Abstract
Lungekreft (LC) med sine ulike undergrupper er vanligvis kjent som en terapi motstandsdyktig kreft med høyest sykelighet over hele verden. Terapi motstand av en tumor er antatt å være relatert til kreft stamceller (cscs) innenfor tumorene. Det har vært indikasjoner på at lungekreft er formeres og vedlikeholdt av en liten bestand av cscs. For å undersøke dette spørsmål det etablert et panel av 15 primær lungecancer cellelinjer (PLCCLs) fra 20 friske primære tumorer ved hjelp av en robust serumfritt kultursystem. Vi har senere fokusert på identifisering av lunge cscs ved å studere disse cellelinjene avledet fra 4 representative lungekreft undergrupper slik som småcellet lungekreft (SCLC), stor celle karsinom (LCC), plateepitelkarsinom (SCC) og adenokarsinom (AC). Vi identifiserte en liten populasjon av celler sterkt positive for CD44 (CD44
høy) og en hoved befolkning som var enten svakt positiv eller negativ for CD44 (CD44
lav /-). Co-uttrykk for CD90 ytterligere snevret ned den antatte stamcelle befolkningen i PLCCLs fra SCLC og LCC som sfæroide dannende celler ble hovedsakelig funnet i CD44
highCD90
+ sub-populasjon. Dessuten, disse CD44
highCD90
+ celler avslørt mesenchymale morfologi, økt uttrykk av mesenchymale markører
N-cadherin Hotell og
vimentin
, økte mRNA nivåer av embryonale stamceller relaterte gener
Nanog Hotell og
Oct4 Hotell og økt motstand mot bestråling i forhold til andre underpopulasjoner studert, noe som tyder på at CD44
highCD90
+ befolkningen en god kandidat for lunge cscs. Både CD44
highCD90
+ og CD44
highCD90
– cellene i PLCCL avledet fra SCC dannet kuler, mens CD44
lav /- cellene ble mangler dette potensialet. Disse resultatene indikerer at CD44
highCD90
+ sub-populasjon kan representere cscs i SCLC og LCC, mens i kreft subtype SCC lunge, ble CSC potensialer finnes innenfor CD44
høy sub-populasjon.
Citation: Wang P, Gao Q, Suo Z, Munthe E, Solberg S, Ma L, et al. (2013) Identifisering og karakterisering av celler med kreftstamcelleegenskaper i humane primære Lung Cancer Cell Lines. PLoS ONE 8 (3): e57020. doi: 10,1371 /journal.pone.0057020
Redaktør: Dean G. Tang, The University of Texas M.D Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 26 juni 2012; Godkjent: 21 januar 2013; Publisert: 04.03.2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra norsk forskningsråd (SFI-CAST). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
«kreft stamcelle» (CSC) teori innebærer en hierarkisk organisasjon innen svulsten som cscs representerer toppen av hierarkiet. I likhet med normale stamceller, cscs har kapasitet til å undergå selvfornyelse samt asymmetrisk celledeling. Disse sentrale funksjonene gjør cscs å initiere og opprettholde svulster. I tillegg til den klassiske begrepet, dvs. CSC, ulike begreper har blitt brukt i den siste vitenskapelige litteraturen for å beskrive viktige kjennetegn ved cscs som selvfornyelse og tumor initiere /vedlikehold av eiendom. Blant andre er slike vilkår som tumor initiering celle (TIC), kreft initiere celle (CIC) og tumor forplanter celle (TPC). I denne rapporten vil vi bruke CSC sikt å karakterisere celler som var i stand til å initiere og opprettholde tumordannelse hos dyr og langsiktig flytende kultur.
Gjeldende studier innen kreftstamcelleforskning har gitt økende bevis for eksistensen og identifisering av cscs ved hjelp av flere spesifikke biomarkører, slik som CD44, CD133 og CD90. Disse markørene er allment akseptert for isolering av cscs i humane hematologiske maligniteter [1], [2], samt i faste tumorer [3] – [11]. Videre cscs er funnet å være mer resistente mot konvensjonell kjemoterapi og radioterapi enn hovedpopulasjonen av mer differensierte kreftceller, noe som indikerer at cscs kan forbli i rest tumorer etter behandling, og bidrar til kreft tilbakefall og sprer seg. Derfor nye behandlinger rettet mot cscs kan potensielt hindre tumorresidiv og forlenge overlevelsen av pasienter. Epitel-mesenchymale overgang (EMT) spiller en viktig rolle i fosterutviklingen [12]. Det fører epitelceller å miste sin epitelial oppførsel, endre deres morfologi og cellulære egenskaper for å ligne mesenchymalceller [13]. EMT er blitt foreslått å bidra til invasive og metastatisk vekst av mange typer av cancer [14] – [17]. Fersk studie viste at stamcelleliknende celler fra epiteliale kreftformer har en mesenchymale fenotype ekspress markører assosiert med EMT [15].
Lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet over hele verden, og har en dårlig prognose med 5-års overlevelse på ca 15%. Ifølge histologiske heterogenitet, er lungekarsinom kategorisert i fire store undergrupper: småcellet lungekreft (SCLC), plateepitelkarsinom (SCC), stor celle karsinom (LCC) og adenokarsinom (AC). I denne studien, som følge av «Cancer Stem Cell» hypotesen, vi fokusert på identifisering og karakterisering av cscs i ovennevnte undergrupper av lungekreft.
celleoverflaten markør CD133 har tidligere blitt identifisert som en pålitelig markør for cscs i noen av lungekreft subtyper [18]. Har imidlertid påliteligheten av denne markøren som et CSC markør for lungekreft nylig vært omstridt [19]. Derfor fokuserte vi på en annen markør, dvs. CD44, som har blitt foreslått å karakter cscs i bryst, prostata, hode og nakke, colorectal, bukspyttkjertel og mage kreft [3], [4], [9] – [11], [ ,,,0],20].
i denne studien tok vi nytte av primær lungekreft vev fjernet under reseksjon og fokusert på å etablere av PLCCLs fra nylig isolerte svulster. Vi antok at PLCCL kan gi en mer representativ og passende kilde av kreftceller som kan brukes for identifikasjon av celler eller cellepopulasjoner med stamcelle-lignende egenskaper. Vi først opprettet et panel av de primære lungecancer cellelinjer fra ferskt oppnådde prøver av de store undertyper av lungekreft. Basert på detaljert fenotypiske og funksjonell analyse av representative cellelinjer fra SCLC, LCC og SCC, gir vi bevis som indikerer at CD44
høy befolknings kan havnen cscs i disse kreft subtyper. I tillegg, co-uttrykk av CD90 ytterligere snevret ned bestanden av cscs i SCLC og LCC. Bildet for AC, men er fortsatt mindre klart, og på det nåværende har vi ingen overbevisende bevis for at noen av de markører, dvs. CD44 og CD90, er karakteristisk for cscs i denne kreft subtype.
Materialer og Metoder
Innsamling av vevsprøver og etablering av primær lungekreft cellelinjer
Denne studien ble godkjent av Regional Etisk Komité og Institutional Review Board of Oslo universitetssykehus og utført i henhold til retningslinjene for Helsinki-konvensjonen. Ved signert informert samtykke, ble human lungekreft vev hentet fra 20 pasienter med primær lungekreft (alder 55-81 år) som gjennom lobektomi eller pneumonectomy ved Oslo universitetssykehus fra juli 2007 til oktober 2009. Histologisk diagnosen ble fastsatt basert på mikroskopiske funksjonene carcinoma celler (tabell 1).
Ny tilveiebragt tumorvev (i løpet av 1-2 timer etter kirurgisk fjerning) ble vasket i RPMI-1640-medium (Invitrogen, USA) inneholdende penicillin-streptomycin (PS, penicillin 100 U /ml og streptomycin 100 ug /ml; Lonza, Belgia). Blodårer og bindevev ble forsiktig fjernet og kreft delen ble deretter hakket opp i små biter mindre enn 1 mm
3 ved hjelp av skalpell, etterfulgt av omfattende vasking i RPMI-1640 medium og sentrifugering ved 300 g i 5 min. Til slutt, ble cellene resuspendert i RPMI-1640 medium inneholdende kollagenase II (Invitrogen, USA) ved en konsentrasjon på 200 U /ml og nedbrytes i 2-4 timer ved 37 ° C i en fuktet inkubator. Den enzymatiske fordøyelse ble stoppet da de fleste av cellene var i enkeltcellene suspensjonen. Etter vasking i RPMI-1640 og 3x sentrifugering ved 300 g i 5 minutter, ble cellene overført til standard vev kultur belagt kolber (Corning Life Sciences, USA) og dyrket i Definert keratinocyte-Serum Gratis Medium (DK-SFM) supplert med L -glutamine (Invitrogen, USA), EGF 20 ng /ml, standard-FGF 10 ng /ml (Peprotech Inc., USA), 2% B27 (Invitrogen, USA), PS og amfotericin B (0,25 ug /ml; Invitrogen, USA). Kulturen i alle PLCCLs ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2. Kulturmediet ble skiftet hver 2-3 dag. Celler ble passert etter løsrivelse med TrypLE ™ Express (Invitrogen, USA), når cellene nådde 80-90% samløpet. Alle studiene ble utført med de første fem passasjer av etablerte PLCCLs.
Isolering av nukleinsyre og DNA fingerprinting analysen
For å etablere en genetisk fingeravtrykk for hver av de nye cellelinjer, DNA fingerprinting assay ble utført på representative PLCCLs (LC004, LC006, LC007 og LC021) så vel som på en re-etablert cellelinje fra xenograft av LC021. Genomisk DNA ble isolert fra Dulbeccos fosfatbufret saltoppløsning (DPBS, Invitrogen) vaskede cellepelletene. Totalt genomisk DNA ble oppnådd ved bruk av NucleoSpin Tissue Kit (Macherey-Nagel, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll. Identiteten til DNA-profiler ble bestemt ved hjelp av profilering STR Powerplex 16 System (Promega, Madison, WI). Dette settet forsterker 15 STR loci og amelogenin for kjønnsidentitet: Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, FGA, TPOX, D8S1179, VWA, Amelogenin, Penta D, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317 og D5S818. PCR-produktene ble størrelsesfraksjonert bestemt i en MegaBace 1000 (Applied Biosystems, USA) ved hjelp av programvaren Fragment Profil (GE Healthcare). Disse fingeravtrykk ble deretter sammenlignet med DNA-profiler i et fingeravtrykk database av tidligere etablert lunge kreft cellelinjer for å sikre sin unikhet.
Immunohistochemistry
Den primære dyrkede lungekreftcellelinjer ble innebygd i parafinblokker med på følgende måte: cellene fra den flytende kultur ble fjernet og vasket med DPBS og deretter sentrifugert ved 300 g i 5 minutter. Supernatanten ble forsiktig fjernet før 3 dråper plasma og 2 dråper av trombin ble tilsatt og blandet ved rør rotasjon. Formalin (4%) ble tilsatt etter at blandingen ble koagulert. Den koagulerte masse ble deretter plassert i linen papir før de ble innleiret i parafinblokker ved standard prosedyre. Noen snitt ble farget med hematoxylin og eosin (H E) for å vurdere cellulær morfologi, mens andre deler ble benyttet for immunhistokjemi (IHC) analyse. Fire mikrometer tykke seksjoner ble avvokset og hydrert i gradert etanol. For å avdekke epitoper, ble deler deretter varmes i mikrobølgeovn i ulike buffere er optimalisert for forskjellige antistoffer. Lav pH 10 mM citratbuffer (pH = 6,0) ble anvendt for antistoffer P53, Ber-EP4 og CD44. Å hemme endogen peroksidase, ble seksjonene inkubert med 3% -ig hydrogenperoksyd (DakoCytomation, USA) i 5 minutter ved romtemperatur (RT). Seksjonene ble deretter inkubert med primær muse anti-human P53, CD44 og Ber-EP4 (DAKO, 1:1000, 1:100 og 1:300 fortynninger, henholdsvis) og CD133 (Miltenyi Biotec, klone AC133 /1 1:40 fortynning) antistoffer i 30 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av inkubasjon med tilsvarende sekundære antistoffer i 30 minutter ved romtemperatur og farget med 3,3′-diaminobenzidin tetrahydroklorid (Dako EnVision ™ + System peroksidase (DAB) (K4007, DakoCytomation, USA)) før de ble kontra med hematoxylin, dehydrert og montert i DIATEX. Alle seksjonene ble skyllet grundig med TBS-Tween vaskebuffer (Dako Cytomation, USA) etter hver inkubasjon trinn. Seksjoner fra parafinblokker som inneholder menneskelige seminom og brystkreft prøven ble brukt som positive kontroller for antistoffer P53, Ber-EP4 og henholdsvis CD44,; Seksjoner fra parafinblokk inneholdende tykktarmskreft cellelinje CaCo-2 ble anvendt som positiv kontroll for CD133 antistoff. Isotypekontrollantistoffer ved den samme konsentrasjon ble anvendt som negative kontroller. Alle kontroller ble utført og antistoffreaksjon ble verifisert før eksperimentelle anvendelser av antistoffer. Hver farget delen ble anmeldt uavhengig av to patologer.
Dyreforsøk
Alle dyreforsøk ble godkjent av og utført i henhold til retningslinjer fastsatt av forsøksdyretiske styret ved Universitetet i Oslo. Kvinne NOD /SCID mus (NODSC-M-F /M-M Homozygot NOD /mrkBOMTac-Prkdcscid, Taconic, Danmark) ble kjøpt. Etter å ha blitt holdt i karantene en uke for overvåking i sterilt miljø av dyret anlegget i Oslo universitetssykehus, Rikshospitalet, 4-5 uker gamle NOD /SCID mus ble brukt i alle forsøk. For å vurdere tumordannelse av etablerte PLCCLs, 3 x 10
6 celler av hver cellelinje ble suspendert i DK-SFM ble inokulert subkutant inn i høyre flanke av NOD /SCID-mus (3 mus i hver gruppe) ved et maksimalt volum på 100 ul. Musene ble undersøkt to ganger i uken, og tumorstørrelse ble målt med krumpasser. Mus ble avlivet ved cervikal dislokasjon når størrelsen på tumoren nådde en diameter på 15 mm. Xenotransplantater ble deretter fjernet og anvendt for histologisk analyse og etablering av væskecellekulturer. Serial Xeno-transplantasjoner ble utført med LCC LC006-cellelinjen ved implantering av stykker av den primære xenograft subkutant i sekundær mottaker NOD /SCID-mus. Xenografter avledet fra hver passering ble tatt ut og fiksert i 4% bufret formalin for histologisk analyse.
Flowcytometri analyse og fluorescens-aktivert celle sortering (FACS)
Flowcytometri analyse ble utført på PLCCLs på logaritmisk vekstfase. Cellene ble først enebolig med TrypLE ™ Express og vasket med DPBS. Re-suspenderte celler ble tellet og overført til 75 mm polystyren rundbunnet reagensrør (BD Falcon, USA) ved en cellekonsentrasjon 1 x 10
6 celler /ml, og deretter farget med antistoffer ved fortynninger bestemt ved tidligere titrering. Humant immunoglobulin farging buffer (DPBS + 0,1% humant serum albumin (Octapharma, Stockholm, Sverige)), og 5 ul av 10 mg /ml gammaglobulin (Gammagard, Baxter, UK) ble tilsatt til cellene for å blokkere FcR og redusere uspesifikk binding av antistoffer. Fluorokromkonjugerte koblet monoklonale antistoffer (mAbs) ble tilsatt til testrørene ved mettende konsentrasjoner og cellene ble inkubert i 20 minutter på is unngå lyseksponering. En screening for markører ble utført med et panel av mAb’er (se detaljerte data i tabell 2) på fire PLCCLs representerer hver lungekreft subtype. Celler farget med isotype-matchet mAbs (BD Pharmingen, USA) tjente som negative kontroller. Forskjellige populasjoner av celler ble sortert basert på uttrykkene for CD44 alene, eller i kombinasjon med CD90 ved hjelp av en FACSAria II cellesorterer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Strømnings data ble kjøpt på FACSAria II eller LSR II cytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Resultatene ble analysert ved anvendelse av programvaren BD FACSDiva (versjon 6.1.3). Levedyktighet sorterte celler ble rutinemessig kontrolleres ved hjelp av trypanblått (Invitrogen, USA) flekker og som regel var 70%
Celleproliferering analysen
FACS sortert CD44
høy. og CD44
lav /- celler ved tetthet på 150 eller 500 celler per brønn ble sådd ut i triplikat i 200 ul DK-SFM med tilskudd i standard-belagte 96-brønners plater. Brønner inneholdende bare medium ble brukt som bakgrunn negativ kontroll. Cellene ble tillatt å overholde ved 37 ° C i en 5% CO
2 fuktet inkubator for en dag før de ble brukt i den proliferasjonsanalyse. Celleproliferasjon ble målt i følgende 8 dager bruker CellTiter 96® vandige løsning Cell Proliferation Assay kit (Promega, Madison, WI) i henhold til protokollen gitt av produsenten. Absorbans ved 490 nm ble målt på en Wallac Victor2 plateleser (Perkin Eimer, Waltham, MA). Vekstkurver ble trukket i henhold til middelverdien av absorbans, relatert til bakgrunnen.
to-dimensjonal (2D) enkelt celle kolonidannende og heterogenitet assay
CD44high og CD44
lav /- celler fra SCLC-cellelinjen LC004 og LCC-cellelinjen LC006 ble sortert og sådd ut ved en enkelt celle per brønn inn i standard belagte 96-brønners plater inneholdende 200 ul DK-SFM supplert med EGF 20 ng /ml, standard-FGF 10 ng /ml, og 2% B27. Enkelt celle plating ble validert av fase-kontrast mikroskop (Nikon, Tyskland). Kulturer ble holdt ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator. Etter 2 uker antallet positive brønner inneholdende kolonier ble tellet, og morfologiske karakteristikker av koloniene ble undersøkt. Å studere selvfornyelse og differensiering av enkeltceller, kolonier av ulike typer dvs. holoclones, meroclones og paraclones, ble utsatt for serie passasjer ved å plukke og re-seeding dem først i 24-brønnen, deretter 6-brønners plater (Corning Life Science , USA), og til slutt inn i kolber (Corning Life Science, USA) hvor de ble ytterligere utvidet. ble observert Colony vekst i 2D enkelt celle kolonidannende analysen og de langsiktige flytende kulturer som stammer fra disse koloniene ved hjelp av fasekontrastmikroskop (Nikon, Tyskland).
2D kolonidannelse effektivitet analysen
FACS sortert CD44
høy, CD44
lav /- og CD44
highCD90
+ og CD44
highCD90
– celler fra cellelinjer SCLC LC004 og LCC LC006 ble sådd i tre paralleller på en tetthet på 200 celler per brønn i standard belagt seks brønn plate (Corning Life Science, USA) som inneholder 5 ml DK-SFM med kosttilskudd per brønn. De sorterte celler ble holdt i kultur ved 37 ° C i 5% CO
2 fuktig inkubator i ~ 10 dager. Når de genererte koloniene var synlige og inneholdt 100 celler, ble supernatanten aspirert og brønnene ble renset to ganger med DPBS, fiksert i 4% bufret formalin i 15 min ved RT, etterfulgt av farging med krystallfiolett i 15 min ved RT. Etter skylling bort fargestoff, ble kolonien antall telte og kolonidannelse effektivitet (CFE), dvs. antall kolonier per belagt celle, ble beregnet og sammenlignet mellom ulike sub-populasjoner.
spheroid formasjon analysen
FACS-sortert celler ble sådd ved tetthet på 100 celler per brønn i ultra lav festet (ULA) 96-brønners plate (Corning Incorporated) inneholdende 200 pl DK-SFM med kosttilskudd og dyrket ved 37 ° C i en 5% CO
2 fuktet inkubator til cellene begynte å danne kuler. Mediet ble byttet hver 2. dag ved å forsiktig fjerne 50 pl av det øvre lag av medium og erstatte den med like stort volum ferskt medium. Brønnene ble inspisert hver 2 dager ved hjelp av fasekontrastmikroskop. Når kulene var stor nok (de fleste av celleklumper var 200 mikrometer)., Ble de regnet og fotografert (Nikon, Tyskland)
RNA ekstraksjon og real-time PCR-analyse
Total RNA ble ekstrahert fra 10
5 FACS-sortert celler og deretter reverstranskribert ved hjelp av Taqman celle-til-CT kit (Applied Biosystems, USA) i henhold til protokollen gitt av produsenten. Real-time PCR ble utført ved hjelp av Taq-Man Gene Expression analyse system (Applied Biosystems, USA) på 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA) i henhold til produsentens instruksjoner og data ble analysert ved SDS 2.3-programvaren ( Applied Biosystems, USA). Hver prøve, inkludert templat-kontroller, ble utført i duplikat. PCR-reaksjonen uten templat tjente som den negative kontroll. Termisk sykling Betingelsene var 50 ° C i 2 minutter og 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 40 sykluser av 15 sekunder ved 95 ° C, etterfulgt av 1 minutt ved 60 ° C. Uttrykket nivåer ble bestemt for følgende gener
Nanog plakater (assay ID 8S02387400_gl),
Oct4 plakater (assay ID Hs03005111_g1),
Sox2 plakater (assay ID Hs01053049_sl),
E-cadherin plakater (assay ID Hs01023895_m1),
N-cadherin plakater (assay ID Hs00169953_m1),
vimentin plakater (assay ID Hs00958111_ml),
høy mobilitet gruppe AT-krok 2 (HMGA2) plakater (assay ID HS00171569_ml) og
fosfoglyceratkinase en product: (
PGK1
) (analyse ID Hs99999906_m1). Uttrykket av målgener var relatert til uttrykk av
PGK1 Hotell og normalisert til usorterte kontrollceller ved hjelp av ddCT metoden.
Stråling følsomhet analysen
FACS sorterte cellene ble sådd ved en tetthet på 500 celler per brønn i duplikater i standard-belagte 96-brønners plater (Corning Incorporated) inneholdende 200 ul DK-SFM med kosttilskudd. Etter 24 timers konvensjonell inkubering ble cellene i monolagskulturer bestrålt ved RT med doser på 1Gy, 2Gy og 4Gy, henholdsvis ved bruk av et Siemens Stabilipan røntgenenhet, operert ved 200 kV, 20 mA, med 0,5 mm kobber filtrering (Siemens , Tyskland). Cellene ble deretter dyrket i vanlige dyrkingsbetingelser i ytterligere 5 dager med medium bytte hver 2 dager. Effekten av bestråling på forskjellige cellepopulasjoner ble testet ved den CellTiter 96® vandige One Solution Cell Proliferation Assay som beskrevet ovenfor. Effekten av bestråling på proliferasjon er gitt som inhibering forholdet og ble beregnet i henhold til formelen:. Hemning forhold = ((ikke-bestrålt kontroll vel absorbansen – bestrålt vel absorbans) /ikke-bestrålte kontrollbrønn absorbans) x 100%
Resultater
1. Primær lungekreftcellelinjer
For å gi et grunnlag for denne studien, ble en ny, robust metode for kultur av lungekreftceller fra ferskt resected lungekarsinom etablert (se Materiale og metode). Femten primære lungekreftcellelinjer ble opprettet fra 20 lungekreft vev fjernet. Disse inkluderte 7 ACs, 6 SCCS, en LCC og en SCLC (tabell 1). Suksessen-hastighet for å etablere primærkulturer var 75%. Majoriteten av svikt fant sted i den første delen av studien, før optimale konsentrasjoner av vekstfaktorene var blitt bestemt. DK-SFM gjorde understøtte den selektive vekst av typiske epitelceller, tydelig inhibering av veksten av sameksisterende fibroblaster. Dette var i kontrast til kulturer inneholdende serum som brukes i begynnelsen, hvor hurtig overvekst av fibroblaster har forekommet (data ikke vist). Monolagsceller med typisk epithelial morfologi ble oppnådd ved meget høy renhetsgrad i hver av de etablerte PLCCLs (figur 1). Den primære cellelinjer opprettholdes under disse forholdene ble passert for flere generasjoner med lengst passering så langt over 30 generasjoner, uten noen tegn til vekst nedgang.
A. SCLC cellelinje LC004 den; B. LCC cellelinje LC006; C. AC cellelinje LC007; D. SCC cellelinje LC021. Alle de representative bildene var fra primære dyrkede lungekreft cellelinjer ved andre passering. Mikroskopbilde forstørrelse, × 200.
For å sikre at de etablerte cellelinjer var av unike opprinnelse og ikke forurenset av tidligere etablerte cellelinjer [21], DNA-profiler ved hjelp av et sett av svært polymorfe mikro markører ble generert fra en undergruppe av cellelinjer som representerer de fire forskjellige typer av lungekreft. Resultatene viste at de fire cellelinjene var unik og urelaterte (tabell Sl).
2. Fenotype PLCCLs og foreldre kreft vev har lignende /sammenlign for uttrykk for P53, Ber-EP4 og CD44
Vi har fokusert arbeidet med fire PLCCLs representerer fire lungekreft undergrupper: den SCLC cellelinje LC004, LCC cellelinje LC006, AC cellelinje LC007 og SCC cellelinje LC021. Fra de valgte representative PLCCLs, vi forberedt parafinblokker og seksjoner fra disse cellelinjene ble farget med H E. Morfologisk vurdering av PLCCLs bekreftet sin epitelial opprinnelse med tegn på malign transformasjon. Videre er de primære cellelinjer avledet fra hver av de fire lungekreft subtypene ble morfologisk heterogent både på celle og atomnivå (figur 2A).
A. H E farging av de 4 representative primær lungecancercellelinjer for ulike lungekreft subtyper: den SCLC-cellelinjen LC004; LCC cellelinje LC006; AC cellelinje LC007 og SCC cellelinje LC021. De celler avledet fra de fire undergrupper av lungekreft viste heterogenitet i cellulær og atom morfologi. Celler av hver primærcellelinje hadde epitelial morfologi. Mikroskopbilde forstørrelse, × 200. B. Analyse uttrykk for P53, Ber-EP4 og CD44 i de 4 primære cellelinjer og tilhørende arkiv pasientenes tumorvev. Alle de primære cellelinjer som ble undersøkt viste diffuse positiv farging for P53, bortsett fra den opprinnelige SCC vev av cellelinje LC021. Epitelial membran antigen Ber-EP4 ble allment positiv i alle de opprinnelige lungekreft vev og diffus positive i alle de primære cellelinjer. CD44 viste diffuse positiv farging med forskjellig intensitet i de primære cellelinjer og deres tilsvarende arkiverings pasienters cancervev unntatt svakt positiv i den opprinnelige tumorvevet av AC-cellelinjen LC007. Seksjoner fra parafinblokker som inneholder menneskelige seminom og brystkreft prøven ble brukt som positive kontroller for antistoffer P53, Ber-EP4 og CD44, henholdsvis. Mikroskopbilde forstørrelse, × 200.
Tumor-suppressor protein P53 mutasjoner er et kjennetegn på kreft og er generelt oppregulert [22]. Vi neste forhold uttrykk nivåer av P53 i seriesnitt fra arkiv pasientenes tumorvev og nyetablerte PLCCLs bruker IHC. Alle fire PLCCLs viste diffus positiv farging for P53. Den samme type farging ble observert i det opprinnelige pasientens kreftvevet med unntak av SCC foreldre vev, som var negativ for P53 (figur 2B). Interessant, cellelinje avledet fra SCC-senteret (LC021), uttrykt P53. Uttrykket nivåer i Ber-EP4 og CD44 ble undersøkt på samme måte. De arkiv pasientenes tumorvev og tilhørende PLCCLs viste bredt positiv farging for pan-epitelial markør Ber-EP4. Diffuse positiv farging med forskjellig intensitet i arkiv pasientenes tumor-vev og deres tilsvarende cellelinjer ble observert med CD44-farging, med unntak av AC foreldre tumorvev, som var svakt positiv over det meste av seksjonen studert (figur 2B, tabell S2). Uttrykk for CD133 i foreldre tumorvev ble også undersøkt av IHC farging. CD133 viste en mer varierende mønster, med alle de foreldre svulster blir negativ, med unntak av SCLC (LC004) hvor ble observert uttrykk i isolerte områder (data ikke vist). Alle PLCCLs avledet fra de tilsvarende foreldre kreftvev var jevnt negative for CD133 uttrykk ved IHC farging.
Tatt sammen de summerte eksperimenter tyder på at de PLCCLs i tidlige passasjer (opptil fem) er representant for foreldre svulstvev i alle fire kreft undergrupper.
3. Primære kulturer av lungekreftceller er så tumorigent som xenotransplants
Ondartet potensialet i PLCCLs ble undersøkt i en eksperimentell dyremodell. En tumorigenesis analyse ble utført på 5 til 6 uker gamle hunnkjønns NOD /SCID-mus. Syv av PLCCLs ble testet i tidlige passasjer og alle var i stand til å generere transplantater i løpet av 3 uker etter injeksjonen. De fire cellelinjer SCLC LC004-P4, LCC LC006-P2, SCC LC021-P2 og AC LC007-P3, ble valgt for videre studier, spre subkutane bulk svulster i 2/2, 3/3, 2/2 og 2/2 dyr, respektivt. Dessuten var vi i stand til å re-etablerte PLCCLs
in vitro
fra xenografter tatt fra disse dyrene (figur S1). I tillegg DNA fingerprinting var nyttig å spore individuelle cellelinjer fra xenografter av LC021 (Tabell S1 og Figur S1).
Basert på disse resultatene vi konkludere PLCCLs med tumorigenesis kapasitet i immunsvikt mus kan enkelt og reproduserbart genereres fra alle fire undergrupper av lungekreft og spredd i
in vitro
flytende kultur.
sekundær xeno-transplantasjon ble utført ved å implantere subkutant stykker av den primære LCC xenograft (LC006) i videregående mottakeren . Primær mottaker transplantert med LC006 celler avslørte lungemetastaser i tillegg til subkutan tumor. Men i de følgende serie Xeno-transplantasjoner, ble svulster dannes bare subkutant. Når morfologiske trekk ved PLCCL og serie xenografter og foreldre vev ble sammenlignet, viste de høye likheten støtte observasjon at PLCCLs og xenotransplants representerer den opprinnelige svulsten.
4. Uttrykk for CSC forbundet celleoverflatemarkører er dynamisk i den langsiktige kultur for PLCCLs
For å identifisere subpopulasjoner av antatte lungekreft stamceller i primærkreftcellelinjer, undersøkte vi uttrykket av et bredt panel av markører tidligere beskrevet som forskjellig uttrykt i en rekke humane kreft stamceller. Data fra seks representative PLCCLs analysert ved forskjellige passasjer er gitt i Tabell S3. Uttrykket profilen avslørte et varierende mønster med noen fellestrekk. I to cellelinjer (SCLC LC004 og SCC LC021) testet gjentatte ganger fenotype forskjøvet under langtids
in vitro
kultur (tabell S3). Noen markører (CD29, CD49b og CD49f) ble jevnt uttrykt i høye nivåer i alle passasjer og alle cellelinjer studeres, mens andre, slik som CD44, CD166 og CD142, viste en høyere ekspresjon i senere sammenlignet med tidligere passeringer. Det motsatte ble observert for CD90 og CD326 uttrykk, hvor andelen av positive celler redusert med økende passasje nummer. Interessant, forskjellige små subpopulasjoner som uttrykker CD117, CD184 og CD15 var tilstede i hver av cellelinjene som ble testet. CD24 og CD326 viste variabel uttrykk nivå i ulike PLCCLs. Ekspresjonen av CD133 var lav, som testet av to forskjellige antistoffer, og varierte mellom 0 til 2,4% bekrefter resultatene oppnådd ved IHC.
således uttrykket nivå og hyppigheten av CD44 og /eller CD90 positive sub -populations var dynamisk, avslører differensial uttrykk for antigenene ved ulike tidspunkt. Disse forskjellige endringene som skjedde under langvarig kultur indikerer enten mulig utvalg av visse underpopulasjoner i langsiktig kultur eller respons på
in vitro
dyrkningsforhold.
Alt i alt, våre resultater (B). en. b. c. en. b.
