftceller ble behandlet med medium alene eller NaB (5 mmol) i kombinasjon med DOC (1 umol) i 48 timer. (F) Effekt av NaB i kombinasjon med DOC på DU145 og PC3 celleproliferasjon. Kreftceller ble behandlet med medium alene eller NaB (5 mmol) i kombinasjon med DOC (1 umol) i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved trypanblått eksklusjon assay. Celleproliferasjon ble påvist ved MTT-analyse. NaB betydelig hemmet veksten av DU145 og PC3 celler. Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger. Dataene er midler ± SEM. (N = 3) (Dunnetts test, * P. 0,05
vs
kontroll)
Vi har også målt effekten av NaB på DU145 og PC3 celleproliferasjon ved MTT-analyse.. Som vist på fig. 1B og D, var en drastisk reduksjon i proliferasjon av celler med økende doser av NaB (0-10 mmol). NAB inhiberte celleproliferasjon doseavhengig både DU145 og PC3-celler (fig. 1B og D). Disse observasjoner tyder på at NaB kan inhibere proliferasjon og overlevelse av DU145 og PC3-celler, men er DU145 mer følsom for NaB behandling.
Det er bevis på at NaB i kombinasjon med andre anticancermidler, kan være meget nyttig i blæren -kreft [10]. Derfor undersøkte vi effekten av NaB i kombinasjon med docetaxel (DOC) på prostatakreftceller. Resultatene viste at det er en synergistisk inhibering av human prostatacancer celleveksten med NaB og DOC (fig. 1E). For ytterligere å bekrefte den synergistiske virkning av vekstinhibering NaB ble celleformering detektert ved MTT-analyse. Som vist på fig. 1F, NaB kombinert med DOC kunne signifikant hemmer celledeling.
NaB induserer apoptose i DU145 cellelinjer
induksjon av apoptose ved NaB ble først undersøkt av flowcytometrisk analyse av DU145 celler farget med annexin V og PI (fig. 2A). Resultatene viste at NaB forårsaket en doseavhengig økning i celle apoptose, og apoptose hastigheten økes til 30% når konsentrasjonen av NaB var over 5 mmol /l.
(A) Strømningscytometri-analyse av NaB behandlede DU145 cellene farget med annexin V og PI. (B) Nuclear morfologiske observasjoner av NaB behandlet DU145 kreftceller. Hoechst 33258 og et fluorescens-mikroskop ble brukt for å observere den kjernefysiske morfologi DU145-celler etter behandling med NaB (400 x). (C) Kvantitativ analyse av hastigheten av apoptose celle. (D) NaB modulerer uttrykk for BCL-XL og Bak i DU145 cellene. (E) NaB modulerer ekspresjon av Bcl-2 og Bax i DU145-celler. Ekspresjonen av Bcl-xl, Bcl-2, ble Bax og Bak bestemt ved western blot-analyse. Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger. Dataene er midler ± SEM. (N = 3) (Dunnetts test, * P 0,05
vs
kontroll.)
neste kvantifisert endringene i cellekjernefysisk morfologi av Hoechst farging henhold fluorescens mikroskopi.. Som vist på fig. 2B, kreftcellene viste fluorescent kjerner blebbing og DNA-fragmentering, sammenlignet med kontroll DU145 celler etter behandling med NaB i 48 timer. Dessuten ble antallet av apoptotiske celler i en øket NaB doseavhengig måte (fig. 2C). Samtidig ble celletettheten ble redusert på en doseavhengig måte. Disse forandringene er i samsvar med egenskapene til apoptose
celle apoptose ser ut til å bli styrt av en rekke gener.;
BCL-xl, BCL-2
,
Bax og Bak
er de viktigste apoptose relaterte gener blant dem. BCL-XL og BCL-2 protein er to celledød hemmere, mens Bax og Bak har en avgjørende rolle i å tilrettelegge apoptose. Således har vi målt ekspresjonen av Bcl-xl, Bcl-2, Bax og Bak proteiner i DU145 celler ved western blot etter behandling med NaB (fig. 2D og E). Resultatene viste at ekspresjon av Bcl-xl og Bcl-2, ble redusert og ekspresjon av Bax og Bak ble samtidig oppregulert. Den apoptose Hastigheten ble betydelig økt på grunn av oppregulering av pro-apoptose gener.
NaB Up-regulerer uttrykket av ANXA1 i Prostate Cancer DU145 cellelinje
De ovennevnte resultatene indikerte at NaB kan hemme spredning og indusert apoptose i prostatakreftceller; Imidlertid er virkningsmekanismen NaB handlingen fortsatt uklart. Lecona og kolleger foreslo at smørsyre kan opp-regulerer uttrykket av annexin A1 i menneskelige kolon adenokarcinomceller. Derfor vi spurte om det var noen sammenheng mellom NaB og ANXA1. Ekspresjonen av ANXA1 og oppregulering av ANXA1 ved NaB i DU145-celler ble bestemt ved RT-PCR og western blot, henholdsvis (fig. 3). Som vist på fig. 3, ble økt ANXA1 mRNA-nivåer og protein ekspresjon detektert i DU145 celler behandlet med NaB. Resultatene viste at NaB kunne oppregulerer ekspresjonen av ANXA1 i DU145-celler.
(A) ANXA1 mRNA-ekspresjon detektert av QRT-PCR. NAB behandlingsgruppene betydelig høyere enn kontrollgruppen (behandling av medium only). (B) Western blot-analyse av ANXA1 ekspresjon i DU145 celler etter NaB behandling. Dataene er normalisert med p-aktin verdier og er uttrykt som fold endringer av β-actin i NaB behandlede gruppen i forhold til kontroll. Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger. Dataene er midler ± SEM. (N = 3) (Dunnetts test, * P. 0,05
vs
kontroll).
Etablering og funksjonelle Analyser av ANXA1 Knockdown Cells
Siden ANXA1 uttrykket var oppregulert i DU145 celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av NaB, antok vi at ANXA1 kan spille en betydelig rolle i aktiviteten av NaB. For å måle ANXA1 funksjoner
in vitro,
en siRNA eksperiment ble utført i DU145 cellene. MRNA-nivået, og protein ANXA1 i siANXA1-transfekterte gruppe var betydelig lavere enn den siMock transfekterte gruppen (fig. 4A). Vi neste undersøkt effekten av ANXA1 knockdown på aktiviteten av NaB, inkludert hemming av cellevekst (MTT analyse) og induksjon av celle apoptose (western blot analyse). Resultatene viste at det var en økning i cellulær vekst av siANXA1-transfekterte gruppen sammenlignet med den siMock-transfekterte gruppe (Fig. 4B). Videre ble apoptose sank i siANXA1-transfekterte celler (Fig. 4C). Resultatene indikerte at den NaB aktiviteten av veksthemming og pro-apoptose i kreftceller DU145 var forbundet med overekspresjon av ANXA1.
(A) Western blot-analyse av ANXA1 ekspresjon i siANXA1 og siMock celler etter NaB behandling. Data ble normalisert med p-aktin-verdier og er uttrykt som gangers endring av β-actin i NaB behandlede gruppe i forhold til kontroll. (B) Spredning av siANXA1 og siMock celler etter NaB behandling. (C) Western blot analyse av ekspresjonen av Bax og Bcl-2 i siANXA1 og siMock celler. BCL-2 og Bax uttrykk nivåer ble normalisert til p-aktin og presenteres som forholdet Bax /BCL-2. Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger. Dataene er midler ± SEM. (N = 3) (Dunnetts test, * P 0,05
vs
kontroll.)
Over-uttrykk for ANXA1 er direkte relatert til aktivering av ERK
ERK-reaksjonsveien er ofte oppregulert i en rekke kreftformer [29], [30], og det er noe bevis viste at ANXA1 modulerer ERK-reaksjonsveien ved et proksimalt område [31]. For ytterligere å undersøke en mulig mekanisme som kan være involvert i veksthemming og pro-apoptose i kreftceller, ble ekspresjonen av ERK og fosforylert ERK (Perk) detektert. Perk ble betydelig redusert i siANXA1-transfekterte celler sammenlignet med siMock gruppe. Resultatene viste at ERK-reaksjonsveien ble svekket i siANXA1-transfekterte celler (Fig. 5).
ekspresjon av p-ERK og ERK detekteres ved Western blot-analyse. Ekspresjonen av p-ERK blir markert redusert i ANXA1 knockdown-celler sammenlignet med de siMock celler, mens det ERK-nivå er tilnærmet uendret. Dataene er normalisert med p-aktin-verdier og er uttrykt som gangers endring av β-aktin. Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger. Dataene er midler ± SEM. (N = 3) (Dunnetts test, * P 0,05
vs
kontroll.)
Diskusjoner
Prostatakreft er den nest vanligste diagnosen kreft og. den nest største årsaken til kreft dødsfall blant menn. Foreløpig kan flere effektive stråling og kirurgisk behandling skal tilbys for klinisk behandling av prostatakreft; Men behandling for prostatakreft er langt fra tilfredsstillende og avansert prostatakreft er fortsatt uhelbredelig [9]. Det er et presserende behov for å finne stoffer eller medikamenter som er egnet for forebygging og bedre kontroll av prostatakreft. NaB, et medlem av gruppen av histondeacetylase inhibitorer (HDACs), er et naturlig forekommende kortkjedet fettsyre som er i stand til å initiere differensiering av mange celletyper, så som HT29 humane tarmkreftceller og magekreftceller [32], [33]. NaB kunne øke antitumor-aktivitet med lavere toksisitet, og det finnes flere bevislinjer som har demonstrert at NaB kan indusere veksthemming og apoptose i en rekke kreftformer, inkludert prostata cancer [5], [6], [9]. Imidlertid er den nøyaktige mekanisme for NaB i tumorgenese dårlig forstått.
Det er nå vel etablert at NaB kan oppregulerer ekspresjonen av ANXA1. Videre er annexins ofte dysregulerte i ulike krefttyper og deres uttrykk har indikert en tumor suppressor eller mulig homeostatic rolle [34], [35]. Dermed antok vi at NaB hemmet celledeling og apoptose gjennom oppregulert uttrykk for ANXA1.
I denne studien har vi evaluert spredning hemming og apoptose fremmende virkninger av NaB i menneskelig prostata kreft DU145 cellene , sammen med sin virkningsmekanisme. Våre undersøkelser viste at NaB på 1-10 mmol kan både hemme DU145 celleproliferasjon og indusere celle apoptose. Apoptose, som også er kjent som programmert celledød, er en fysiologisk prosess som reguleres av en rekke godt karakterisert gener og er viktig for utvikling og homeostase av mange organismer. I denne studien fant vi at NaB kan nedregulerer BCL-2 uttrykk og up-regulere Bax uttrykk. Det er sannsynlig at NaB induserer prostatakreft DU145 celle apoptose ved å hemme BCL-2 uttrykk og aktivering Bax.
Samtidig observerte vi at NaB oppregulert uttrykk for ANXA1 i DU145 cellene. For å avgjøre om ANXA1 funksjonen er relevant å fakke handling, vi utførte funksjonelle studier ved hjelp av siRNA. Resultatene viste at inhibering av ekspresjonen av ANXA1 signifikant redusert NaB til å hemme cellevekst og pro-apoptose. Videre våre resultater antydet at mekanismen for NaB mot apoptose gjennom oppregulering av ANXA1 var relatert til ERK-signalreaksjonsveien. Inhibering av ekspresjonen av ANXA1 kunne hemme fosforyleringen av ERK1 /2, noe som indikerer at ekspresjon av ANXA1 kunne aktivere ERK-reaksjonsveien signal. Hittil uttrykk for ANXA1 blir oppregulert ved NaB i prostatakreft har ikke blitt bekreftet. I vår studie har vi gitt noe bevis på at NAB opp-regulerer uttrykket av ANXA1 og er korrelert med utviklingen av prostatakreft. Disse fakta sterkt antyder at ANXA1 har en viktig rolle i sykdomsprogresjon.
Som konklusjon oppviser NaB anti-proliferativ og pro-apoptotiske aktivitet på en doseavhengig måte i humane prostatacancerceller. Videre kan NaB øke ekspresjonen av ANXA1, og ANXA1 kan øke aktiviteten av ERK signalveien. Videre studier er nødvendig for å avdekke konkrete interaksjoner av ANXA1 og ERK signalveien. De foreliggende funn antyder at NaB er spesielt effektiv til å inhibere progresjonen av prostatacancer via oppregulering av ekspresjonen av ANXA1.
