Abstract
Epidemiologiske studier har vist at regelmessig bruk av ikke-steroide anti-inflammatoriske (NSAID) legemidler er assosiert med en redusert risiko for ulike kreftformer. I tillegg har in vitro og eksperimenter i musemodeller har vist at NSAID reduksjon tumor initiering og /eller progresjon av mange kreftformer. Men det er begrenset prekliniske studier som undersøker effekten av NSAIDs i eggstokkreft. Her har vi studert effekten av to NSAIDs, diklofenak og indometacin, i eggstokkreft cellelinjer og i en xenograft mus modell. Diclofenac og indometacin behandling redusert cellevekst ved å indusere cellesyklus og apoptose. I tillegg diclofenac og indometacin redusert tumorvolum i en xenograft modell av kreft i eggstokkene. For å identifisere mulige molekylære stier medierende effekten av NSAID behandling i eggstokkreft, utførte vi microarray analyse av eggstokkreft celler behandlet med indometacin eller diklofenak. Interessant, flere av genene som ble funnet nedregulert følgende diclofenac eller indometacin behandling er transkripsjonelle målgener av E2F1. E2F1 ble nedregulert på mRNA og proteinnivå ved behandling med diklofenak og indometacin, og overekspresjon av E2F1 reddet celler fra veksthemmende virkninger av diklofenak og indometacin. Som konklusjon, NSAIDs diclofenac og indometacin utøve en anti-proliferativ effekt in ovarian cancer in vitro og in vivo, og effekten av NSAID kan være mediert delvis ved nedregulering av E2F1
relasjon:. Valle BL, D «Souza T, Becker KG, Wood WH III, Zhang Y, Wersto RP, et al. (2013) ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler Reduser E2F1 Expression og hemme cellevekst i eggstokkreft celler. PLoS ONE 8 (4): e61836. doi: 10,1371 /journal.pone.0061836
Redaktør: Resham Bhattacharya, Mayo Clinic, USA
mottatt: 18 januar 2013; Godkjent: 25 februar 2013; Publisert: 24 april 2013
Copyright: © 2013 Valle et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet helt av egenutført Research Program av National Institutes of Health, National Institute on Aging. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den ledende dødsårsaken ved gynekologiske kreftformer. Når oppdages tidlig, er det 5-års overlevelse så høy som 90%, men dessverre er de aller fleste tilfeller diagnostisert så sent stadium sykdommen, som ofte er resistent mot konvensjonell kjemoterapi. Følgelig, den samlede fem års overlevelse for eggstokkreft er ca 30-40%. Det er derfor viktig å undersøke nye tilnærminger for behandling og håndtering av denne dødelige sykdommen.
Epidemiologiske studier har antydet at regelmessig bruk av ikke-steroide antiinflammatoriske (NSAIDs) legemidler er assosiert med en redusert risiko for ulike kreftformer, inkludert kolorektal, bryst, lunge og eggstokk-kreft [1], [2], [3]. I tillegg kan in vitro og dyrestudier har vist at NSAID kan redusere initiering og /eller progresjon av flere krefttyper [4], [5], [6]. For eksempel, den NSAID indometacin hemmet veksten av kjemisk-induserte kolonkreft hos rotter [7], [8]. I tillegg, indometacin reduserte veksten av nye og etablerte spontane mammatumorer [9]. NSAID diklofenak reduserte veksten av pankreas og ikke-småcellet lungekreft xenotransplantater [10], [11]. Men det er begrenset prekliniske studier som undersøker effektene og virkningsmekanismer av diklofenak og indometacin i eggstokkreft [12], [13]. I denne forbindelse, Zerbini et. al. rapporterte at diklofenak redusert tumorvolum i SCID-mus med eggstokkreft celle SKOV-3-xenografter med ~ 20% [12]. Men en annen studie rapporterte at indometacin hadde ingen effekt på veksten av eggstokkreft retikulære celle sarkom M5076 [13].
Så vidt vi vet er det ingen rapporter om virkningene av indometacin spesielt i epitelial eggstokkreft, som består av de fleste av ovariekreft (ca. 90%). I denne studien, har vi undersøkt effekten av NSAIDs diklofenak og indometacin i eggstokkreft celler. Vi rapporterer at NSAID betydelig redusert ovarian cancer cellevekst in vitro og in vivo, og, ved hjelp av microarray analyse identifiserte vi transkripsjonsfaktor E2F1 som en formidler av denne effekten. Viktigere vi funnet at ektopisk E2F1 uttrykk reverseres veksthemmende effekter av NSAIDs som tyder på at NSAIDs kan handle blant annet gjennom en mekanisme som involverer E2F1 downregulation i eggstokkreft celler.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Alle prosedyrer utført i mus ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité i National Institute on Aging. Denne studien ble utført i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health.
Reagenser
Diclofenac og indometacin ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis , MO). Anti-E2F1, anti-E2F4, anti-MCM2, og anti-MCM4 antistoffer ble kjøpt fra Proteintech (Chicago, IL). Antistoffer fra Abcam (Cambridge, MA) anerkjent GAPDH, og antistoffer fra Cell Signaling (Danvers, MA) anerkjent Rb. E2F1 og EGFP uttrykk plasmider var fra GeneCopoeia (Rockville, MD). Rb siRNA (sc-29468) var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California).
Cellekultur og trans
serøs eggstokkene adenokarsinom cellelinjer HEY, OVCAR5 og UCI-101 var vennlig gitt som følger: Hey celler ved Dr. Robert C. Bast [14], OVCAR5 celler ved Dr. Thomas C. Hamilton [15] og UCI-101 celler ved Dr. Michael J. Birrer [16]. Celler ble dyrket i McCoys 5A kulturmedium supplert med 10% føtalt bovint serum og Pen /Strep (100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin), og inkubert ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO
2 . Alle forsøkene ble utført i seruminneholdende medium
For transfeksjoner ble HEY cellene sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
4-celler i 12-brønners plater og transient transfektert med E2F1 eller EGFP som kontroll.; eller Rb siRNA eller kontroll siRNA i 24 timer, ved hjelp av X-treme Gene 9 DNA Transfeksjon Reagens (Roche) eller Lipofectamine 2000 (Invitrogen), i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene ble deretter utsådd med en tetthet på 5 x 10
3-celler i 6-brønns plater og behandlet i 24-48 timer med 300 pM diclofenac eller indometacin. Cellene ble deretter lysert og analysert ved immunoblotting eller vaskes og brukes i klonogene analyser.
MTS og klonogene analyser
For MTS levedyktighet analyser (Promega), HEY, OVCAR5 eller UCI-101 celler ble sådd ved en tetthet på 7 x 10
3-celler i 96-brønners plater og behandlet i 48 timer med 300 pM diclofenac eller indometacin. Cellene ble deretter inkubert med MTS reagenser og absorbansen ved 490 nm ble målt etter 1-4 timers inkubasjon ved 37 ° C. For dose-avhengighets levedyktighet analysene ble celler behandlet i 24 timer med økende konsentrasjoner av diclofenac eller indometacin (50, 100, 250, og 500 uM). For klonogene analyser, HEI, OVCAR5 eller UCI-101-celler ble sådd ut ved en tetthet på 3 x 10
3-celler i 6-brønns plater og behandlet i 48 timer med 300 uM diclofenac eller indometacin, ble vasket og fikk vokse i 10 dager. Kolonier ble deretter visualisert ved farging med krystallfiolett (0,5% krystallfiolett i 50% metanol).
cellesyklus og apoptose analyse
og behandlet i 24 eller 48 timer med 300 uM diclofenac eller indometacin . Celler ble merket med propidiumjodid og analysert på en FACS Kaliber Flowcytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). For analyse av apoptose, ble cellene behandlet i 48 eller 96 timer med 300 pM diclofenac eller indometacin. Apoptose og DNA innhold ble analysert ved BrdU og propidiumjodidfarging ved hjelp av en Apo-BrdU kit (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA) og analysert i en LSR-II Flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, California).
Dyrestudier studier~~POS=HEADCOMP
Kvinner 7-8 ukers atymiske nakne mus ble hentet fra Harlan Laboratories (Frederick, MD) og alle forsøk ble gjennomgått og godkjent av NIA IACUC.
HEY celler ( 1,5 x 10
6) ble injisert subkutant i begge flanker av nakne mus. For diklofenak undersøkelsen ble musene tilfeldig delt inn i 2 grupper: Kontroll (PBS) eller diklofenak (18 mg /kg); 6 mus per gruppe. Mus ble injisert intraperitonealt to ganger i uken i 4 uker med start 3 dager etter celleinjeksjon. Tumorer ble målt to ganger i uken, med start i uke 1, ved hjelp av calipers og W
2 l /2 [17] ble brukt til å beregne tumorvolumet. For indometacin studien, ble mus randomisert i 2 grupper: kontroll (vann) eller indometacin (2,5 mg /kg); 5 mus per gruppe. Indometacin ble gitt daglig i drikkevann i 6 uker, og starter dagen etter celleinjeksjon. Tumorer ble målt to ganger i uken, med start ved uke 3, ved hjelp av calipers og W
2 l /2 [17] ble brukt til å beregne tumorvolumet. Data blir representert som gjennomsnitt ± standardfeil. Konsentrasjonene av diclofenac og indometacin anvendt for denne studien er lik den andre som tidligere er blitt vist å være effektive og godt tolerert hos mus [4], [10], [11], [18].
microarray analyse
HEY, OVCAR5 og UCI-101 celler ble sådd i 60 mm skåler og behandlet i 24 timer med 300 mikrometer diclofenac eller indometacin. RNA ble isolert ved anvendelse av RNeasy-sett (Qiagen, Valencia, CA). Total RNA ble brukt til å generere biotin merket cDNA ved hjelp av Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion, Grand Island, New York) og analysert ved Illumina mikromatriser (Illumina er Sentrix HumanRef-8 Expression BeadChips) i microarray kjernen Facility (National Institute on Aging). Hver BeadChip har 24.000 godt kommenterte RefSeq utskrifter med et gjennomsnitt på 30-fold redundans. Gener som var uttrykt forskjellig to-ganger eller mer i alle tre cellelinjer ble identifisert og en undergruppe av disse genene valgt for videre analyse. Den microarray data har blitt sendt til NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) database (Tiltredelse antall GSE45052).
Real-Time RT-PCR
HEY, OVCAR5, og UCI-101 cellene behandlet i 24 timer med 300 uM diclofenac eller indometacin. RNA ble isolert ved anvendelse av RNeasy kit og 1 ug total RNA ble anvendt for å danne cDNA ved anvendelse av TaqMan revers transkripsjon Reagenser (PE Applied Biosystems). For PCR forsterkning og kvantifisering, den SYBR Grønn jeg analysen og GeneAmp 7300 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems) ble brukt. Den komparative CT-metoden ble brukt for å bestemme den relative ekspresjonsnivået av gener i hvert NSAID behandlede prøve til CT-verdien for ubehandlet prøve (PE Applied Biosystems) og GAPDH-verdier ble anvendt for å normalisere [19]. Sekvensene til primerne er tilgjengelige fra forfatterne.
Immunoblotting
Cellene ble vasket og cellelysatene ble fremstilt i lyseringsbuffer (150 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25% glycerol, og 5% SDS). Cellelysater ble separert ved SDS-PAGE på 4-12 eller 10-20% Tris-glysingeler og overført til PVDF-membraner. Membranene ble blokkert med TBS-T + 5% fettfri tørrmelk og inkubert over natten ved 4 ° C med antistoffer som er spesifikke for de angitte proteiner. Etter vasking av membranene, ble de inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer. Protein påvisning ble utført av forsterket kjemiluminescens (Amersham, Pittsburgh, PA).
statistikker
Wilcoxon signert rank test ble utført for å bestemme betydning i musestudier. For alle andre analyser, ble en-veis ANOVA og Dunnetfs multiple sammenligningstest utført. Alle statistiske analyser ble gjort ved hjelp av grafen Pad Prism 3 programvare.
Resultater
NSAIDs nedgang levedyktighet av eggstokkreft celler i en doseavhengig måte
For å avgjøre om NSAIDs kan redusere veksten av eggstokkreft celler in vitro, behandlet vi cellelinjene HEY, OVCAR5, og UCI-101 med NSAIDs diklofenak og indometacin. Etter 48 timers behandling, diklofenak og indometacin redusert antall celler med mer enn 50% i de behandlede cellelinjer i forhold til ubehandlede populasjoner i tre forskjellige ovarie cancer-cellelinjer (figur 1A). Effektene av disse NSAID var doseavhengig, ettersom økende konsentrasjoner av diclofenac eller indometacin ytterligere redusert antall av levedyktige celler (figur 1B). I tillegg diclofenac og indometacin redusert kolonidannende evne av eggstokkreft celler (figur 1C).
A) HEI, OVCAR5 eller UCI-101-celler ble behandlet i 48 timer med 300 pM diclofenac eller indometacin. Cellene ble deretter inkubert med MTS reagenser og absorbansen ved 490 nm ble målt etter 1 time inkubering ved 37 ° C. Gjennomsnittet av 3 eksperimenter er vist. Statistisk signifikans er representert som følger: * p 0,05 og *** p 0,001. B) Cellene ble behandlet i 24 timer med de angitte konsentrasjoner av diclofenac eller indometacin. Cellelevedyktigheten ble målt ved anvendelse av en MTS-analyse. Gjennomsnittet av 3 eksperimenter er vist. Statistisk signifikans er representert som følger: * p 0,05 og *** p 0,001. C) Cellene ble behandlet i 48 timer med 300 pM diclofenac eller indometacin, ble vasket og fikk vokse i en total av 7 til 14 dager. Cellene ble deretter farget med krystallfiolett. Bildet som vises er representative for 3 forsøk.
Diclofenac og Indometacin fremme cellesyklus og apoptose i eggstokkreft celler
Siden diclofenac og indometacin redusert eggstokkreft cellevekst, ønsket vi å finne ut om denne nedgangen skyldes endringer i cellesyklusen. Diklofenak og indometacin-indusert cellesyklusarrest i alle 3 eggstokk-kreft-cellelinjer undersøkt, som detektert ved propidiumjodidfarging etter 48 timers behandling (figur 2A). De to NSAID hadde forskjellige virkninger på cellesyklus, som diklofenak induserte en akkumulering av celler i S-fasen og G2, mens indometacin-indusert G1 arrest i alle tre eggstokk-kreft-cellelinjer undersøkt. Vi har også observert en sub-G1 populasjon av celler i UCI-101-celler behandlet med diclofenac og indometacin og i HEI celler behandlet med indometacin, noe som antyder økt apoptose. For å finne ut om disse cellene gjennomgår apoptose ved behandling med NSAIDs, behandlet vi cellene med diclofenac eller indometacin i 48 eller 96 timer og målt DNA fragmentering av Apo-BrdU flekker. Som vist i figur 2B, UCI-101 celler som gjennomgår apoptose etter behandling med både steroide antiinflammatoriske midler, mens HEI-celler gjennomgår apoptose bare med indometacin (figur 2B). OVCAR5 gjennomgår apoptose etter 4 dager med behandling med NSAIDs. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at NSAIDs redusere eggstokkreft cellevekst ved å indusere cellesyklus og apoptose.
A) HEY, OVCAR5 og UCI-101 celler ble behandlet i 24 timer med 300 mikrometer diclofenac eller indometacin. Celler ble merket med propidiumjodid og analysert på en FACS Kaliber Flowcytometer. Bildet som vises er representative for 4 eksperimenter. B) Cellene ble behandlet i 48 eller 96 timer med 300 pM diclofenac eller indometacin. Apoptose og DNA-innhold ble analysert ved BrdU og propidiumjodidfarging ved hjelp av Apo-BrdU kit. Celler i øvre kvadrant boks (P3 gate) representerer apoptotisk befolkningen.
NSAIDs redusere veksten av HEY transplantater i hårløse mus
For å avgjøre om NSAIDs kan hemme tumorvekst in vivo, vi brukes en eggstokkreft xenograft musemodell i nakne mus. HEI celler ble injisert subkutant i begge flanker av nakne mus og randomisert i 2 grupper: Kontroll (PBS) eller diklofenak (18 mg /kg) injisert intraperitonealt to ganger i uken, i 4 uker. Som observert, diklofenak behandling reduserte signifikant (p = 0,016) veksten av HEI xenotransplantater i nakne mus (figur 3A). Den gjennomsnittlige tumorvolumet i den diclofenac-behandlet gruppe ble redusert med 33%, sammenlignet med kontrollgruppen. Alternativt, ble musene tilfeldig delt inn i kontroll (vann) eller indometacin (2,5 mg /kg) gruppene, og medikamentet administreres daglig i drikkevann i 6 uker. Som observert, indometacin signifikant (p = 0,031) reduserte veksten av HEI xenotransplantater i nakne mus (figur 3B). Den gjennomsnittlige tumorvolum var signifikant redusert med 22% i gruppen som ble behandlet med indometacin sammenlignet med kontrollgruppen. I tillegg mus i indomethacin behandlede gruppe utviklet tumorer færre enn kontrollgruppen, henholdsvis 5 og 9. Tatt sammen indikerer disse resultater at NSAID redusere eggstokkreft cellevekst in vivo.
HEI-celler (1,5 x 10
6) ble injisert subkutant i begge flanker av nakne mus. A) Musene ble randomisert i 2 grupper: kontroll eller diklofenak (18 mg /kg). Behandlingen ble startet tre dager etter celleinjeksjon, og ble administrert intraperitonealt to ganger i uken i 4 uker. Tumorer ble målt to ganger i uken, med start ved uke 1. kontrollgruppen (bare PBS) besto av seks mus som utviklet 12 tumorer i total; diklofenak gruppen (18 mg /kg) besto av 6 mus som utviklet totalt 11 tumorer. Verdier representerer betyr ± standardfeil. Statistisk signifikans er representert som * p 0,05. B) Musene ble randomisert i 2 grupper: kontroll eller indometacin (2,5 mg /kg). Behandlingen ble startet dagen etter celleinjeksjon, og ble gitt daglig i drikkevann i 6 uker. Tumorer ble målt to ganger i uken, med start ved uke 3. kontrollgruppen (bare vann) bestod av 5 mus som utviklet 9 tumorer i total; den indometacin gruppe (2,5 mg /kg) besto av 5 mus som utviklet en total av 5 tumorer. Verdier representerer betyr ± standardfeil. Statistisk signifikans er representert som * p. 0,05
E2F1 og målgener er nedregulert i celler behandlet med NSAIDs
For å undersøke genene forskjellig uttrykt i eggstokkreft celler etter behandling med NSAIDs vi behandlet HEY, UCI-101, og OVCAR5 celler med diklofenak og indometacin i 24 timer og gjennomføres microarray analyse. De differensielt uttrykte mRNA (≥2-fold) i de tre cellelinjer er vist (figur 4A). En liten undergruppe av differensielt uttrykte mRNA ble delt mellom de tre cellelinjer, og et lite antall differensielt uttrykte mRNA ble delt ved behandling med diklofenak og indometacin i alle tre cellelinjer.
HEI, OVCAR5 og UCI-101 cellene ble behandlet i 24 timer med 300 pM diclofenac eller indometacin. A) RNA ble analysert ved Illumina mikromatriser. Antallet av mRNA som ble differensielt uttrykte to ganger eller mer i alle tre cellelinjer er indikert for diclofenac og indometacin behandlinger (vist med uthevet skrift er de overuttrykte mRNAer, som er vist i vanlig skrift er det downregulated mRNA). B) RNA fra de angitte cellelinjer som behandles med diklofenak eller indometacin ble analysert ved real-time RT-PCR. E2F1 og E2F4 mRNA-nivåer er uttrykt som ganger endring i behandlede prøver sammenlignet med den ubehandlede, etter normalisering med GAPDH. Gjennomsnittet av 3 eksperimenter er vist. Statistisk signifikans er representert som *** p 0,001. C) Cellelysater av de angitte cellelinjer som ble behandlet med diclofenac eller indometacin ble analysert ved immunblotting med antistoffer som er spesifikke for de angitte proteiner. GAPDH ble anvendt som proteinlastekontroll.
Flertallet av mRNA differensielt uttrykt ved behandling med diklofenak ble funnet å bli nedregulert, mens de fleste av gener som påvirkes av indometacin ble oppregulert. Gitt at diklofenak og indometacin indusert cellesyklus og apoptose, vi valgte for validering gener muligens involvert i disse prosessene. Vi bekreftet av kvantitativ RT-PCR, som uttrykk for
MCM2
,
MCM4
, og andre mRNA koder for proteiner involvert i DNA replikasjon og cellesyklusregulering ble nedregulert av diklofenak (tabell 1), mens
GADD45A Hotell og
PPP1R15A
mRNA, blant andre koder apoptose-relevant proteiner, ble oppregulert ved indometacin og av diklofenak (tabell 1). I tillegg bekreftet vi mRNA oppregulert etter indometacin kodende oppløst stoff bærerproteiner SLC1A5 og SLC7A1 (tabell 1). Men mRNA som viste differensial uttrykk nivåer bare av diklofenak eller indometacin i microarray analyse, ble funnet forskjellig uttrykt av både narkotika når analysert ved RT-qPCR (tabell 1).
Å identifisere transkripsjonsfaktorer som kan regulere differensial uttrykk for disse mRNA ble transkripsjonsfaktor mål analyse utført ved hjelp WebGestalt. WebGestalt (WEB-basert genet satt analyse Toolkit) er et nettbasert verktøy (https://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/) for å analysere gensettene og transkripsjonsfaktoren målet analyseprogram for WebGestalt spår transkripsjonsfaktorer sannsynlig involvert i reguleringen av disse genene. Tabell S1 viser de signifikante transkripsjonsfaktorer spådd, sammen med de tilsvarende forskjellig uttrykte gener identifisert av microarray. E2F1, nukleær faktor Y og E2F4 var de beste transkripsjonsfaktorer spådd å regulere genene forskjellig uttrykt ved behandling med diklofenak, og de tilsvarende mRNA ble nedregulert. NFAT og AP1 var de to øverste transkripsjonsfaktorer spådd å regulere gener påvirkes av indometacin, og mRNA som koder for disse proteinene var for det meste oppregulert.
For å avgjøre om NSAIDs hatt en effekt på uttrykk for transkripsjonsfaktorer identifisert ovenfor vi undersøkte mRNA og protein nivå til transkripsjonsfaktorer E2F1, NFY, E2F4, NFAT og AP1. Etter avtale med trenden rapportert ovenfor,
E2F1
mRNA ble nedregulert i de tre eggstokkreft cellelinjer etter behandling i 24 timer med diclofenac eller indometacin, og spesielt i HEY celler (figur 4B). E2F1 protein ble også nedregulert, samt MCM2 og MCM4 proteiner (Figur 4C).
NFAT Hotell og
AP1
mRNA ble stort sett oppregulert (tabell S2), som var deres transkripsjons mål. Men NFAT og AP1 protein overflod var lavere (figur S1), til tross for viser høyere mRNA nivåer. Nivåene av
NFY Hotell og
E2F4
mRNA ble ikke vesentlig endret (figur 4B og Tabell S2).
E2F1 overekspresjon øker overlevelsen av NSAID-behandlet eggstokkreft celler
Siden uttrykk for både E2F1 og dets mål gener er nedregulert ved behandling med diklofenak og indometacin, ønsket vi å finne ut om E2F1 var involvert i den veksthemmende effekten av NSAIDs i eggstokkreft celler. Vi overexpressed E2F1 i HEY celler (figur 5A) og observert en økt overlevelse etter behandling med diklofenak og indometacin (figur 5B). Dette forsøk tyder på at nedregulering av E2F1 kan være involvert i inhibisjon av cellevekst av NSAIDs.
A) HEI celler ble transient transfektert med E2F1 eller EGFP som en kontroll og behandlet i 24 timer med 300 pM diclofenac eller indometacin. Cellelysater ble analysert ved immunblotting med de angitte antistoffer. B) HEI celler ble transient transfektert med E2F1 eller EGFP som en kontroll og behandlet i 48 timer med 300 pM diclofenac eller indometacin. Cellene ble deretter vasket og tillatt å vokse og farget med krystallfiolett. Bildet som vises er representative for 2 forsøk. C) HEY-celler ble behandlet i 24 timer med 300 pM diclofenac eller indometacin. Cellelysater ble analysert ved immunblotting. D) HEY-celler ble transfektert med Rb siRNA og behandlet i 24 timer med diclofenac eller indometacin. Cellelysater ble analysert ved immunblotting. E) HEI-celler ble transfektert med Rb siRNA og behandlet i 48 timer med 300 pM diclofenac eller indometacin, Cellene ble deretter vasket og tillatt å vokse og farget med krystallfiolett. Bildet som vises er representative for 3 forsøk.
Retinoblastoma protein (Rb) blokker cellecyklusprogresjonen ved å hemme E2F1 og blokkerer påfølgende transcriptional aktivering av gener som er viktige for inntreden i S-fasen. Vi har funnet at nivået av fosforylert Rb ble redusert ved behandling med NSAID (figur 5C), som indikerer Rb aktivering. Derfor søkte vi å nedregulere uttrykket av Rb å ytterligere undersøke om E2F1 var involvert i effektene av NSAIDs (figur 5D), som stanse Rb ved hjelp av små interfererende (si) RNA bør etterligne aktiveringen av E2F1. Behandling med Rb siRNA økt overlevelse av HEI celler behandlet med diklofenak og indometacin (figur 5E), hvilket antyder at E2F1 inhibering eller nedregulering kan være involvert i veksthemmende effekt av NSAID i disse cellene.
diskusjon
i denne studien har vi evaluert effekten av NSAIDs diklofenak og indometacin i eggstokkreft celler og en mus xenograft modell. Så vidt vi vet er det ingen rapporter om virkningene av indometacin in vivo i epitelial eggstokkreft. Her rapporterer vi at indometacin sunket betraktelig vekst av HEY xenografter med 22% i nakne mus, noe som tyder på at indometacin kan redusere progresjon av eggstokkreft in vivo. I tillegg rapporterer vi at diklofenak betydelig redusert vekst av HEY xenografter. Dette er konsistent med en fersk studie rapporterer at diklofenak reduserte veksten av eggstokkreft celle Skov-3 xenografter [12]. Selv om våre resultater er enige i vår studie fant vi en litt bedre effekt av diklofenak (33% sammenlignet med 20%) og effekten var merkbar tidligere (etter 4 ukers behandling vs 8 uker). Dette kan skyldes delvis forskjeller i modus for levering (ip vs i kosten). Tatt sammen demonstrerer våre data at disse steroide antiinflammatoriske midler har veksthemmende effekter in vivo.
Indomethacin og diclofenac har vist seg å indusere cellesyklus og apoptose i flere kreftcelletyper [12], [20], [21 ], [22], [23], [24]. I vår studie, indometacin og diclofenac redusert eggstokkreft cellevekst, i det minste delvis gjennom induksjon av cellesyklusarrest i de tre eggstokk-kreft-cellelinjer undersøkt. Diclofenac og indometacin hadde ulike effekter på cellesyklus, mens indometacin induserte en G1 arrest, diklofenak indusert en opphopning av celler i S-fasen og G2 arrest. Resultatene av indometacin er i overensstemmelse med tidligere studier som indomethacin har også blitt rapportert å indusere G1 arrest i en rekke celler [20], [21], [22], [25]. Imidlertid har bare to tidligere studier rapporterte effekter av diklofenak på cellesyklusen: i glatte muskelceller, diklofenak indusert G1 rest [22], mens i murine gliomceller diclofenac induserte G2 rest [26]. I vår studie, diklofenak indusert en opphopning av celler i S-fasen og G2 arrest.
For å møte den forskjellen vi observerte i cellesykluseffekter mellom diklofenak og indometacin, forsøkte vi å identifisere forskjeller i genekspresjon etter behandling med hver legemiddel. Blant de mRNAer validert ved RT-qPCR, har vi funnet at de fleste av genene forandret av diklofenak behandling ble også uttrykt forskjellig i de indometacin-behandlede celler. Derfor er videre studier av disse genene garanteres å bestemme hva som forårsaker forskjeller i cellesyklus virkninger ved diclofenac og indometacin.
WebGestalt transkripsjonsfaktoranalyse av gener differensielt uttrykte av diclofenac og indometacin spådd at flere av genene downregulated av diklofenak målgener av E2F1. E2F1 er en transkripsjonsfaktor som regulerer cellesyklusen, ved å regulere ekspresjon av gener som er nødvendige for inntreden i S-fasen. E2F1 er overuttrykt i en rekke kreftformer, og dets overekspresjon er vanligvis assosiert med en dårlig prognose [27], [28], [29], [30]. Hos kvinner med eggstokkreft har overekspresjon av E2F1 blitt assosiert med redusert sykdomsfri overlevelse og redusert total overlevelse [31], [32]. I tidligere studier ble det nedregulering av ekspresjon og /eller aktivitet av E2F1 ved NSAIDs antas å bidra til vekst-inhibitorisk effekt av NSAID [20], [33], [34], [35], [36], [37 ]. Det har blitt rapportert at aktiviteten av E2F1 blir nedregulert ved NSAIDs celecoxib og sulindac [20]. I den samme studien, gjorde indometacin ikke redusere aktiviteten av E2F1 i hodet og nakken plateepitel karsinom cellelinje UM-SCC-en. Her rapporterer vi at E2F1 ble nedregulert på mRNA og protein nivå i de tre eggstokkreft cellelinjer undersøkt ved behandling med diklofenak og indometacin. Overekspresjon av E2F1 i HEY celler reddet celler fra anti-proliferative effekter av NSAIDs fører til økt overlevelse, noe som tyder på at E2F1 formidler delvis effektene av NSAIDs. Disse resultatene tyder på at bruk av NSAIDs kan være terapeutisk relevant, spesielt for en undergruppe av ovariekreft overekspresjon E2F1, og som er forutsagt til å ha en dårlig prognose.
Blant de transkriptene differensielt uttrykt i diclofenac- og indometacin behandlede celler var
MCM2
,
MCM4
,
PCNA Hotell og
RRM2
mRNA, alle av dem målene for E2F1 og viktig for replikering og cellesyklus progresjon. Nylig ble det rapportert at RRM2, PCNA og MCM2 ble nedregulert ved behandling med NSAID NS-398 i kreft i bukspyttkjertelen celler [38]. Nedregulering av MCM2, og andre MCM proteiner hadde blitt rapportert å indusere G1 og G2 arrestasjoner [39], [40] som bidrar til celleveksthemming. Derfor er det mulig at nedregulering av disse proteinene kan bidra til den anti-proliferative effekt av NSAID i eggstokkkreftceller i vårt studium.
Som konklusjon, viser vi at diklofenak og indometacin inhibere ovarial cancer cellevekst in vitro og i en dyremodell, ved å indusere cellesyklus og apoptose. De veksthemmende virkninger av diclofenac og indometacin blir mediert delvis av en mekanisme som innebærer nedregulering av E2F1. Til sammen våre resultater støtter den oppfatning at bruk av NSAIDs kan være terapeutisk gunstig for eggstokkreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Protein nivåer av transkripsjon faktorer NFAT og AP1. HEI, OVCAR5 og UCI-101-celler ble behandlet i 24 timer med diclofenac (300 uM) eller indometacin (300 uM). Cellelysater ble analysert ved immunoblotting med antistoffer som er spesifikke for de angitte proteiner
doi:. 10,1371 /journal.pone.0061836.s001 plakater (TIF)
Tabell S1.
Transkripsjonsfaktorer spådd av WebGestalt å regulere forskjellig uttrykt gener i diclofenac og indometacin behandlede celler.
