Abstract
transkripsjonsfaktor, sink finger av lillehjernen (ZIC1), spiller en avgjørende rolle i virveldyr utvikling . Nylig, ZIC1 har også blitt funnet å delta i utviklingen av humane kreftformer, inkludert Medulloblastomas, livmorkreft, og mesenkymale neoplasmer. Imidlertid har funksjonen av ZIC1 i tykktarm kreft progresjon ikke er definert. I denne studien viser vi ZIC1 å bli brakt til taushet eller betydelig nedregulert i tykktarm kreft cellelinjer. Disse effektene ble reversert av demetylering behandling med 5-aza-2′-deoxycytidine (Aza). ZIC1 uttrykk er også betydelig nedregulert i grunnskolen kolorektal kreft vev i forhold til tilstøtende ikke-tumorvev (
p
= 0,0001). Videre er metylering av ZIC1 genpromoteren ofte detektert i primær tumorvev (85%, 34/40), men ikke i tilgrensende ikke-tumorvev. Ektopisk ekspresjon av ZIC1 undertrykker celleproliferasjon og induserer apoptose, som er forbundet med MAPK og PI
3K /Akt veier, så vel som Bcl-xl /Bad /Caspase3 kaskade. Å identifisere målet kandidater av ZIC1, ansatt vi cDNA microarray og fant at 337 gener er nedregulert og 95 gener oppregulert ved ektopisk uttrykk for ZIC1, som ble bekreftet av 10 utvalgte genekspresjon ved QRT-PCR. Til sammen våre resultater tyder på at ZIC1 potensielt kan fungere som en tumor suppressor genet, som er nedregulert gjennom arrangøren hypermethylation i kolorektal kreft
Citation. Gan L, Chen S, Zhong J, Wang X, Lam Eky, liu X, et al. (2011) ZIC1 Er downregulated gjennom Arrangøren Hypermethylation, og fungerer som en tumorsuppressorgen i tykktarmskreft. PLoS ONE 6 (2): e16916. doi: 10,1371 /journal.pone.0016916
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 10 oktober 2010; Godkjent: 03.01.2011; Publisert: 15 februar 2011
Copyright: © 2011 Gan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av National Natural Scientific Foundation of China (30900676), Stiftelsen Natural Scientific i Zhejiang-provinsen i Kina (Y206280), og Institutt for vitenskap og teknologi i Zhejiang-provinsen i Kina (2009C03012-3). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje vanligste kreftformen, så vel som den tredje største årsaken til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. Den sekvensielle akkumulering av genetiske og epigenetiske forandringer fører til transformasjon av normale kolonepitelet til kolorektal kreft [2]. Disse epigenetiske forandringer, inkludert promoter DNA metylering og histonmodifikasjonene, kan indusere inaktivering av tumorsuppressorgener (TSGs) [3] – [5]. DNA-områder beriket med CpG dinukleotider, kalt CpG øyer, kan bli hypermethylated i kreftceller og resultere i stanse av TSGs [5]. En undergruppe av CRC visning metylering av multiple gener, betegnet CpG øy methylator fenotypen (CIMP) [2], [5]. Vi og andre har tidligere funnet at økende antall TSGs inkludert APC, CDKN2A /p16, UCHL1, og TBX5 er ofte brakt til taushet gjennom arrangøren hypermethylation i CRC [2], [6] – [9]. Disse hendelsene kan oppstå i tidlig fase av CRC [9], [10], som fremhever viktigheten av arrangøren hypermethylation i tumorigenesis av CRC.
Tilhører kromosom 3q24, koder ZIC1 en C
2 H
2-type sink finger transkripsjonsfaktor som spiller en avgjørende rolle i utviklingen av neural crest og lillehjernen hos virveldyr [11] – [15]. Som sink finger transkripsjonsfaktorer, kan ZIC familie proteiner binde til GC-rik sekvens i målgener [15]. Til tross for sin rolle i neural utvikling, ble ZIC1 også funnet å delta i utviklingen av humane kreftformer, som medulloblastom, livmorkreft, og mesenkymale svulster [16] – [18]. Vi har identifisert ZIC1 som en roman kandidat TSG i magekreft [19]. For å understøtte dens rolle i kreft, kan ZIC1 fungere som en repressor av nedstrøms målet for sonisk hedgehog (Shh), BMP (benmorfogenetisk protein), og i tillegg til å spille en rolle i hakk signalveien under Nevralrøret utvikling [14], [15]. Men den biologiske betydning av DNA-metylering, og den molekylære mekanisme som ligger til grunn ZIC1 virker som en TSG i CRC er imidlertid ukjent. Her rapporterer vi at ZIC1 promoter er ofte metylert i CRC vev og tykktarmskreft cellelinjer. Ektopisk uttrykk for ZIC1 fører til celleveksthemming, og endre uttrykket av potensielle mål gener som kan spille viktige roller i kolorektal kreftutvikling. Våre resultater tyder på at ZIC1 kan potensielt fungere som en roman funksjonell tumor suppressor i CRC.
Resultater
Transkripsjonell stanse av ZIC1 er assosiert med sin promoter hypermethylation i tykktarm kreft celler
for å avgjøre om ZIC1 er brakt til taushet av arrangøren hypermethylation i tykktarmskreft, undersøkte vi uttrykket av ZIC1 mRNA i seks tykktarm kreft cellelinjer. Semi-kvantitativ RT-PCR viste at ZIC1 avskrift ble stille eller nedregulert i alle tykktarm kreft cellelinjer i forhold til normal kolon vev (figur 1A). Den demetylering behandling av Aza dramatisk restaurert uttrykk for ZIC1 mRNA i en undergruppe av tykktarmskreftceller (HCT116, HT29 og SW620) (figur 1B), impliserer at DNA metylering kan være involvert i reguleringen av ZIC1 uttrykk. Videre benyttet vi metylering spesifikk PCR (MSP) og fant at tre kolon kreft cellelinjer (HCT116, DLD1 og SW620) ble påvist med full metylering. De andre tre cellelinjer (HT29, LS180 og SW480) ble funnet med delvis metylering. Ingen metylering ble påvist i normal kolon vev (figur 1C). Dermed disse resultatene tyder på at transkripsjonen stillhet ZIC1 i tykktarm kreft cellelinjer kan være mediert av DNA promoter hypermethylation.
(A) Uttrykket av ZIC1 er forstummet eller nedregulert i tykktarm kreft cellelinjer, sammenlignet med normal kolon vev ved RT-PCR. GAPDH ble benyttet som intern kontroll. Normal kolon: Normal kolon vev. (B) ZIC1 ekspresjon er gjenopprettet i tykktarmskreftceller (HCT116, HT29 og SW620) etter behandling med demetylering middel 5-Aza ved RT-PCR. AZA: 5-aza-2′-deoxycytidine. (C) Et metylering status av ZIC1 CpG-promoteren blir detektert ved metylering-spesifikk PCR (MSP) i koloncancercellelinjer. M: metylert; U:. Unmethylated
Nedregulering og formidler hypermethylation av ZIC1 i primære kolorektal tumorer
For ytterligere å undersøke forholdet mellom ZIC1 uttrykk og formidler hypermethylation, analyserte vi ZIC1 mRNA uttrykk og CpG nettstedet metylering status i grunnskolen kolorektal svulsten og tilstøtende ikke-tumorvev med henholdsvis QRT-PCR og MSP,. Nivået av ZIC1 mRNA var signifikant redusert i de fleste tumorvev i forhold til tilstøtende ikke-tumorvev (
p
= 0,0001, n = 24) (figur 2A). I tillegg ble promoter metylering påvist i 85% (34/40) av kolorektale svulst vev, men ikke i tilgrensende ikke-tumorvev etter MSP analyse (representative data som er vist i figur 2B), noe som tyder på en tumor-spesifikk hypermethylation av ZIC1 promoteren i CRC. Men vi klarte å finne en signifikant korrelasjon mellom ZIC1 promoter metylering og kliniske egenskaper, som alder, kjønn, tumor differensiering, og TNM stadium (tabell 1).
(A) ZIC1 mRNA ble bestemt ved kvantitativ real-time PCR i tjuefire par av primære kolorektal tumorer og ifølge tilstøtende ikke-tumorvev. Dataene ble analysert ved hjelp av Wilcoxon tilpasset parvis test. (B) Den metylering status av ZIC1 promoter i primær kolorektal karsinom og tilstøtende ikke-tumorvev ble bestemt ved MSP. Representant bilde vises. T: tumorvev; N: tilstøtende ikke-tumorvev; M: metylert; U:. Unmethylated
ZIC1 hemmer spredning av kolon kreftceller
For å utforske effekten av ZIC1 på celleproliferasjon i tykktarmskreft, utførte vi celleviabilitet og kolonidannelse forsøk i CRC-cellelinjer. Først ble transfeksjonseffektiviteten av vår ZIC1 konstruksjon bekreftet ved RT-PCR og western blot i tumorcellelinjer (HCT116 og HT29) (Figur 3A). Deretter vurderte vi undertrykkende effekt av ZIC1 overekspresjon på celleproliferasjon ved celleviabilitet analysen. Som vist i figur 3B, ektopisk ekspresjon av ZIC1 signifikant inhiberte cellelevedyktigheten i HCT116 og HT29-celler (
p
0,05). Vi observerte også at antall overlevende kolonier dannet på platene ble betydelig redusert sammenlignet med kontroll vektor transfektanter (
p
0,01) (Figur 3C). I tillegg har vi vist at ektopisk ekspresjon av ZIC1 hemmet fosforylering av ERK1 /2 og Akt kinaser (figur 3D), to sentrale celle spredning spredningsveier regulatorer. Disse resultater bekreftet den undertrykkende virkning av ZIC1 på celleproliferasjon.
(A) Re-ekspresjon av ZIC i stabile transfektanter i tykktarmskreftceller (HCT116 og HT29) ble bekreftet ved RT-PCR (øvre felt) og western blot (lav kjørefelt), GAPDH og β-aktin brukt som intern kontroll. (B) Celleviabilitet analysen etter ZIC1 re-uttrykk i tykktarm cellelinjer (HCT116 og HT29). Antall levedyktige celler ble målt ved hjelp av MTS-analyse etter transient transfektert med pcDNA3.1-ZIC1 eller pcDNA3.1 vektor. Analysen ble utført in triplo. Stjernen indikerer statistisk signifikans (
p
0,05). (C) Virkningen av inhibering av celleproliferasjon ektopisk ekspresjon av ZIC1 ble bestemt ved kolonidannelsesbestemmelsen i tykktarmskreftceller. Den kvantitative analyse av koloninummer dannet i pcDNA3.1-ZIC1 eller pcDNA3.1 vektor transfektanter er vist i høyre søylediagram i tre individuelle eksperimenter i HCT116 og HT29-celler. Stjernen indikerer statistisk signifikans (
p
0,05). (D) Uttrykket Phos-Akt og Phos-ERK1 /2, så vel som summen av Akt og ERK1 /2 ble analysert ved western blot. Band tettheter ble kvantifisert og proteinnivåer (p-Akt, p-ERK1 /2) ble normalisert til p-aktin. Densitometry verdier (ZIC1 transfektanter) er uttrykt som ganger endring sammenlignet med vektor transfektanter verdier normalisert til 1.
Ektopisk uttrykk for ZIC1 induserer celle apoptose
For å utforske mekanismene bak hemming av celleproliferasjon av ektopisk ekspresjon av ZIC1, analyserte vi celle apoptose og cellesyklus ved strømningscytometri-analyse. Som vist på figur 4A, blir cellene transfektert med ZIC1 indusert celle-apoptose. I tillegg er våre resultater viste at gjen uttrykk for ZIC1 førte til aktivering av apoptose-relatert kaskader, inkludert spalting av caspase3, nedregulering av BCL-XL, og Bad dephosporylation (figur 4B). Disse resultater indikerer at induksjon av celle apoptose ved overekspresjon av ZIC1 medieres av Bcl-xl /Bad /Caspase3 kaskade. Imidlertid, re-ekspresjon av ZIC1 ikke påvirke cellesyklusprogresjon (data ikke vist).
(A) Celle apoptose ble påvist ved den Annuexin V-PI flowcytometri analysen. De representative tall vises etter transient transfektert med ZIC1 eller kontroll vektor etter 48 timer i HT29 og HCT116-celler. Region A1 indikerer tidlig apoptotiske celler, A2 viser sent apoptotiske celler. (B) Western blot-analyse av apoptotiske regulerte proteiner. Uttrykket av fosfor-Bad og Bad, BCL-XL, kløyvde-caspase3, og Caspase3 ble påvist etter transected med ZIC1 eller kontroll vektor i tykktarm kreft cellelinjer (HT29 og HCT116). Band tettheter ble kvantifisert og proteinnivå (p-Bad, Bad, BCL-XL, og spaltet-caspase3) ble normalisert til p-aktin. Densitometry verdier (ZIC1 transfektanter) er uttrykt som ganger endring sammenlignet med vektor transfektanter verdiene normalisert til 1.
Gene uttrykk profilendringer ved ektopisk eksogene ZIC1 uttrykk
For å søke etter målgener av ZIC1 i tykktarm kreft celler, benyttet vi cDNA microarray for å analysere genuttrykk profilendringer forårsaket av ektopisk uttrykk for ZIC1. Denne analysen viste at 337 gener ble nedregulert og 95 gener ble oppregulert ved EXOGENIC uttrykk for ZIC1 når du bruker en to-ganger endring av uttrykk som terskel (representative gener vist i figur 5A). Som vist i tabell 2, har mange av disse genene blitt rapportert å spille en viktig rolle i celleproliferasjon og apoptose. For å bekrefte uttrykket mønsteret observert i microarray, validert vi uttrykket av 10 utvalgte gener i tykktarm kreft celler transfektert med ZIC1 ved QRT-PCR. Resultatene viste at
CCNA2 plakater (cylin A2) og
IGFBP3 plakater (insulin-like growth factor bindende protein 3) signifikant oppregulert ( 2 ganger endring), mens
ANGPT2
(Angiopoietin 2),
GADD45B plakater (vekst arrest og DNA-skade-induserbar, beta),
LAMB2 plakater (laminin, beta 2),
LAMB3 plakater (laminin , beta 3),
MALAT1 plakater (metastase forbundet lunge adenokarsinom avskrift 1),
PNMA2 plakater (paraneoplastic antigen MA2),
RPA4 plakater (replikering protein A4), og
TACSTD2 product: (tumor-assosiert kalsium signal svinger 2) ( -2 ganger endring) ble nedregulert ved overekspresjon av ZIC1 i HCT116 og HT29 celler (Figur 5B og tabell S1). Disse dataene ble konkordant som innhentes fra microarray analyse.
(A) Differensial uttrykk for genet profiler i ZIC1 eller kontroll vektor stabile transfektanter ble visualisert ved hjelp av Java Utforsker i HCT116 cellelinjer. Representative gener over to ganger endring er angitt på høyre side av dette bildet. (B) gener transkripsjon mengde av 10 utvalgte gener ble målt ved QRT-PCR og beregnet ved bruk av verdien av 2
– △△ CT. Relativ genekspresjon i ZIC1 transfektanter ble sammenlignet med tom vektorkontroll, som ble normalisert som en referanseverdi på 1,0. Hvite linjer indikerer resultatet av microarray analyse, og svart barer representant for QRT-PCR data i HCT116 cellelinje.
Diskusjoner
I denne studien fant vi at ZIC1 ble brakt til taushet eller nedregulert i tykktarm kreft cellelinjer, samt i primær tumorvev i forhold til tilstøtende ikke-tumorvev (
p
0,05). Videre våre observasjoner identifisere at arrangøren DNA hypermethylation bidrar til ZIC1 stanse eller nedregulering i CRC. Disse resultatene er i tråd med vår tidligere studie av ZIC1 i magekreft [19], noe som indikerer at arrangøren CpG methlyation er den dominerende mekanismen for ZIC1 downregulation. Men vi kan ikke utelukke utseendet av andre mekanismer i stanse av ZIC1, slik som histoner eller nucleosome ombygging. For eksempel, ZIC1 uttrykk mislyktes i å bli gjenopprettet etter Aza behandling i LS180 og SW480-cellelinjer (data ikke vist). Nyere studier viser at metylering av histoner H
3 på lysin 27 er knyttet til ZIC1 stanse i embryonale stamceller [18]. Chromatin immunoutfellingsstudier analyser viser at uttrykket av ZIC1 er assosiert med histoner H
3 dimetylering på lysin 4 i desmoids og MEF celler [18].
Til tross for illustrasjon av den kritiske rollen ZIC1 i virveldyr utvikling [ ,,,0],13], [15], funksjonell karakterisering av ZIC1 i kreftutvikling er fortsatt i stor grad ukjent. Her er våre resultater viser at eksogene ZIC1 hemmer celledeling gjennom p-Akt og p-ERK1 /2 inaktivering i tykktarm kreft celler. PI
3K /Akt og MAPK (Mitogen aktivert protein kinase) signalveiene er vel kjent for å fungere som viktige komponenter av celle proliferasjon i tumorceller [20], [21]. Akt og ERK1 /2, en gang aktiveres ved fosforylering, kan fungere som viktige effektorer av PI
3K og MAPK signalveier å fremme celle overlevelse og spredning [20] – [24]. Dermed kan ZIC1 megle celleproliferasjon gjennom PI
3K /Akt og MAPK trasé i tykktarm kreft celler. I tillegg fant vi at ektopisk uttrykk for ZIC1 kan indusere apoptose av tykktarmskreftceller. Blant det store spekter av proteiner og gener involvert i apoptose, medlemmer av Bcl-2-familien spiller en sentral rolle i denne prosessen, [25], [26]. Caspase-3 har blitt identifisert til å være en viktig mediator av apoptose i pattedyrceller, og fosforyleringen av Bad kan blokkere dens apoptotisk funksjon [22], [25], [26]. I denne forbindelse, fant vi at uttrykket av spaltet-caspase3 og Bad ble indusert, mens fosfor-Bad og BCL-XL ble undertrykt av gjen uttrykk for ZIC1. Våre resultater tyder på at induksjon av apoptose ved ZIC1 kan være assosiert med BCL-XL /Bad /Caspase3 kaskade i tykktarm kreft celler.
I et forsøk på å identifisere nedstrøms mål for ZIC1 i CRC, analyserte vi genuttrykk profiler av tykktarmskreft celler med eller uten ZIC1 overekspresjon. Resultatene viste at 337 gener ble nedregulert og 95 gener ble oppregulert ved ZIC1 (representative nye gener som er vist i tabell 2). Mange av disse genene har vært knyttet til cellevekst, apoptose, adhesjon, angiogenese, og signaloverføring i tumorgenese [27] – [33]. For eksempel ZIC1 trykt uttrykk for
GADD45B
.
GADD45B
induseres ved aktivering av p38 /JNK (c-Jun N-terminal kinase) reaksjonsveien [27], og en viktig mediator av NF-kB-JNK-krysstale og celle apoptose [28]. JNK er en annen viktig nedstrøms komponent av MAPK-kaskader, og er assosiert med cellevekst og cellulær respons til DNA-skade [21], [23], [24]. I tillegg fant vi at ZIC1 økt uttrykk for
RSU1 plakater (Ras suppressor protein 1), som er rapportert å heve nivåene av p21
CIP CDK-hemmer, samt inaktiverer Jun og Rho-avhengige kinaser henhold EGF stimulering [29]. Med vårt funn av ZIC undertrykkelse av p-ERK1 /2, foreslår vi at ZIC1 kan regulere MAPK trasé mediert av ERK og JNK kinaser. Videre studier er nødvendig for å illustrere de mekanismer som regulerer ZIC1 disse potensielle baner i progresjon av kreft. Videre viste vi at ZIC1 kan undertrykke uttrykket av andre nye gener (
TACSTD2
,
ANGPT2
,
LAMB2, LAMB3 Hotell og
MALAT1
etc. ) knyttet til tumor angiogenese og metastase.
TACSTD2
er funnet assosiert med tumor aggressivitet og dårlig prognose i epiteliale celle svulster, inkludert tykktarm og magekreft [30], [31].
ANGPT2
fremstår som en viktig regulator av vaskulær remodelle under tumor angiogenese [32], [33].
Som sink finger transkripsjonsfaktorer, kan ZIC familie av proteiner binder seg til GC-rike sekvenser i målgener [13], [15]. ZIC1 kan regulere målgener i begge sekvensspesifikke og sekvens uavhengig oppførsel [15]. Avhengig av sine interaksjonspartnere, kan ZIC proteiner aktivere eller undertrykke transkripsjon av målgener. Som forventet, observerte vi at ZIC1 regulert uttrykk for viktige transkripsjonsfaktorer som
RPS2
,
NTF3
,
PRDM16
,
KLF15
,
SHC2 Hotell og
FOXJ1 plakater (tabell S2). ZIC1 har vist seg å motvirke med Gli (gliom-assosiert onkogen homolog 1), som fungerer som nedstrøms Sonic pinnsvin (Shh) signalveien og delta i utviklingen av tykktarmskreft [34] – [36]. I mellomtiden, mange av nedstrøms mål for ZIC1 inkludert Notch, cyclin D1, og Wnt3a har blitt anmeldt i nevrale utvikling og dyremodeller [15], [37]. Disse genene er vel kjent for å spille viktige roller i utvikling av kreft. Studiet av ZIC1 målgener kan gi ytterligere innsikt i de mulige mekanismer for ZIC1 tjener som en tumor suppressor i CRC.
I sammendraget, vi avdekket at en roman tumorsuppressorgen ZIC1 ble inaktivert gjennom arrangøren metylering i tykktarmskreft celler. ZIC1 ble også downregulated og ofte hypermethylated i grunnskolen kolorektal kreft vev. ZIC1 hemmer celledeling gjennom undertrykkelse av PI
3k og MAPK trasé, induksjon av celle apoptose gjennom BCL-XL /Bad /Caspase3 kaskade, regulering av nedstrøms mål og veier innblandet i kolorektal kreftutvikling.
Materialer og metoder
Cell kultur og vevsprøver
Den menneskelige tykktarmskreftcellelinjer (HCT116, HT29, DLD1, LS180, SW480 og SW620) ble hentet fra Riken Genbank (Japan) og American Type Culture Collection (ATCC, USA). HCT116-cellelinjen ble dyrket i McCoys 5A medium (Invitrogen, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum, alle andre cellelinjer ble dyrket i DMEM-medium (Invitrogen, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum. Alle cellelinjer inkubert ved 5% CO
2, 37 ° C og 95% luftfuktighet.
Førti kirurgisk reseksjon kolorektal adenokarsinomer og tilstøtende ikke-kreftprøver ble innhentet fra Sir Run Run Shaw Hospital, School of Medicine Zhejiang University. CRC ble klassifisert i henhold til International Union Against Cancer Kriterier og iscenesatt med svulsten-node-metastaser (TNM) system. Prøvene ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen og lagret i -80 ° C inntil videre behandling. Alle pasienter forutsatt informert skriftlig samtykke for å få studie prøver. Studien protokollen ble godkjent av Klinisk forskningsetiske komité for Sir Run Run Shaw Hospital.
Farmakologisk DNA demetylering med 5-Aza-2′-Deoxycytidine
Celler ble behandlet i 72 timer med 5 iM 5-
aza
-2 «-
deoxycytidine plakater (aZA) (Sigma, St. Louis, MO, USA), en godt brukt metyltransferase inhibitor. Aza var etterfylles hver 24. time. En ekvivalent konsentrasjon av bærer (DMSO) ble anvendt som kontroll.
RT-PCR og kvantitativ PCR-analyse
Totalt RNA (1 pg) ble ekstrahert ved bruk av Trizol reagens (Invitrogen) ved å følge produsentens instruksjon, deretter revers transkribert til cDNA med høy kapasitet cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems). RT-PCR ble utført i 35 sykluser (95 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s, 72 ° C i 30 s). PCR-produktet ble underkastet elektroforese i 2% agarose og farget med etidiumbromid. Kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) ble utført med SYBR Grønn Master Mix kit (Takara, Japan) i ABI 7500 PCR system. Den relative genet karakternivået ble normalisert til hus holde genet (GAPDH) ved hjelp av to
-ΔΔCt metode. Alle grunning sekvensene ble oppført i tabell S3.
Bisulfite behandling av DNA og metylering spesifikk PCR (MSP)
Genomisk DNA (1 mikrogram) ble sulfitt behandlet med Zymo DNA modifikasjon Kit (Zymo Forskning , USA). Metylering status av ZIC1 ble påvist ved metylering-spesifikk PCR (MSP) ved hjelp av bisulfitt behandlet genomisk DNA som templat. MSP ble utført i 40 sykluser med glødetemperaturen ved 60 ° C, som tidligere beskrevet [38], [39]. Metylering (M) primere var: F 5′-GGATTTTTTGTTTCGTAATC, R 5′-CCCGTTAACCACGTTAAACG, og Unmethylation (U) primere var:. F 5′-GGGATTTTTTGTTTTGTAATT, R 5′-CCCATTAACCACATTAAACA
Cell transfeksjon og celleviabilitet analysen
For å konstruere et ekspresjonsplasmid ZIC1, ble full-lengde åpen leseramme ZIC1 klonet i pattedyr-ekspresjonsvektoren pcDNA3.1 som tidligere beskrevet [19]. For å generere en stabil transfeksjon celler, ble HCT116 og HT29-celler transfektert med pcDNA3.1-ZIC1 eller pcDNA3.1 vektor ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen), og valgt av G418 (400 ug /ml) i 14 dager i en 12-brønns plate. Overekspresjon av ZIC1 ble bekreftet ved RT-PCR og Western blot hos de overlevende kolonier. Da disse stabile heterogene populasjoner av celler ble overført til 6-brønns plate til kontinuerlig markering med G418 for videre studier.
Cellelevedyktigheten ble bestemt ved 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2- (4-sulfofenyl) -2H- tetrazolium (MTS) reagenser (Promega, Madison, USA). I korthet, HCT116 og HT29-celler ble dyrket 24 timer i en 12-brønns plate og transient transfektert med pcDNA3.1-ZIC1 eller pcDNA3.1. Da disse celler ble sådd ut i 96-brønns (2000-4000 celler /brønn) i 48 timer. Etter inkubasjon med CellTiter 96 vandige løsning reagent for en time, ble absorbansen målt ved 490 nm i henhold til instruksjon av MTS.
Colony formasjon analysen
HCT116 og HT29 celler ble dyrket i 12 – brønn plate (1,0 × 10
5 celler /brønn) i 24 timer og transfektert med pcDNA3.1-ZIC1 eller pcDNA3.1 vektor. Etter 48 timer ble transfektanter ble gjen sådd ut i 6-brønns plate og dyrket i 12-20 dager i dyrkningsmedium inneholdende G418 (400 ug /ml). Overlevende kolonier ble farget med Gentian Violer etter metanol fiksering og synlige kolonier (≥ 50 celler) ble talt opp. Forsøkene ble utført in triplo.
celle apoptose og cellesyklusanalyse
celleapoptose analyser ble utført ved anvendelse av annexin V /PI sett (Invitrogen) ved strømningscytometri-analyse (FCA). I korthet, ble transient transfekterte celler (HCT116, HT29) suspenderes i annexin-bindingsbuffer, ble Alexa Fluor 488 annexin V og PI arbeidsløsningen tilsatt i rekkefølge. De fargede cellene ble endelig analysert ved flow-FACScan flow-cytometri (Becton Dickinson, USA) ved 560 nm. I mellomtiden, 2 x 10
5 seeded celler ble utsatt for ultrafiolett å indusere apoptose som en positiv kontroll.
Cell syklus fordeling ble gjenkjent av Cycletest Plus DNA-reagenssettet (Becton Dickinson, USA). Kort sagt ble transfekterte celler høstet og vasket i PBS, ble cellulært DNA farget med 125 ug /ml propidiumjodid i 20 minutter ved 4 ° C i mørket. Cellene ble deretter sortert etter FACS Calibur og cellesyklus distribusjon ble bestemt ved bruk av ModFit LT programvare (Phoenix, USA).
Western blot analyse
Totalt proteiner ble hentet fra stabilt transfekterte celler ved hjelp RIPA lysebuffer. Lysater (20-60 ug) ble løst i SDS-PAGE-gel og overført til PVDF-membraner (Millipore, Bedford, MA). Blottene ble probet med ZIC1 (1:500; Abcam), Caspase3 (1:500, Sigma-Aldrich), BCL-XL (1:500, Sigma), Bad (1:500; Abnova), fosfor-Bad (1 :1000, Cell Signaling), Akt (1:500; Abcam), fosfor-Akt (1:2000, Cell Signaling), ERK1 /2 (P44 /42) (1:1000, Cell Signaling), fosfor-ERK1 /2 (P44 /42) (1:2000, Cell Signaling) og β-aktin (1:2500, Multisciences Biotech) antistoffer. Blottene ble utviklet ved hjelp av en chemiluminescence med Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Japan).
cDNA microarray analyse og validering
Microarray studier ble filtrert for å identifisere de som profilert genuttrykk i ZIC1 eller kontroll vektor stabilt transfektert cellelinje (HCT116) basert på Affymetrix plattform. cDNA ble transkribert til cRNA med aaUTP binding, noe som tillater inkorporering av fluorescerende fargestoff Cy3 (pcDNA3.1-ZIC1) eller Cy5 (pcDNA3.1). Til slutt ble merkede prøver hybridisert til Agilent hele menneskelige genom inneholder 41.000 prober og transkripsjoner. Duplikate eksperimenter ble utført. Vi valgte loggen
2 ratio ≥1 eller ≤-en som terskelen for oppregulering eller nedregulering av genekspresjon.
Kandidaten ZIC1 målgener ble klassifisert inn i ulike undergrupper i henhold til sine biologiske funksjoner (celleproliferasjon, migrering og angiogenese, etc.). Ti representanter for målgener:
ANGPT2
,
CCNA2
,
GADD45B
,
IGFBP3
,
LAMB2
,
LAMB3
,
MALAT1
,
PNMA2
,
RPA4 Hotell og
TACSTD2
ble verifisert med QRT-PCR i ZIC1 eller kontroll vektor tranfectants i HCT116 og HT29 celler.
Statistisk analyse
Student
t Hotell og Wilcoxon matchet par tester ble utført for å sammenligne med to uavhengige data, mens Chi-kvadrat eller fisher nøyaktige testmetoder for å analyse kategoriske variabler. En
p
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1..
Brett endring (FC) av utvalgte gener i ZIC1 transfecants ble oppdaget av cDNA microarray og QRT-PCR. Brett endring (FC): ZIC1 versus kontroll vektor
doi:. 10,1371 /journal.pone.0016916.s001 plakater (DOC)
Tabell S2.
Expression profilen til representant gen forbundet med transkripsjon regulator og signaloverføring i ZIC1 transfektanter sammenlignet med tom vektor kontroll (endring) av cDNA microarray i HCT116 cellene. Fold endring:. ZIC1 versus kontroll vektor
doi: 10,1371 /journal.pone.0016916.s002 plakater (DOC)
tabell S3.
Primer sekvenser som brukes for kvantitativ real-time PCR.
doi: 10,1371 /journal.pone.0016916.s003 plakater (DOC)
Takk
Vi takker Dr. Lei Guo for nyttige forslag; Dr. Yan Shan, Xiaotong Hu og Fubiao Zhang for utmerket teknisk assistanse; og Dr. Manish Gala for kritisk gjennomgang av manuskriptet.
