Abstract
Foreløpig behandling for eggstokkreft innebærer cytoreduserende kirurgi etterfulgt av kjemoterapi, hovedsakelig, carboplatin kombinert med paclitaxel. Selv om dette regimet er innledningsvis effektiv i en høy prosentandel av tilfellene, dessverre i løpet av noen få måneder etter innledende behandling skjer tumor tilbakefall på grunn av platina-resistens. Dette skyldes chemo-motstand av kreft stamceller (cscs). Heri vi viser for første gang at withaferin A (WFA), en bioaktive stoffet isolert fra anlegget Withania somnifera, når det brukes alene eller i kombinasjon med cisplatin (CIS) er rettet mot antatte cscs. Behandling av nakne mus som bærer ortotopiske ovarietumorer genereres ved å injisere humane ovarie epitelial cancer cellelinje (A2780) med WFA og cisplatin (WFA) alene eller i kombinasjon resulterte i en 70 til 80% reduksjon i tumorvekst og fullstendig inhibering av metastasering til andre organer sammenlignet med ubehandlede kontroller. Histokjemisk og Western blot analyse av svulstene viste at inkludering av WFA (2 mg /kg) resulterte i en svært signifikant eliminering av celler som uttrykker CSC markører – CD44, CD24, CD34, CD117 og Oct4 og nedregulering av Notch1, Hes1 og Hey1 gener. I motsetning til behandling av mus med CIS alene (6 mg /kg) hadde motsatt effekt på disse cellene. Økning i celler som uttrykker CSC markører og Notch1 signalveien i svulster utsatt for CIS kan forklare tilbakefall av kreft hos pasienter behandlet med carboplatin og paclitaxel. Siden, WFA alene eller i kombinasjon med CIS eliminerer mulige cscs, konkluderer vi med at WFA i kombinasjon med CIS kan presentere mer effektiv behandling for eggstokkreft
Citation. Kakar SS, Ratajczak MZ, Powell KS, Moghadamfalahi M, Miller DM, Batra SK, et al. (2014) Withaferin A alene og i kombinasjon med cisplatin undertrykker vekst og metastasering av eggstokkreft ved Targeting Antatte kreftstamceller. PLoS ONE ni (9): e107596. doi: 10,1371 /journal.pone.0107596
Redaktør: Deodutta Roy, Florida International University, USA
mottatt: 16 juli 2014; Godkjent: 05.08.2014; Publisert: 29.09.2014
Copyright: © 2014 Kakar et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Jeg bekrefter at alle data som ligger til grunn funnene i min studie er fritt tilgjengelig i manuskriptet
Finansiering:. NIH /NCI CA124630, James Graham Brown kreftsenter forskningsmidler, School of Medicine grunnforskningsprogram stipend. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Medforfatter Surinder Batra er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
ovarialcancer (EOC) er fortsatt den ledende dødsårsaken hos kvinner mellom gynekologisk kreft og er den femte høyeste årsaken til kreft dødsfall hos kvinner i USA [1], [2]. Flertallet av eggstokkreft er diagnostisert i avansert stadium på grunn av de hovedsakelig ikke-spesifikke symptomer. For tiden er den behandling for kreft i eggstokkene innebærer cytoreduktiv kirurgi etterfulgt av kjemoterapi, ved anvendelse av hovedsakelig platina /taxan kombinasjon [3]. Selv om dette regimet er innledningsvis effektiv i en høy prosentdel av tilfellene (70 til 80%), dessverre 70% av kvinner utvikler tilbakevendende kreft i løpet av noen få måneder etter første behandling som et resultat av platina-motstands [4], [5]. I tillegg er cisplatin (CIS) forbundet med flere alvorlige bivirkninger som kvalme, oppkast, myelosuppresjon, hepatotoksisitet, nevrotoksisitet, nyretoksisitet og ototoxicity [4], [6] – [9]. Derfor trenger for nye behandlingsalternativer som er rettet mot kreftceller og særlig mulige kreftstamceller er obligatorisk enten ved førstelinje innstilling eller enda mer på første- og andrelinjeledelsen av tilbakevendende eggstokkreft.
I våre tidligere studier [10], viste vi for første gang at withaferin A (WFA), en bioaktiv forbindelse isolert fra planten Withania somnifera, når de anvendes alene eller i kombinasjon med CIS hadde en tids- og doseavhengig synergistisk effekt på inhibering av celleproliferasjon og induksjon av celledød, noe som reduserer nødvendig dose av cisplatin. Vi har også vist at mens WFA oppnår sin antitumor virkning ved generering av ROS som fører til DNA-skade, CIS oppnår sin effekt skjønt direkte binding til DNA som forårsaker dannelsen av DNA-addukter. Kombinasjonsbehandling resulterte også i en betydelig forbedring av reaktive oksygenforbindelser (ROS) produksjon og DNA-skader.
WFA har vært en del av indisk tradisjonell medisin i århundrer. Den er tilgjengelig i over-the-counter som kosttilskudd, og er kjent for å behandle ulike lidelser på grunn av sin anti-inflammatorisk [11], [12], anti-bakterielle [13], og cardio beskyttende egenskaper [14]. I de senere år har WFA blitt foreslått som en potensiell anti-kreft-forbindelse vist å forebygge tumorvekst, angiogenese, metastase og [15], [16] i forskjellige typer av kreft [17] – [26]. Mekanismer som WFA når sine anticancer aktivitet inkluderer inaktivering av Akt og NF-kB [27] for å oppnå apoptose, reduksjon i pro-overlevelse protein Bcl-2 [28], G2 /M cellesyklus arrest [29], [30], generering av reaktive oksygenarter (ROS) [31], [32], induksjon av Par-4 [17], aktivering av kaspase 3 og 9 aktiviteter, DNA-skade [10], inhibering av HSP90 [20], regulering av FOXO3a og Bim [15] hemming av Notch-1 [33] og nedregulering av uttrykk for HPV E6 og E7 teinene [19].
Utvikling av resistens og tilbakefall av eggstokkreft har vært et stort klinisk problem. Et antall mekanismer som induserer resistens er blitt foreslått. I løpet av de siste årene har det vært økende bevis for at «kreft stamceller (cscs)», er den viktigste årsaken til tumorprogresjon, cellegift-motstand og tilbakefall etter første behandling [34], [35]. Første bevis for eksistensen av kreft stamceller kom i år 1997, med identifisering av leukemi stamceller [36], [37]. I året 2003, Al-Hajj et al. [38] eksperimentelt påvist den hierarkiske stamcelle opprinnelse i brystkreft. Men inntil nylig eksistensen av antatte kreft stamceller i faste tumorer hadde vært kontroversiell [39]. I nyere studier med murine modeller for hjernen, huden og tarmsvulster, har tre uavhengige grupper gitt overbevisende bevis for eksistensen av cscs i tumorer og deres rolle i svulstvekst [40] – [42]. Følgelig cscs innen tumormasse undergå selvfornyelse og gi opphav til heterogene kreft linjene som utgjør tumorvev. Cscs renset i henhold til noen overflatemarkører er i stand til å danne svulster når de injiseres i nakne mus [36], [43], [44]. Siden, er eggstokkreft svært heterogen; forskjellige celleoverflatemarkører har blitt rapportert for mulige eggstokkene cscs. Hyppigst rapportert inkluderer CD24, CD34, CD44, CD133, CD117, ALDH1, Oct4, MyD88 og EpCAM [45] – [53]. Siden er cscs anses å være store aktører som er ansvarlige for å utvikle resistens og dermed fører til kreft tilbakefall [52], [53], målretting cscs og hemmer deres selvfornyelse vil føre til reduksjon av kreft vekst [33].
i vår nåværende studie, viser vi for første gang at WFA alene eller i kombinasjon med CIS hvis ansatt for å behandle mus med menneske ortotopiske ovarietumorer ikke bare undertrykker tumorvekst, men er rettet mot celler som uttrykker CSC markører samt hemmer Notch1 og dens nedstrøms signal gener (Hes1 og Hey1) som har blitt rapportert til å spille en avgjørende rolle i selvfornyelse og vedlikehold av cscs (33).
Materiale og metode
Cell linje og cellekultur
Ovarian epitelisk kreft cellelinje A2780 ble opprinnelig oppnådd fra Denise Connolly (Fox Chase Cancer Center) og ble opprettholdt i RPMI 1640-medium inneholdende insulin og supplert med penicillin /streptomycin (100 IU /ml og 100 ug /ml) og 10% føtalt bovint serum (FCS) (Hyclone, Atlanta, GA) som tidligere beskrevet [10].
cellemigrering Boyden kammer assays
Cell migrering in vitro ble undersøkt ved bestemmelse av evnen celler til å migrere gjennom en syntetisk basalmembran. Prosedyren som ble benyttet var som tidligere beskrevet [54]. Kort sagt ble polykarbonatfiltere (8 um) som er lagt inn i modifisert Boyden kammer. A2780 celler i log fase ble trypsinert og belagt i 6 brønner plater. Etter 24 timer med plating ble cellene behandlet med WFA og CIS både alene og i kombinasjon, som tidligere beskrevet [10]. Etter 24 timers behandling ble cellene trypsinisert og oppslemmet i serumfritt medium. Totalt 2 × 10
5 celler ble overført til toppen kammeret. Mediet inneholdende 5% FBS ble tilsatt til det nedre kammer. Cellene ble inkubert ved 37 ° C i 24 timer og tillates å migrere gjennom membranen. Non-migrerte celler ble fjernet med en ren bomullspinne. Migrerte celler på andre siden av membranen ble farget med krystallfiolett og tellet i tre forskjellige feltene under Olympus mikroskop. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger. De representerte verdier er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter.
Generation of ortotopiske ovarian tumorer i nakne mus og behandling med WFA og CIS både alene og i kombinasjon
ortotopisk ovarietumorer ble samlet ved injisering av eggstokkreft cellelinje A2780 direkte inn i eggstokk, som beskrevet av Nunez Cruz et al. [55]. I korthet, A2780 (1 x 10
6) celler ble injisert direkte inn i venstre eggstokk fra 5 til 6 uker gamle nu /nu hunn-mus (Jackson Laboratory) under aseptiske betingelser og under lett anestesi. Etter 10 dager etter celleinjeksjon ble musene behandlet med 1) bærerkontrollen (10% DMSO og 90% glyceryl trioctanoate), 2) WFA 2 mg /kg, 3), CIS 6 mg /kg, og 4) WFA 2 mg /kg pluss SUS 6 mg /kg. Fem dyr tilfeldig ble inkludert i hver gruppe. CIS i saltvann ble injisert intraperitonealt en gang i uken, mens WFA ble injisert i.p. annenhver dag. Etter 4 ukers behandling, ble dyrene avlivet; tumor og andre vev så som un-injisert ovarie, lunge, nyre, lever, binyre og hjerte ble tatt fra hver mus. Tumorer ble vektet på tidspunktet for innsamling. De tumorer og andre vev ble delt i to deler, en del ble hurtigfrosset, og den andre delen ble fiksert i 10% bufret formalin. Dyrenes Forsøkene ble godkjent av University of Louisville, Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) (protokoll # 12063).
Formalin fast tumor og vev ble behandlet og i parafin ved hjelp av standard protokoller som beskrevet tidligere [56]. Fem mikrometer tykke seksjoner av den innebygde tumorer og vev ble utarbeidet og farget med Hematoxylin og eosin (H E). Seksjoner i tre paralleller ble undersøkt under mikroskop og fotograferte. Histopatholoigcal analyse av seksjonene ble utført av en utdannet patolog Dr. Mana Moghadamfalahi.
Immunohistochemistry
formalinfiksert parafin innebygde vev ble deparaffinized i xylen og rehydrert i en fallende gradert serie av etanol som beskrevet tidligere [ ,,,0],56]. Snittene ble oppvarmet ved 95 ° C i 10 mM natriumcitrat (pH 6,0) i 20 minutter, avkjølt til værelsestemperatur og deretter skylt i PBS. Seksjoner ble inkubert med 0,3% hydrogenperoksid i metanol i 10 min ved romtemperatur for å slukke endogen peroksidase etterfulgt av to skyllinger i PBS (5 min hver), og ble blokkert med normalt geiteserum ved anvendelse av reagenser fra ABC kit fra Vector Laboratories i 60 min ved romtemperatur følge instruksjonene fra leverandøren. Den blokkerende oppløsning ble fjernet ved drenering og snittene ble inkubert med spesifikt antistoff med passende fortynning i henhold til instruksjoner fra leverandører ved 4 ° C natten over for i et fuktet kammer. Antistoffene til CD24 (cat # SAB14202713), CD44 (cat # SAB1405590), CD117 (cat # SAB4300489) og Oct4 (cat # P0873) ble oppnådd fra Sigma-Aldrich, og antistoffet for CD34 (cat # sc-19587) ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology. Etter skylling seksjonene tre ganger (5 min hver) med PBS ble snittene inkubert med biotinylert anti-kanin (for polyklonale antistoffer) eller anti-muse (for monoklonale antistoffer) fra ABC-kit (Vector Laboratories) ved romtemperatur i 45 min etterfulgt av inkubasjon med streptavidin. Etter tre skyllinger (5 min hver) med PBS ble snittene inkubert med 3,3′-diaminobenzidin (DAB, Sigma) for å utvikle farge. Seksjonene ble undersøkt under Nikon Elipse E400 mikroskop og fotografert.
Protein isolasjon og western blot analyse
A2780 celler ble sådd ut i 6 brønners plater. Etter 24 timer med plating ble cellene behandlet med WFA og CIS både alene og i kombinasjon, som beskrevet tidligere (10). Etter 48 timers behandling ble cellene lysert i kald lyseringsbuffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% NP-40, 1 mM Na
3VO
4, og 1 mM NaF ) supplert med Komplett Mini proteasehemmer tablett (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). For å fremstille ekstrakt fra normale og tumorvev, ble vevene suspendert i lyseringsbuffer og homogenisert på is ved hjelp av Polytron-homogenisator, etterfulgt av sentrifugering ved 10.000 rpm i 5 min. Supernatantene ble samlet og proteinkonsentrasjon i hver prøve ble bestemt ved hjelp av Bradford-metoden (BioRad Laboratories) i henhold til leverandørens anvisninger. Førti ug av protein fra hver prøve ble fraksjonert på SDS-polyakrylamidgeler og overført til nitrocellulosemembraner, som beskrevet tidligere [56]. Blokkering av ikke-spesifikke proteiner som ble utført ved inkubering av membraner med 5% fettfri tørrmelk i Tris-bufret saltvann Tween-20 (TBST) i 1 time ved romtemperatur. Membranene ble inkubert med spesifikt antistoff med passende fortynning som foreslått av leverandørene. Antistoff for Notch 1 (katt # N6786), ble Hey1 (cat # SAB1404975) og β-aktin (cat # A3854) hentet fra Sigma-Aldrich, og antistoff for Hes1 (cat # sc-165996) ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology. Membranene ble vasket tre ganger (5 min hver) med TBST, fulgt av inkubasjon med pepperrot-peroksidase konjugert sekundært antistoff (1:5,000 fortynning) i TBST. Membranene ble vasket tre ganger (5 min hver) med TBST og immunreaktive bånd ble visualisert ved forsterket kjemiluminescens. Membraner ble strippet av i 10 minutter med metanol som inneholdt 3% H
2o
2 og analysert med β-actin antistoff for å tjene som en intern kontroll.
Statistisk analyse
Statistisk sammenligning av data ble utført av studentens t-test (for enkel sammenligning). Sannsynligheten for p 0,05 bestemt fra den tosidige test ble betraktet som signifikant. Den statistiske analysen ble utført ved hjelp av SPSS 10.0 programvare.
Resultater
WFA /CIS kombinasjon hemmer cellemigrering in vitro
Ulike trinn er involvert i tumorprogresjon og metastase inkludert avløsning av tumorceller fra den primære svulsten nettstedet, sjele inn lymph- eller blodkar, vedlegg til endotelet i fjerne områder av metastasering etterfulgt av seeding til ny plassering og påfølgende ekspansjon. For å undersøke effekten av WFA og CIS på A2780 cellemigrering, behandlet vi A2780-celler med WFA og CIS både alene og i kombinasjon i 48 timer. Som vist på fig. 1, ved anvendelse av Boyden kammere vi merke til at behandling av celler med WFA eller CIS alene hemmet cellemigrering på en doseavhengig måte sammenlignet med ubehandlede kontrollceller. Mens behandling av celler med 20 pM CIS hemmet cellemigrering, tilsetning av WFA (0,5 uM eller 1,5 uM) for å CIS resulterte i forbedret inhibering av cellemigrering, hvilket antyder at WFA kombinert med CIS er mer effektiv enn hvert middel som anvendes.
A2780-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av WFA og CIS både alene og i kombinasjon i 48 timer. Cellene ble trypsinert og utsatt for cellevandring ved hjelp av Boyden kammer. Celler ble farget med krystallfiolett og fotografert (A). De fargede celler ble tellet under mikroskop ved hjelp av tre ulike områder; verdier er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk. * Representerer signifikant sammenlignet med kontroll på p≤0.05 (B). Con = kontroll, W = WFA. Verdier som vises i parentes er mikrometer.
WFA /CIS kombinasjon undertrykker tumorvekst og metastasering i nakne mus
I våre
in vitro
studier, viste vi at behandling av CIS-sensitive cellelinjer (A2780 og CaOV3) samt CIS-resistens cellelinje (A2780 /CP70) med WFA og CIS både alene og i kombinasjon hemmet celleproliferasjon i en tids- og doseavhengig måte, og induserte apoptose og celle DNA-skader. Videre den kombinerte effekten av WFA og CIS var synergis [10]. For å vurdere effekten av WFA /CIS kombinasjonen på tumorvekst og metastaser in vivo, testet vi effekten av WFA og CIS både alene og i kombinasjon på tumorvekst og metastase i nakne mus som bærer inokulert ortotopiske human ovarian tumorer. Murine ortotopiske tumorer ble etablert ved injisering av A2780-celler direkte inn i venstre eggstokk fra 5 til 6 uker gamle nu /nu hunnmus. Begynnelsen fra dag 10 etter inokulasjon av tumorceller, ble dyrene behandlet med WFA og CIS både alene og i kombinasjon som beskrevet i Materialer og Metoder delen. Etter 4 ukers behandling, ble dyrene avlivet. Vi la merke til at kontroll mock-behandlede dyr utviklet høyt vaskularisert og store svulster (fig. 2). Samtidig 4 av 5 WFA (2 mg /kg) alene-behandlede dyrene utviklet tumorer som var betydelig mindre i størrelse. Tilsvarende, 3 av 5 dyr som ble behandlet med cis (6 mg /kg) utviklet tumorer som var betydelig mindre i størrelse sammenlignet med mock-behandlede kontroller. Videre behandling av dyr med WFA (2 mg /kg) i kombinasjon med CIS (6 mg /kg) resulterte i 70 til 80% reduksjon i tumorvekt sammenlignet med ubehandlede kontrolldyr (fig. 2) og ut av 5 mus, bare tre mus utviklet svulster. Det ble ikke observert noen signifikante forskjeller i tumorvekt hos mus behandlet med WFA og CIS alene eller i kombinasjon (fig 2)
A:. 1 × 10
6 A2780 celler ble injisert i hunnmus eggstokk. Etter 10 dager etter injeksjon, ble musene behandlet med WFA og CIS både alene eller i kombinasjon i fire uker. Mus ble avlivet; svulster ble skåret ut, fotografert og vektet. Svulster som vises er representant fra hver gruppe. B: Svulster vekt ble plottet fra hver gruppe. Horisontal linje representerer midlere vekt av hver gruppe. Behandlede gruppen viste signifikant lavere vekt enn ubehandlede mus. Resultatene er gjennomsnitt (rød linje) og ± SD (loddrett strek). * Representerer signifikant sammenlignet med kontroll på p≤0.05
H . E histo-patologiske analyse av un-injiserte motsatte eggstokkene, lever og lunger viste metastaser til lever og eggstokkene hos mock- behandlede dyr bare . Metastatiske celler omfattet ~ 10% av cellene i de organer (Fig. 3). I motsetning ble ikke observert noen metastaser i WFA og CIS behandlet grupper. Disse resultatene tyder på at kombinasjonen av lav dose av WFA (2 mg /kg) med suboptimal dose av CIS (6 mg /kg) er svært effektive i å undertrykke tumorvekst og metastasering av ortotopiske ovarietumorer i nakne mus. Dette indikerer at det ville være mulig å redusere terapeutisk dose av CIS når den kombineres med WFA hos mennesker for å lindre bivirkningene forbundet med høy dosering av CIS.
Mus ble behandlet med WFA og CIS som angitt i Figur 2. tumorer og andre vev seksjoner ble farget med H E og undersøkt av en utdannet patolog. Metastase (vist med piler) ble observert i un-injiserte eggstokkene og lever og representerer omtrentlig 10% av cellene.
WFA alene eller i kombinasjon med CIS eliminerer mulige kreftstamceller i ortotopiske ovarietumorer
Chemo-motstand og tilbakefall av eggstokkreft er et stort problem, og dødsårsaken. I de senere år har et konsept av cscs i faste cancere, inkludert eggstokk-kreft blitt foreslått [57], [58]. Cscs har blitt rapportert å være ansvarlig for kjemoterapi-motstand, tumorvekst og tilbakefall av kreft etter behandling. Putative cscs er rapportert som kreft initierende celler i stand til å utvikle tumorer når de injiseres i nakne mus [57]. For å teste om WFA når de brukes alene eller i kombinasjon med CIS målrettet mot cscs, utførte vi immunohistokjemisk analyse av tumorene som er samlet fra den mock-behandlede dyr og dyr behandlet med WFA og CIS både alene og i kombinasjon ved hjelp av antistoffer til markører uttrykkes ved putative cscs inkludert CD44, CD24, CD34, CD117 og Oct4 [56]. Som vist i fig. 4-6, observerte vi ~10-20% av cellene positive for CD44, CD24, CD34, CD117 og Oct4 i svulster samlet inn fra ubehandlede dyr. Imidlertid behandling av dyr med WFA (2 mg /kg) resulterte i en meget betydelig reduksjon i antall av disse cellene. I motsetning til behandling av dyr med CIS alene i en dose på 6 mg /kg resulterte i signifikant økning av CD44, CD24, CD34, CD117 og oktober 4-positive celler (60%) (fig. 4-6). Enda viktigere, behandling av dyr med WFA i kombinasjon med CIS (6 mg /kg) betraktelig redusert antall celler som uttrykker CSC-markører.
Data vist er representative for to uavhengige eksperimenter. W = WFA. Verdier som vises i parentes er mg /kg.
Dataene som vises er representative for to uavhengige eksperimenter. W = WFA. Verdier som vises i parentes er mg /kg.
Dataene som vises er representative for to uavhengige eksperimenter. W = WFA. Verdier som vises i parentes er mg /kg.
WFA alene eller i kombinasjon med CIS ned regulerer uttrykket av CSC-relaterte markører
For å bekrefte vår immuno-histokjemisk analyse av CD44, CD24, CD34, CD117 og OCT4 positive celler i ortotopiske svulster, utførte vi Western blot analyse av tumorekstrakter ved hjelp av spesifikke antistoffer for markører som oppdages av immuno-histokjemisk farging. Som vist på fig. 7, uttrykk for CD24, CD34, CD44, og OCT4 antigener ble signifikant nedregulert i tumorer innsamlet fra dyr behandlet med WFA alene i forhold til svulster fra mock-behandlede dyr. I motsetning til dette ble det observert en signifikant økning i ekspresjon av CD24, CD34, CD44 og Oct4 i tumorekstrakter fra dyr behandlet med CIS (6 mg /kg) sammenlignet med mock-behandlede mus eller mus behandlet med WFA (2 mg /kg) alene . Interessant, behandling av dyr med WFA (2 mg /kg) i kombinasjon med CIS (6 mg /kg) resulterte i en vesentlig eliminering av celler som uttrykker CD44, CD24, CD34 og OCT4 antigener.
beta-actin ble anvendt som en intern kontroll. Dataene er vist er representative for to uavhengige eksperimenter. Con = kontroll, W = WFA. Verdier som vises i parentes er mg /kg.
Økning i antall celler som uttrykker markører for antatte cscs i svulster samlet inn fra dyr behandlet med CIS som analyseres ved immunofarging samt Western blot analyse tyder på at behandling av CIS kan øke antallet celler som uttrykker disse markørene, og kan forklare utviklingen av chemo-motstand og gjentakelse av ovarial cancer hos pasienter behandlet med CIS eller dets derivat slik som karboplatin i kombinasjon med paclitaxel som er vanlig brukt i kjemoterapi. I motsetning til eliminering av celler som uttrykker CSC markører i svulster på behandling med WFA alene eller i kombinasjon med CIS (6 mg /kg) viser at WFA er meget effektivt i å eliminere celler som uttrykker CSC-markører.
WFA alene eller i kombinasjon med CIS hemmer Notch en og nedstrøms signal gener (Hes1 og Hey1)
Selv fornyelse, legemiddelresistens og differensiering er sentrale kjennetegn ved cscs. Sonic Hedgehog (Shh), Notch1, Twist1, Snail og Wnt1 signaleoverføringsveier spille viktige roller i selvfornyelse av disse cellene [33], [59] – [68]. WFA har blitt rapportert å hemme Notch-1 og nedstrøms signaliseringsgener (Hes1 og Hey1) [33], [68]. Notch en signalveien er forbundet med regulering av celle skjebne ved flere forskjellige utviklingsstadier, og har vært implisert i kreft initiering og progresjon [63], [69], [70]. I foreliggende undersøkelse, som vist i fig. 8, vi merke til meget signifikant inhibering av ekspresjon av Notch 1 og nedstrøms signaliseringsgener Hes1 og Hey1 i tumorer som er samlet fra mus behandlet med WFA (2 mg /kg) sammenlignet med tumorer fra kontroll mock-behandlede dyr. I motsetning til dette dyr behandlet med CIS (6 mg /kg) viste en meget signifikant økning i nivåene av Notch1, Hes1 og Hey1 gener. Hva som er viktig, tumorer oppsamlet fra mus behandlet med WFA (2 mg /kg) i kombinasjon med CIS (6 mg /kg) viste signifikant reduserte nivåer av Notch1 samt Hes1 og Hey1 proteiner (Fig. 8), noe som tyder på nedregulering av Notch1 signalering ved WFA alene eller i kombinasjon med CIS som fører til eliminering av mulige cscs.
beta-aktin ble benyttet som en intern kontroll. Dataene er vist er representative for to uavhengige eksperimenter. Con = kontroll, W = WFA. Verdier som vises i parentes er mg /kg.
Diskusjoner
Den vanligste første linjen kjemoterapi brukes for eggstokkreft etter cytoreduserende kirurgi er karboplatin i kombinasjon med paclitaxel. Initial responsraten for denne kombinasjonen er meget høy (70 til 80%), men i løpet av 6 til 20 måneder etter første behandling tumor tilbakefall og pasientene blir motstand mot CIS [71]. Motstandsdyktighet mot CIS har vært forbundet med flere mekanismer slik som økning av glutation og metalltioneinsystemene nivåer, redusert medikamentopptak, økning av DNA-reparasjonsmekanismer (på grunn av økt ekspresjon av fjerning reparasjonsgener) og toleranse av dannelsen av platina-DNA-addukter [ ,,,0],72]. Endring i status for p53 har også blitt rapportert å spille viktige rolle i følsomheten av CIS [73], [74].
I de senere årene har flere forskere rapportert en tilstedeværelse av liten populasjon av cscs i tumorvev til være ansvarlig for induksjon av cellegift-motstand og tilbakefall av kreft [75] – [77]. Den overbevisende bevis for rollen cscs i eggstokkreft ble gitt av Bapat et al. [45] som viste tilstedeværelse av cscs på enkeltcelle-nivå i ascites av en ovarial cancer pasient, som kan sekvensielt forplanter tumor over flere generasjoner. I samsvar med dette, mange andre forskere rapporterte tilstedeværelse av cscs i ovarialcancer cellelinjer, pasientenes ovarietumorer og tumorassosierte-ascites [57], [76], [77]. Som en oppfølging av disse observasjonene cscs har blitt isolert basert på tilstedeværelse av noen ekstracellulære markører. De vanligste beslutningstakere som brukes for eggstokkreft cscs inkluderer CD44, CD24, CD34, CD117 og CD133. Cscs også uttrykke ALDH1, Oct4, MyD88 og EpCAM [47], [51], [57], [60], [78], [79]. En økning i antall cscs i ovarietumorer korrelerer med dårlig prognose, inkludert kortere samlet og sykdomsfri overlevelse [80] – [82]. Utvikling av chemo-motstand av eggstokkreft kan forklares med berikelse for cscs [77], [83] – [85]. I en fersk undersøkelse, Abubaker et al. [53] demonstrert ved anvendelse av to ovarie cancer-cellelinjer (epitelial OVCA433 og mesenkymale HEI) anrikning for en populasjon av celler med høy ekspresjon av CSC markører på proteinet, så vel som mRNA-nivåer etter behandling med paclitaxel CIS, og en kombinasjon av begge. I tillegg er disse etterforskerne viste økning i tumorigen egenskaper eggstokkreft celler som respons på kjemoterapi narkotika. I denne studien, viser vi en eller annen måte i samsvar med disse studiene [53] at antall cscs øker hos dyr som bærer ortotopiske ovarietumorer behandlet med CIS på 6 mg /kg. Denne økningen i cscs befolkningen i ovarietumorer av mus med CIS kan forklare utviklingen av cellegift-motstand og gjentakelse av eggstokkreft hos pasienter behandlet med CIS eller dens deriverte carboplatin benyttet i kombinasjon med paclitaxel.
Økning i antall cscs i tumorer inokulert i nakne mus, etterfulgt av behandling CIS er resultat av amplifikasjon av cscs som er tilstede i humane kreftcellelinje A2780. På andre siden vokser svulsten vil tiltrekke verts avledet normale stamceller som vil gi stroma og blodkar for å utvide svulstvev. Disse cellene kan gi trofiske signaler for cscs, og dette er nå undersøkt i våre laboratorier.
I de siste årene har en stor del av arbeidet har vært viet til å utvikle medisiner som kan drepe kreftceller samt cscs for for å redusere chemo-motstand og tilbakefall av kreft etter behandling. WFA som rapportert utviser en inhiberende effekt mot flere forskjellige typer kreftceller. Imidlertid har sin virkning på cscs ikke blitt undersøkt så langt. I vår tidligere studie [10], vi demonstrert at WFA når de brukes alene eller i kombinasjon med CIS hemmer celleproliferasjon og indusere celledød av begge cis-sensitive (A2780 og CaOV3) samt CIS-resistente (A2780 /CP70) cellelinjer . I vår nåværende oppfølgingsstudie viser vi at WFA (2 mg /kg) når det anvendes alene eller i kombinasjon med CIS for å behandle mus med ortotopisk ovarial tumor redusert tumorvekst med 70 til 80% og forebygges metastasering til andre organer. I tillegg behandling av mus med ortotopiske ovarietumorer med WFA alene eller WFA + CIS eliminert celler som uttrykker CSC markører. (CD44, CD24, CD34, CD117 og Oct4). I motsetning til dette antall av disse cellene som er nevnt ovenfor økes i hendene etter behandling av CIS alene. Således våre resultater viser klart at kombinasjonen av lav dose av WFA (2 mg /kg) med suboptimal dose av CIS (6 mg /kg) er svært effektive i å undertrykke tumorvekst og eliminering av mulige cscs «utvidet» av CIS behandling. Siden, terapeutisk dose av CIS er 8 mg /kg [19], WFA i kombinasjon med CIS har potensial til å være svært effektive og effektiv behandling for eggstokkreft og kan bøte CIS-terapi relaterte bivirkninger.
Selv fornyelse, resistens og differensiering er sentrale kjennetegn ved cscs og flere utviklingsveier som Sonic Hedgehog (Shh), Notch, Wnt og TGFfi, Twist, og sneglen som har vist seg å være avgjørende i disse prosessene [33], [59] – [67], [86]. WFA har blitt rapportert å hemme Notch1 og nedstrøms signale gener (Hes1 og Hey1) [43], [77] som er blitt implisert i kreft initiering og progresjon [63], [69], [70].
i foreliggende undersøkelse, viser vi for første gang meget signifikant inhibering av Notch1 og nedstrøms signaliseringsproteiner Hes1 og Hey1 i tumorer som er samlet fra dyr behandlet med WFA (2 mg /kg) sammenlignet med tumorer fra mock-behandlede dyr. I motsetning til dette dyr behandlet med CIS (6 mg /kg) alene viste en betydelig økning i nivåene av Notch1, Hes1 og Hey1 gener som er i overensstemmelse med økningen i antallet cscs, noe som antyder en viktig rolle for Notch1 transduksjon pathway i amplifikasjon av disse celler.
