Abstract
Autophagy relatert gen-5 (ATG-5) er en av de viktigste regulatorer av autophagic celledød. Det har blitt ansett som et beskyttende molekylær mekanisme for tumorceller i løpet av kjemoterapi. I denne studien undersøkte vi uttrykket mønster av ATG-5 og multiresistens-assosiert protein-1 (MRP-en) på 135 mage kreft (GC) pasienter som ble behandlet med epirubicin, cisplatin og 5-FU adjuvant kjemoterapi (ECF ) etter kirurgisk reseksjon og utforsket sitt potensial klinisk betydning. Vi har funnet at både ATG-5 (77,78%) og MRP-1 (79,26%), ble sterkt uttrykt i GC pasienter. ATG-5 uttrykket var signifikant assosiert med dybde på veggen invasjon, TNM etapper og fjernmetastaser av GC (P 0,05), mens MRP-en uttrykks var signifikant forbundet med tumorstørrelse, dybde på veggen invasjon, lymfeknutemetastase, TNM etapper og differensiering status (P 0,05). ATG-fem uttrykk var positivt korrelert med MRP-en (rp = 0,616, P 0,01). Økt uttrykk av ATG-5 og MPR-en var signifikant korrelert med dårlig total overlevelse (OS; P 0,01) og sykdomsfri overlevelse (DFS; P 0,01) av våre GC kohort. Videre viste vi at ATG-5 var involvert i resistent av GC-celler, som var hovedsakelig gjennom å regulere autofagi. Våre data antyder at oppregulert ekspresjon av ATG-5, et viktig trekk ved molekylær beskyttende autophagy, er forbundet med chemoresistance i GC. Uttrykk av ATG-5 og MRP-en kan være uavhengige prognostiske markører for GC behandling
Citation. Ge J, Chen Z, Huang J, Chen J, Yuan W, Deng Z, et al. (2014) oppregulering av Autophagy-Related Gene-5 (ATG-5) er assosiert med Chemoresistance i Human Gastric Cancer. PLoS ONE 9 (10): e110293. doi: 10,1371 /journal.pone.0110293
Redaktør: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 05.08.2014; Godkjent: 18 september 2014; Publisert: 17 oktober 2014
Copyright: © 2014 Ge et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation i Hunan-provinsen i Kina (No. 2012FJ6088). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for en betydelig nedgang i forekomsten i mange utviklede land, magekreft (GC) er fortsatt den fjerde hyppigste kreftformer, og den nest største årsaken til kreftrelaterte dødsfall i verden [1]. I løpet av de siste tiårene, standard multimodale behandlingsstrategier sammen med andre anbefalte alternativer (f.eks D2 disseksjon og adjuvant kjemoterapi) har ikke klart å kurere en stor andel av pasienter som lider av GC, spesielt for de med avanserte og metastatisk sykdom, med dårligere overlevelse blir sett sannsynligvis på grunn av tilstedeværelsen av chemoresistance under behandlingen [2]. Derfor er identifisering av nye molekylære hendelser som ligger bak utviklingen av denne kreft og dens dårlig prognose samt forståelse mekanismene for GC chemoresistance presserende behov for mer effektiv klinisk intervensjon og bedre behandling av pasienter.
Under fysiologiske forhold, autophagy er et lysosom avhengig selvoppslutnings system primært ansvarlig for fjerning og gjenvinning av langlivede proteiner og skadede /foreldet intracellularorganelles for å opprettholde celle homeostase [3]. Proteiner og organeller bestemt for ødeleggelse blir sekvestrert i løpet av «dobbel-membran» vakuoler (autophagosomes), etterfulgt av fusjon med lysosomer for å bygge kompleksene som er kjent som autophagosomes, hvor innholdet blir degradert av lysosomale hydrolaser [4]. Det er blitt dokumentert at autofagi kan bli indusert i respons til mange ugunstige forhold, inkludert næringsmangel, oksidativt stress eller DNA-skader, og tjener som en adaptiv celle mekanisme, etter hvert som tillater cellene å overleve og formere seg, mens store eller vedvarende Autophagy resulterer i celledød [ ,,,0],5]. Svekkelser i fysiologisk aktivering, montering og funksjon av autophagic reaksjonsveien er i økende grad blitt observert i en rekke forskjellige humane kreftformer, selv om den eksakte rolle autophagy i kreft genesis og progresjon er fremdeles under strid. Noen data favorisere den ideen at autophagy undertrykker tumorgenese, mens andre bevis tyder på at autofagi er i stand til å utløse startfasen og beskytter tumorceller fra gjennomgår apoptose [6]. Interessant, inhibering av autophagy ble nylig funnet å øke den anti-tumoraktiviteten av flere cytotoksiske midler. Li og kolleger rapporterte at autofagi ble aktivert som en beskyttende mekanisme mot cellulære virkningene av 5-FU-behandling og hemming av autofagi av 3-metyladenin utvidet 5-FU-indusert apoptose i tykktarmskreftceller [7], [8]. På den annen side, ble enkelte anticancer legemidler (f.eks cetuximab og dasatinibbehandlede) påvist å indusere autophagic celledød gjennom ulike mekanismer i enkelte kreftceller [9] – [13]. Den molekylære maskiner der autofagi regulerer overlevelse eller død av neoplastiske celler forblir stort sett obskure hittil. Den autofagi veien er en svært modulert dynamisk prosess hovedsakelig utført av autofagi relaterte (ATG) familie av gener, som er styrt av flere viktige kinaser inkludert mTOR, PI3K /Akt, AMPK og MAPK [14], [15]. ATG-5 er en sentral regulator nødvendig for autofagi i form av sitt engasjement i autophagosome forlengelse [16]. Tvangs uttrykk for ATG-5 sensibiliserte tumorceller til anticancer behandling både
in vitro Hotell og
in vivo
; i motsetning siRNA-mediert hemming av ATG-fem førte til delvis motstand mot kjemoterapi [17]
Postoperativ adjuvant kjemoterapi er i dag en viktig behandling for GC.; imidlertid den samlede effekten av kjemoterapi forblir dårlig muligens som en konsekvens av nærværet av multimedikamentresistens (MDR) fenotype. I motsetning til andre tumortyper, er ekspresjon av de klassiske MDR-medierende molekyler så som glutation S-transferase og multidrug-resistens-genet en ikke særlig utbredt i GC vev, noe som indikerer at det kan eksistere en komplisert mekanisme for utviklingen av MDR i denne ondartet sykdom [ ,,,0],18]. Som en av de klassiske multiresistent mekanismer, har multilegemiddel resistens-assosiert protein 1 (MRP1 /ABCC1) er funnet å være sterkt uttrykt i GC, og således kan utøve sentral rolle i mediering av MDR i GC [19], [20]. Imidlertid er det ikke kjent hvorvidt MRP-1-ekspresjon er assosiert med ATG-5 ekspresjon. Og også om autofagi er involvert i chemoresistence i GC pasienter er uklart.
I denne studien, vi først ansatt immunhistokjemi å undersøke uttrykket profilen til ATG-5 og MRP1 i en sum på 135 GC pasienter som fikk ECF (epirubicin, cisplatin og 5-FU) adjuvant kjemoterapi etter kirurgisk reseksjon. Sammenhenger mellom ATG-5 og MRP-en uttrykk samt deres uttrykk med ulike clinicopathological funksjoner i GC og kliniske resultater ble også vurdert.
Materialer og metoder
Pasienter og vevsprøver
En totalt 135 GC pasienter som består av 91 menn og 44 kvinner som gjennomgikk kirurgi ved Institutt for Gastrointestinal kirurgi, Xiangya Hospital, Central South University (CSU), Kina, mellom 1. januar 2007 og 31 desember 2008 ble inkludert i denne studien. Gjennomsnittsalderen for kohorten var 53.62 ± 9.73 år, med et utvalg av 26 til 72. Theprimary GC svulst tissuesand matchet ikke-kreft (NC) vev som ligger minst 5 cm fra tumor kjernen ble oppnådd etter kirurgisk reseksjon og umiddelbart behandlet og lagres inntil videre anvendelse. Ingen av de rekrutterte pasientene hadde cellegift eller strålebehandling før kirurgisk inngrep. Den histopatologiske diagnosen ble utført preoperativt og bekreftet av kirurgi. Alle deltakerne med stadium IB til IV svulster mottatt ECF cellegift etter operasjonen (Dose: epirubicin 50 mg /m
2 på dag 1, cisplatin 60 mg /m
2 på dag 1 og kontinuerlig intravenøs infusjon av 5-FU 500 mg /m
2 /d for 4 dager, hver 3. uke i opptil 24 uker). De kliniske egenskapene til disse pasientene ble oppført i tabell 1.
Alle saker i denne studien ble gjennomgått og alle prøvene ble histopathologically revurdert i oktober 2012. Dybden på veggen invasjon, regional lymfeknute metastase, og histologisk grad ble bekreftet av den samme gruppen av to erfarne senior patologer. Pasientene ble kategorisert basert på differensiering status av kreftceller i tre histologiske klassetrinn: vel, moderate og dårlig. Basert på en kombinasjon av lokoregionalt tumor engasjement og tilstedeværelse av metastaser, ble alle saker iscenesatt i henhold til TNM klassifisering av ondartet svulster (TNM) stadium gruppering [21]. For analyse av overlevelse, ble datoen for operasjonen brukes til å representere startpunkt for oppfølging besøk. Pasienter som døde av andre sykdommer fremfor GC eller andre uforutsette hendelser ble ekskludert fra saken samlingen. Dødsårsaken rekruttert i denne studien var forverring av GC. Den total overlevelse (OS) ble beregnet som en periode fra datoen for den første operasjonen til dødsdato eller dato for siste oppfølging som endepunkt. Den sykdomsfri overlevelse (DFS) ble definert som tidsintervallet fra kirurgi frem til dato for lokale tilbakefall eller første fjernt organ metastaser. Informert skriftlig samtykke er innhentet fra hver pasient før kirurgi og denne studien ble godkjent av forskningsetiske komité for Central South University, Kina. Alle prøvene ble håndtert og anonymisert i henhold til de etiske og juridiske retningslinjer.
Immunohistochemistry
De ferske prøver ble fiksert i 10% nøytral bufret formalin og senere innebygd med parafin. De parafininnstøpte vev ble kuttet ved 4 pm og deretter deparaffinized med xylen og rehydrert for ytterligere H E eller peroksidase immunhistokjemi flekker ved hjelp av DAKO EnVision System. I korte trekk følgende proteolytisk fordøyelse og blokkering med endogen peroksidase, ble vev lysbilder inkubert med primære antistoffer (ATG5: ab54033; MRP1: ab32574; Abcam Inc., Cambridge, UK) mot respektive målproteiner ved en fortynning på 1:500 over natten ved 4 ° C. Etter vasking med PBS, ble peroksidasemerket polymer og substrat-kromogen deretter anvendt for å visualisere immnohistochemical farging. Endelig seksjonene ble kontra med hematoksylin, cover-gled med monteringsmedium, og undersøkt ved lysmikroskopi. Alle prosedyrer ble utført ved Avdeling for patologi, Xiangya Hospital, C.S.U. Lysbilder ble tolket uavhengig av to erfarne patologer, som var blind for pasientenes informasjon. Vi kvantifisert fargingsintensitet og prosentandelen av fargede celler ved bruk av en tidligere beskrevet metode [22], [23]: prosentandelen av positivt fargede celler (0% -100%) ble multiplisert med den dominerende intensitetsmønsteret av flekker, tatt i betraktning en som negativ eller spore, to som svak, 3 som moderat og fire like sterk. Derfor samlet poengsum varierte fra 0 til 400. Pasientene ble deretter kategorisert i fire forskjellige undergrupper: scorer 0-99, score 100-199, score 200-299 og score 300-400
Western blot analyse
hele celleekstrakter ble fremstilt ved bruk av 0,14 M NaCl, 0,2 M trietanolamin, 0,2% natriumdeoksycholat, 0,5% Nonidet P-40 og supplert med en protease inhibitor (alle produktene var fra Sigma, St. Louis, Missouri , USA). Deretter ble proteinprøven kjørt gjennom en 12% natrium-dodecyl-sulfat-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) gel og overført til en membran. De overførte Membranene ble deretter inkubert over natten ved 4 ° C med et primært antistoff. Etter vasking, ble membranen inkubert med en pepperrot peroksidase (HRP) -bundne sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. De primære antistoffer var anti-ATG-5 (Santa Cruz, CA, USA), anti-LC3A /B (Abcam, Cambridge, UK) og anti-β-Actin (Santa Cruz, CA, USA). Alle rapporterte resultater er de gjennomsnittlige forhold av tre forskjellige uavhengige eksperimenter.
celleproliferasjonsanalyse
Cellene ble sådd ut på 96-brønners plater (10000 celler /brønn) i 24 timer før behandling. MTT-analyser ble brukt for å vurdere celleformering ved forskjellig tidspunkt etter behandling. MTT-analysen ble utført som følger: MTT ble tilsatt til hver brønn og platene ble inkubert ved 37 ° C i 4 timer. MTT-medium blandingen ble deretter fjernet, og 150 ul dimetylsulfoksid (DMSO) ble tilsatt til hver brønn. Absorbansen ble målt ved 570 nm ved hjelp av et multiwall spektrofotometer
RNA interferens
siRNA tomannsboliger rettet mot ATG-5 ble fremstilt som følger: siRNA-ATG5-486. GACGUUG GUAACUGACAAATT; siRNA-ATG5-695: GUCCAUCUAAGGAUGCAAUTT og siRNA-ATG5-938: GACCUUUCAUUCAGAAGCUTT. siRNA tomannsboliger inneholder ikke-spesifikke sekvenser ble brukt som en negativ kontroll (NC): UUCUCCGAACGUGUCACGUTT. Forskjellige sirnas ble transfektert separat inn i celler ved anvendelse av Lipofectamine 2000 reagens, og mediet ble erstattet 6 timer etter transfeksjon.
Sanntids RT-PCR
Total RNA fra cellelinjer og vev var utvinnes ved hjelp av Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA), etter produsentens anvisninger. Konsentrasjonen av RNA ble målt ved anvendelse av et spektrofotometer. Et cDNA-pool ble syntetisert ved anvendelse av 1 pg av total RNA og Taqman revers transkripsjon Reagenser (Applied Biosystems, Foster City, USA) som beskrevet av fabrikanten. Uttrykket av målet genet ble evaluert med en relativ kvantifisering tilnærming (2
-ΔΔCt metode) med β-actin som intern referanse.
immunfluorescens analysen
Celler ble permeabilized med 0,3 % Triton X-100 i 10 minutter, fulgt av fiksering med 2-4% metanal i 15 minutter, og blokkert med 3% saueserum ved romtemperatur i 60 min. Deretter, probet med primære antistoffer anti-LC3B (Santa Cruz, CA, USA) over natten ved romtemperatur, og cellene ble vasket tre ganger med PBS. Farget med Alexa Fluor 488 488 konjugert kanin anti-geite-IgG i 1 time ved romtemperatur, og deretter ble cellene vasket tre ganger med PBS. Cellekjernene ble visualisert ved farging med DAPI (Sigma, USA) i 2 min. De fargede celler ble observert med omvendt fluorescens mikroskop.
Statistisk analyse
Alle statistiske analyser ble utført med SPSS programvarepakke 15,0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Kvantitative data ble presentert som gjennomsnitt ± SD. Pearsons χ
2 test ble brukt for å sammenligne forskjellen mellom rangert data, mens en-veis-ANOVA testen ble utført for å sammenligne forskjellen mellom kvantitative data. Overlevelses analyser ble utført ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet ved log-rank test. Den Cox-regresjonsmodell ble utført for å evaluere den uavhengige hasardratio på hver variabel i den multivariate analysen. Korrelasjonen mellom ATG5 og MRP1 uttrykk ble undersøkt ved hjelp av bivariate korrelasjon (Pearson) test. Forskjeller ble ansett som statistisk signifikant når
P
verdiene var mindre enn 0,05.
Resultater
Uttrykk av ATG-5 og MRP-en i GC
uttrykket mønster og plassering av ATG-5 og MRP-1 i våre pasienter GC, som ble behandlet med epirubicin, cisplatin og 5-FU adjuvant kjemoterapi (ECF) etter kirurgisk reseksjon, ble undersøkt ved hjelp av immunhistokjemisk analyse. Blant de 135 GC prøver, 105 (77,78%) var positive for ATG-5 immunoreaktivitets, og 107 (79,26%) var MRP-en positiv. Som vist i figur 1, har vi funnet at ATG5 er hovedsakelig uttrykt i cytoplasma. Videre, over-ekspresjon av ATG-5 positivt korrelert med den for MRP-1 i GC. (R = 0,616,
P
0,001), som avslørt av bivariat korrelasjonstest. Den positive ekspresjon i tilgrensende ikke-cancerøse vev var 113 (83,70%) for ATG-5 og 89 (65,93%) for MRP-1. Dataene viser at både ATG-5 og MRP-1 positivt uttrykt i kreft og ikke-cancerøse vev, noe som antyder at ATG-5 og MRP-1 kan bli indusert ved kjemoterapi hos både tumor- og ikke-tumorvev. Som alle våre pasientprøver ble behandlet med ECF kjemoterapi, og vi fant ut at både ATG-5 og MRP-en ble sterkt uttrykt og positivt korrelert i disse prøvene. I mellomtiden, indikerer tidligere undersøkelse som MRP-1 kanskje i forbindelse med multi-medikamentresistens i GC. Sammen med tidligere funn Våre resultater tyder på at ATG-5 og MRP-1 kan være involvert i chemoresistance i GC-pasienter.
(A) ATG-5 farging i ikke-kreft gastrisk vev mottok 285 (x 200) ; (B) ATG-fem flekker i GC tumorvev scoret 50 (× 400); (C) ATG-fem flekker i GC tumorvev scoret 270 (× 400); (D) ATG-fem flekker i GC tumorvev scoret 400 (× 200).
Foreninger mellom uttrykk av ATG-5 eller MRP-en og clinicopathological karakteristikker av GC
sammenslutninger av ATG-5 og MRP1 uttrykk med forskjellige clinicopathological parametere av GC, er vist i tabell 1 og tabell 2, respektivt. Uttrykk av ATG-5 ble signifikant assosiert med dybde på veggen invasjon, fjernmetastaser og TNM stadier av GC (
P
0,001,
P
= 0,018,
P
0,001 henholdsvis). MRP-en uttrykks var signifikant assosiert med økt tumorstørrelse, dybde på veggen invasjon, noder regionale lymfeknutemetastaser, TNM stadier (
P
= 0,032,
P
0,001, P = 0,016, P 0,001 henholdsvis) og differensiering status (
P
= 0,005). For ytterligere å bestemme involvering o f ATG-5 og MRP-1 i GC utvikling, utførte vi overlevelsesanalyse i våre pasientprøver. Vår overlevelse analyser viste at den totale total overlevelse (OS) rate av våre GC kohort var 43,70% med en bety overlevelse av 39.849 måneder (95% KI, 35.636-44.061 måneder); mens sykdomsfri overlevelse (DFS) rente var 34,07% med et gjennomsnitt overlevelse av 35.802 måneder (95% KI, 31.618-39.986 måneder). Vi neste klassifiseres pasientene i fire ulike undergrupper i henhold til resultatet av immunhistokjemi flekker. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse viste en høyere ATG-5 uttrykket var signifikant assosiert med dårligere OS (
P
0,001) og DFS (
P
= 0,003). Parvise sammenligninger viste at pasienter som bærer den høyeste ATG-fem uttrykk (score 300-400) hadde de fattigste overlevelse i forhold til at andre undergrupper (Figur 2A og 2B). Konsekvent ble oppregulert MRP-en uttrykk funnet å være signifikant assosiert med dårlig OS (
P
= 0,001) og DFS (
P
= 0,018) av våre GC pasienter. Undergruppen med høyest MRP1 uttrykk score (0-99) viste seg å ha den verste prognose (figur 2C og 2D) i sammenligning med andre undergrupper. Våre data viste også at det var en signifikant sammenheng mellom TNM stadier og overlevelse av GC pasienter. Pasienter med stadium III og IV svulster vises dårligere prognose i forhold til de husing stadium IB og II svulster (
P 0,01
) (Figur 2E og 2F). Mer interessant, Cox multivariate fare regresjonsmodellen viste at ATG-5 og MRP-1 uttrykk nivåer og TNM etapper var alle uavhengige og viktige prognostiske indikatorer for å forutsi OS (
P
= 0,037,
P
= 0,005,
P
0,001 henholdsvis) og DFS (
P
= 0,004,
P
= 0,008,
P
0,001 henholdsvis) av GC (tabell 3). Våre data indikerte ATG-5 og MRP-1 var nært beslektet med GC utvikling og kan tjene som dårlig prognose markører i GC-behandling.
(A og B) Pasientene ble delt inn i fire undergrupper følgende på grunnlag av ATG -5 farging: scoret 0-99 (kurve a), scoret 100-199 (kurve b), scoret 200-299 (kurve c) og scoret 300-400 (kurve d). Forskjellen mellom ulike undergrupper var statistisk signifikant som vurderes samlet sett som Log-rank sammenligninger (OS:
P
0.001, DFS:
P
= 0,003). Parvise Log-rank sammenligninger viste at undergruppen D utstilt de fattigste overlevelse i forhold til andre undergrupper (OS:
P
0,05, DFS:
P
0,01). (C og D) Pasientene ble delt inn i følgende fire undergrupper basert på MRP-en farging: scoret 0-99 (kurve a), scoret 100-199 (kurve b), scoret 200-299 (kurve c) og scoret 300-400 (kurve d). Forskjellen mellom ulike undergrupper var statistisk signifikant samlet sett Log-rank sammenligninger (OS:
P
= 0,001, DFS:
P
= 0,018). Parvise Log-rank sammenligninger viste at undergruppen A hadde mest gunstig prognose blant de fire undergrupper (OS:
P
0,05, DFS:
P
0,001). (E og F) Pasientene ble delt inn i fire undergrupper i henhold til forskjellige TNM stadier. Forskjellen mellom ulike undergrupper var statistisk signifikant samlet sett Log-rank sammenligninger (OS:
P
0.001, DFS:
P
0,001). Parvise Log-rank sammenligninger viste at undergrupper III eller IV utstilt dårligere overlevelse enn for undergrupper IB og II (OS:
P
0,01, DFS:
P
0,001).
ATG-5 var signifikant oppregulert i kjemoresistent celler
for ytterligere å undersøke hvilken rolle ATG-5 i tumorigenesis og resistent. Vi oppdaget proteinet uttrykk i flere magekreft cellelinjer (AGS, BGC-832, SGC7901, SGC7901 /DPP og MKN45) og i en udødelig menneskelig gastrisk epitelial slimhinnen cellelinje (GES). Interessant nok har vi funnet at ATG-5 ble dramatisk overuttrykt i DPP resistent cellelinje, SGC7901 /DPP-celler, sammenlignet med alle de andre cellelinjene som omfatter DPP følsomme SGC7901 celler (figur 3A). Vi videre bekreftet at SGC7901 /DPP cellene er resistente mot DPP behandling. IC 25, IC50 og IC75 var 15,4 mikrometer, 38,7 um og 93,53 mikrometer i SGC7901 celler. I motsetning til dette, The IC 25, IC50 og IC75 var 120,03 um, 271.9 uM og 423,7 uM i SGC7901 /DPP (figur 3B). Det er fra 5 til 9 ganger høyere enn i ikke-medikament-resistente celler. Vår finne det sterkeste at ATG-5 bidrar til resistent av GC cellene.
(A) Nivået av ATG5 ble påvist i cellelinjer ved hjelp av western blot-analyse. β aktin ble brukt som intern kontroll. (B) IC 25, IC50 og IC75 av SGC-7901 og SGC-7901 /DDP celler ble testet ved hjelp av MTT-analyser etter DPP behandling.
Hemming av ATG-5 lysfølsomt kjemoresistent celler til medikamentell behandling
for ytterligere å bevise at ATG-5 bidrar til resistent av GC-celler, brukte vi små interfererende RNA (siRNAs) til knockdown uttrykket av ATG-5. Tre siRNAs ble utformet. Vår sanntid PCR og western blot Resultatene viste at alle tre sirnas hemmet ekspresjon av ATG-5 både mRNA og proteinnivå (figur 4A og 4B). Vi valgte en, siRNA-ATG5-695, med høyest knockdown effektivitet for å utføre følgende eksperiment. Vi knockdown ATG-5 ekspresjon, og deretter behandles cellene med DPP. Celleproliferasjon evne ble undersøkt på 0, 48 og 72 timer etter behandling. Vår Resultatet viste at knockdowning ATG-5 ikke påvirke celledeling i SGC7901 /DPP celler sammenlignet med kontroll siRNA (siRNA NC). DPP behandling alene svakt hemmet proliferasjonen av cellene. Interessant, da vi knockdown ekspresjonen av ATG-5 og behandles cellene med DPP samtidig, celleformering evnen til ble ytterligere undertrykt sammenlignet med celler behandlet med DPP alene, 48 og 72 timer etter behandlingen (figur 4 C). Våre data støtter videre at ATG-5 bidrar til den legemiddelresistente av GC-celler.
(A) mRNA-nivået av ATG-5 ble påvist ved sanntids-PCR etter behandling med sirnas. GAPDH ble benyttet som intern kontroll. (B) Proteininnholdet av ATG-5 ble påvist ved western blot etter behandling med sirnas. β p-aktin ble benyttet som intern kontroll. (C) Evnen spredning ble testet ved hjelp av MTT-analyse 48 timer eller 72 timer etter annen behandling.
Autophagy var involvert i legemiddelresistente DC celler
Som ATG-5 er en sentral regulator av autofagi, spekulerte vi at autofagi kan være involvert i legemiddelresistente av GC-celler. Slik at vi brukte 3mA, som er en autophagy inhibitor, for behandling av medikament-resistente celler. Som forventet fant vi at 3mA sammen med DPP behandling hadde en lignende effekt med ATG-5 kncokdown sammen med DPP behandling (Figur 4C og 4D). Dataene viser at autofagi bidrar til legemiddelresistent. Deretter undersøkte vi om autofagi ble endret under behandlingen. Vi brukte Immunofluorescens-analyse for å påvise ekspresjon LC3B nivå, som er en autophagy markør i cellene. Våre data viser at autofagi ble undertrykket etter stanse ATG-5 eller behandle cellene med 3mA (figur 5A). Og western blot resultatet ytterligere bekreftet at LC3A /B protein uttrykk ble bare berørt i celler behandlet med siRNA-ATG5 eller 3mA. Følgelig celleproliferasjon ble ytterligere inhibert bare når autofagi ble inhibert (figur 4 og figur 5). Derfor våre data viste at ATG-5 var involvert i legemiddelresistente av DC-celler, som ble hovedsakelig gjennom påvirke autofagi av kreftcellene.
(A) autofagi ble oppdaget av immunfluorescens analyse av LC3B i cellene 48 timer etter annen behandling. (B) De proteinnivåer LC3A og LC3B ble undersøkt ved western blot. β-actin ble brukt som intern kontroll.
Diskusjoner
GC er fortsatt en av de hyppigste maligne svulster på global basis på tross av sin fallende insidens og det totale antallet er spådd å kontinuerlig øke som følge av befolkningsvekst. I menn, rangerer GC den andre i dødelighet; hos kvinner, er det den fjerde i dødelighet [24], [25]. Den rå dødelighet på GC i Kina var 25,2 per 100 000 [26]. I vår studie, undersøkte vi uttrykket av ATG-5 og MRP-en i en kohort av GC pasienten etter kjemoterapi. Deretter viste vi at ATG-5 ble oppregulert i cisplatin (DDP) resistente cellelinje. Videre, etter ATG-fem uttrykk eller aotophogy ble hemmet, ble kreftcellene sensibilisert for DPP behandling. Våre resultater gir ny innsikt i mekanismen av kjemoresistent i GC progresjon.
Vi har evaluert exression profilen til ATG-5 og MRP-en i 135 kinesiske GC pasienter. I en avtale med tidligere rapport [22], våre resultater viser at en høy prosentandel av GC vev uttrykt ATG-5, og ATG-5-ekspresjon ble statistisk forbundet med dybden av vegg invasjon, fjern metastase og TNM stadier av GC. Disse funnene støtter en forestilling om at høyt uttrykk nivå av ATG5 kan bidra til, viss grad, en mer aggressiv og ondartet fenotype i GC. Dette synspunktet er videre støttet av vår oppdagelse av sammenhengen mellom høyere ATG5 uttrykk i GC og dårligere prognose av pasientene (se mer diskusjon nedenfor). Enda viktigere, identifiserte vi en positiv sammenheng mellom ATG-5 og MRP1 uttrykk i vår GC kohort. Tatt i betraktning det faktum at MRP1 er en ABC transtransportproteinet godt kjent for å fremme MDR fenotypen i GC, er det rimelig å foreslå at ATG-5 kan også innblandet i overdragelse GC chemoresistance gjennom visse ukjente molekylære mekanismer.
det er allment akseptert at tilbakefall og metastasering er to store hindringer i vårt arbeid med å forbedre lav OS og DFS overlevelse på GC. Chemoresistance fortsatt en av de viktigste årsakene som fører til svulsten repopulation /tilbakefall etter behandling. Aktuelle alternativet for individuell behandling vil være utvilsomt gunstig å forbedre kliniske utfall; likevel, er nåværende behandling avgjørelse mest avhengig av TNM stadier [27], [28]. Vår overlevelse analyser i de 135 GC pasienter med stadium IB til IV svulster viste at både ATG-5 og MRP-en uttrykk var i stand til selvstendig å forutsi OS og DFS etter behandling med adjuvant ECF kjemoterapi, noe som tyder på at overvåking sine uttrykk nivåer i kombinasjon konvensjonelle prognostiske markører kan gi oss ekstra verdifull informasjon for en bedre evaluering av kjemoterapi effekt i GC pasienter. Interessant, fant vi ATG-5 ble overexpressed i legemiddelresistent GC cellelinjer. Og stanse ATG-5 kan sensitivisert stoffet resistente cellene til cellegift igjen. Våre data antyder at ATG-5 kan være et mål for kjemoresistent paitents.
Akkumulerende bevis har antydet at autofagi er i stand til å utløse både celleoverlevelse og celledød under forskjellige sammenhenger. Liu et al rapporterte at gjennom hemming av PI3K /Akt /mTOR vei, kunne β-elemene indusere beskyttende autofagi å bistå GC celler bedre tilpasse seg stressende forhold og beskytte dem fra gjennomgår apoptose død [29]. Videre har nyere studier vist at PI3K /Akt /mTOR signalveien er ofte aktivert i gastrointestinale maligniteter menneskelige [30]. Den PI3K /Akt signal modulerer også MDR i GC cellen gjennom regulering av p-glykoprotein, BCL2 og Bax [31]. Likeledes har noen anticancermidler blitt rapportert å hemme mTOR signalering og indusere autophagy i kreftceller ved å nedbryte mange viktige komponenter i de mTOR aksen [14], [32]. Samlet disse data tyder på at autofagi kan bli indusert ved kjemoterapi, og undertrykkelse av autophagic trasé ved hjelp av autofagi inhibitor ha potensial til å forbedre den kjemoterapeutiske effekten i GC pasienter med ATG-5 høy ekspresjon. Til støtte, har vi funnet at når autofagi ble hemmet, ble stoffet resistente celler også sensitivisert til behandling igjen som stanse ATG-fem uttrykk. Så, vår resultat støtte som autofagi bidrar til kjemoresistent i pasienten.
I sammendraget, over-uttrykk for ATG-5, en viktig molekylær spiller av autophagic veien, er assosiert med chemoresistance i GC. Ekspresjon av ATG-5 og MRP-1 kan anses som uavhengige prognostiske markører for å forutsi OS og DFS av GC pasienter som er basert på for tiden oppnådde data. På grunnlag av TNM stadier, kan påvisning av sine uttrykk nivåer være av klinisk betydning for bedre prediksjon av kjemoterapeutiske behandlingsresultatene hos pasienter som lider av denne ondartede sykdommen. Fremtidige studier med vurdering av et større antall tilfeller, helst fra en annen etnisk bakgrunn, er definitivt garantert til å bekrefte våre funn i denne studien.
