Abstract
Mens PCTAIRE1 /PCTK1 /Cdk16 er overuttrykt i ondartede celler og er avgjørende i tumorigenesis, dens funksjon i apoptose er fortsatt uklart. Her undersøkte vi rolle PCTAIRE1 i apoptose, særlig i den ekstrinsiske reaksjonsvei celledød. Gene-knockdown av
PCTAIRE1
lysfølsomt prostatakreft PPC1 og Du145 celler, og brystkreft MDA-MB-468 celler til TNF-familien cytokiner, inkludert TNF-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL). I mellomtiden hadde PCTAIRE1-knockdown ikke bevisst ikke-maligne celler, inkludert diploide fibroblaster IMR-90 og den udødelig prostata epitel cellelinje 267B1. PCTAIRE1-knockdown ikke opp-regulerer død reseptor uttrykk på celleoverflaten eller påvirke caspase-8, FADD og FLIP uttrykk nivåer. PCTAIRE1-knockdown gjorde fremme caspase-8 cleavage og RIPK1 nedbrytning, mens RIPK1 mRNA knockdown sensibilisert PPC1 celler til TNF-familien cytokiner. Videre kinase inhibitor SNS-032, som hemmer PCTAIRE1 kinase aktivitet, sensibiliserte PPC1 celler i Trail-indusert apoptose. Sammen disse resultatene tyder på at PCTAIRE1 bidrar til motstand av kreft cellelinjer til apoptose indusert av TNF-familien cytokiner, som innebærer at PCTAIRE1 hemmere kan ha synergieffekter med TNF-familien cytokiner for cytodestruction av kreftceller.
Citation : Yanagi T, Shi R, Aza-Blanc P, Reed JC, Matsuzawa Si (2015) PCTAIRE1-knockdown sensitizes kreftceller til å TNF Family cytokiner. PLoS ONE 10 (3): e0119404. doi: 10,1371 /journal.pone.0119404
Academic Redaktør: Andreas Villunger, Innsbruck Medical University, ØSTERRIKE
mottatt: 01.10.2014; Godkjent: 12 januar 2015; Publisert: 19 mars 2015
Copyright: © 2015 Yanagi et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Teruki Yanagi er støttet av JSP stipend for forskning i utlandet, Kanae fundament, og Sumitomo liv sosialtjenesten fundament. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. John C. Reed er en ansatt i Roche Group, AG. De andre forfatterne har ingen økonomisk interessekonflikt. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
PCTAIRE familien er en gren av kinaser relatert til CDK familie som inkluderer PCTAIRE1 (også kjent som cyklin-avhengige kinase 16 (Cdk16) og PCTK1), PCTAIRE2 og PCTAIRE3 [1]. PCTAIRE1 er bredt uttrykt i hele kroppen, med høyest nivå sett i hjernen og testis [2]. PCTAIRE1 er blitt vist å delta i spermatogenese [3] og regulering av intracellulære vesikler [4,5], så vel som translokasjon av glukosetransportproteiner [6] og neurittutvekst [7]. PCTAIRE1 har en sentral kinase domene som viser aminosyresekvensen likhet med CDK, og denne regionen er flankert av unike N-terminale og C-terminale domener. De mekanismene som er ansvarlig for PCTAIRE1 aktivering er ukjent, men opplever at sletting av N-terminale domenet opphever kinase aktivitet
in vitro
innebærer at denne regionen er viktig, og kan binde en ukjent kofaktor eller samhandle intra-molekylært med det sentrale kinase domene for å fremme aktive konformasjoner av det katalytiske domenet [1,7]. Det N-terminale domenet av PCTAIRE1 blir fosforylert av proteinkinase A (PKA), som hemmer dens aktivitet [3,8], mens interaksjonen av det N-terminale domenet av PCTAIRE1 med cyclin Y ble vist å stimulere kinase-aktivitet [3]. PCTAIRE1 samhandler også med COPII kompleks involvert i eksport av utskilte proteiner fra det endoplasmatiske retikulum [5].
Vi har nylig oppdaget at PCTAIRE1 spiller en uunnværlig rolle i kreftcelle spredning [9,10]. Vi viste også at PCTAIRE1-knockdown kreftceller fremmet mitotisk arrest i forbindelse med defekter i sentrosomen dynamikk. Videre fosforylerer PCTAIRE1 p27 ved Ser10, noe som letter p27 degradering. Imidlertid har funksjonen av PCTAIRE1 i apoptose ikke avklart.
apoptose indusert av TRAIL, Fas-ligand (Fasl) og TNF-alfa inntektene gjennom en serie av reseptor-mediert protein interaksjoner som minimal krever adapter protein FADD og cysteinproteaser så som caspase-8 or-10. Selv om disse dødsreseptor aliserte komplekse komponenter er beholdt i de fleste kreftformer, resistens mot apoptose forblir felles. FADD og caspase-8 er blant de mediatorer av den ekstrinsiske reaksjonsvei som er kjent for å bli modulert ved fosforylering protein, noe som antyder en rolle for kinaser i motstand mot pro-apoptotiske TNF-familien cytokiner. Protein kinaser er også attraktive mål for kreft medisiner. Videre har betydelige bevis foreslått en rolle for protein-fosforylering ved modulering av signaliserings proksimale hendelser indusert av TNF-familien døds reseptorer [11-19], så vel som å endre aktiviteten av anerkjente nedstrøms apoptose undertrykkere som FLIP og Bcl-2- og IAP-familien proteiner [18,20-24]. I denne forbindelse, fosforylering av dødsinduserende aliserte kompleks (DISK) komponenter Fas, FADD og caspase-8, så vel som caspase-8 substrat Bid og anti-apoptotiske undertrykkere døds reseptor-fremkalt apoptose (c-FLIP, XIAP) har blitt rapportert i forbindelse med svulst motstand mot TRAIL eller Fas [20-22,25].
i denne studien har vi preget rolle PCTAIRE1 i kreftceller, og spesielt dens funksjon i ytre celledød videre sti. Vi gir holdepunkter for at PCTAIRE1 spiller en avgjørende rolle for motstand mot TNF-familien cytokiner i kreftceller. Gene knockdown av
PCTAIRE1
lysfølsomt prostata og brystkreft celler til TNF-familien cytokiner, inkludert TNF-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) og Fas, men ikke bevisstgjøre normale eller ikke-transformerte celler til TRAIL. PCTAIRE1-knockdown forfremmet caspase-8 spalting og degradering av reseptor-samspill serin-treonin protein kinase 1 (RIPK1). SiRNA-mediert knockdown av RIPK1 mRNA også sensibilisert PPC1 celler til TNF-familien cytokiner. Våre funn tyder på at PCTAIRE1 kan være et viktig mål for kreftbehandling, og at PCTAIRE1 hemmere kan ha synergieffekter med TNF-familien cytokiner å drepe kreftceller.
Materialer og metoder
Reagenser og antistoffer
cellen levedyktighet analysen kit Cell Titer Glo ble kjøpt fra Promega. RNAiMAX ble hentet fra Life Technologies. Pre-designet short inter-RNA (siRNA) rettet mot humant PCTAIRE1 (siRNA Ids: 1472, 1566, 1656), PCTAIRE2 (s10160), PCTAIRE3 (s10162), caspase-8 (s2427), RIPK1 (s16653), p27 (s2837 ) og krafse-kontroll (# 1, # 2) ble kjøpt fra Life Technologies. Rekombinant TRAIL ble kjøpt fra Enzo Bioscience. SNS-032 ble kjøpt fra Selleck Chemicals. Antistoffer mot PCTAIRE1 (kanin polyklonale: HPA001366, Sigma), RIPK1 (610458, BD Transduksjon Lab), caspase-8 (1C12, # 9746, Cell Signaling Technology), kløyvde caspase-8 (# 9496, Cell Signaling Technology), fosfo caspase-8 (Ser387, # 710535, Life-teknologi), FADD (06-711, Millipore), fosfor-FADD (# 2781, Cell Signaling Technology), Fas /CD95 (CH-11, SY-001, MBL), DR4 (H-130, Santa Cruz), DR5 (N-19, Santa Cruz), FLIP (F6550, Sigma), fosfor-Serine (kanin polyklonale, 61-8100, Life Technologies), p27 (monoklonalt G173-524: BD Pharmagen, eller kanin polyklonale C-19, Santa Cruz), HA (Rat, 3F10, Roche), HA (mus, 12CA5, Roche), Myc (mus, 9E10, Roche), beta-aktin (mus monoklonalt, Sigma), alpha-tubulin (musmonoklonale, B-7, Santa Cruz) og pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer (GE Health Care) ble kjøpt fra de angitte kilder.
siRNA skjermen og dataanalyse
Den Ambion Silencer Menneskelig Druggable Genome siRNA Bibliotek V2 ble levert inn PPC1 celler ved omvendt transfeksjon i 384 brønners format på 10 nM siRNA hjelp RNAiMAX (Life Technologies). Etter 48 timer ble cellene behandlet med 3 ng /ml anti-FAS-antistoff (CH-11) eller DMSO i ytterligere 24 timer, tid hvoretter levedyktighet ble lest ved hjelp av ATP-lite (Perkin Eimer) i et Envision plateleser (Perkin Elmer Inc.). Rådata målinger ble normalisert til gjennomsnittet av negative kontroller inkludert i hver plate og duplikater i gjennomsnitt. Effekten av FAS-aktivering ble målt ved å beregne levedyktighet forholdstall CH-11 /DMSO for hver siRNA. En robust
Z
-score ble deretter tildelt hver siRNA. P-verdier ble også beregnet for hver siRNA ved hjelp av en to-hale T-test forutsatt en normal fordeling av dataene. For å fremstille en endelig gen poengsum, i gjennomsnitt vi Z-verdiene til de 2 eller 3 sirnas målrettet mot hvert gen, så vel som en P-verdi ved hjelp av levedyktighet forholdstall. Verdier for sirnas viser høyt standardavvik ( 0,25). Blant duplikater av enten DMSO eller CH-11 behandlede celler ble fjernet fra analysen
Plasmider
Point mutasjoner av PCTAIRE1 (K194M) var laget med en PCR-basert nettsted rettet mutagenese metode med
PFU
polymerase (Agilent). Ekspresjonsplasmider for ulike proteiner ble bygget i pcDNA3 vektor for transfeksjon eller pRDI292-puro vektor for lentivirus infeksjon. Passende plasmid konstruksjon ble bekreftet ved restriksjonsenzymkutting og DNA-sekvensering. Detaljene av primer sekvenser som brukes til å generere punktmutasjoner er tilgjengelig på forespørsel.
Cellelinjer og cellekultur
PPC1, Du145, MDA-MB-468, T47D, MCF7, IMR- 90, HeLa og HEK293T celler ble kjøpt fra ATCC. 267B1 og 267B1 /K-ras celler var snill gaver fra Dr. Dritschilo [26]. Alle celler brukes hadde færre enn seks måneder med kontinuerlig passasje.
Celleviabilitet analyser ved hjelp av ATP måling
Cell Titer Glo ble brukt for celle levedyktighet estimering. Celler ble sådd ut i 96-brønners faste, hvite plater ved en tetthet på 5.000 ~ 10 000 celler per brønn i 100 pl komplett medium med eller uten sirnas og dyrket i 48 timer. Cellene ble deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av cytokiner eller forbindelser i 24 timer. Cell Titer Glo løsning ble tilsatt i 100 ul per brønn og platene ble holdt i mørket i 15 minutter før du måler luminescens med en luminometer (Luminoskan Ascent, Thermo Scientific).
Analyse av apoptose
Celler ble behandlet ved hjelp av en AnnexinV-PI apoptose deteksjon kit i henhold til produsentens protokoll (Life Technologies) og analysert ved flowcytometri ved hjelp av en FACS Canto enhet (Becton Dickinson).
RNA interferens
for transient knockdown, ble cellene transfektert med siRNA tomannsboliger ved en omvendt transfeksjon metode med Lipofectoamine RNAiMAX i henhold til produsentens instruksjoner (Life Technologies).
Tet-induserbar korte hårnål RNA konstruksjoner, lentivirus og infeksjon
PCTAIRE1 shRNA # 1 (GCTCTCATCACTCCTTCACTT), PCTAIRE1 shRNA # 2 (GACCTACATTAAGCTGGACAA), og krafse-kontroll (CAACAAGATGAAGAGCACCAA) ble klonet inn i induserbar pLKO-Tet-On puromycin vektor [27]. Lentivirale supernatanter ble samlet i henhold til en etablert protokoll [27]. Celler ble valgt med 2 ug /ml puromycin (MP Biomedicals). Induksjon av shRNA ble oppnådd ved tilsetning av 100 ng /ml doksycyklin til mediet.
Ekstraksjon av total RNA og kvantitativ RT-PCR-analyse
Total RNA ble isolert fra dyrkede celler ved bruk av RNeasy pluss mini kit (Qiagen). RNA-konsentrasjonen ble målt spektrofotometrisk og prøver ble lagret ved-80 ° C til bruk sammen med RT-PCR. RNA ble revers-transkribert ved hjelp Hevet III (Life Technologies) og komplementære DNA-prøver ble analysert med SYBR grønn system (Promega). Primere spesifikke for human PCTAIRE1 er PCTAIRE2, PCTAIRE3, RIPK1 og kontroll housekeeping menneskelig GAPDH oppført nedenfor
Menneske PCTAIRE1
Videresend. 5’GCAGTGACCCTGGAGAGG-3 «
Reverse : 5’TCAAGTCCTCGTGCACAATC-3 «
Menneske PCTAIRE2
Forward: 5’TGTTATTGGAGGGAGCCTTG-3′
Omvendt: 5’TCTCACCATCTGATGCCATTT-3 «
Menneskelig PCTAIRE3
Forward: 5’ATGGCATCCACCTCCTGA-3 «
Omvendt: 5’TCTGCTGACATGCGACTCTT-3′
Menneske RIPK1
Forward: 5’GTGTACAAGGGGCCCAACT-3 «
Omvendt: 5’CGGCTGTGTCTCAGTCTGTT-3′
Menneske GAPDH
Forward: 5’GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 «
Omvendt. 5’ATGGGATTTCCATTGATGAC-3 «
Alle forsøkene ble utført i duplikat og normalisert i forhold til GAPDH nivåer
SDS-PAGE, immunoblotting og immunoprecipitation
Celler ble vasket to ganger med PBS og høstes med radioimmunopresipitasjonsanalyse analyse (RIPA) buffer inneholdende 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 0,1% SDS, 5 mM NaF og EDTA-fri COMPLETE protease cocktail tablett (Roche). Cellene ble igjen på is i 20 minutter og sentrifugert ved 14.000 x
g
i 10 minutter. Proteinkonsentrasjoner ble målt ved anvendelse av en Bio-Rad proteinanalysesett (Bio-Rad). For Laemmli SDS-PAGE ble proteiner separert på SDS-PAGE 4-15% stigning gels (Life Technologies) og overført på nitrocellulosemembraner (Bio-Rad). Phos-tag SDS-PAGE ble utført med prefabrikerte phostag gels (12,5% polyakrylamidgeler inneholder 50 M Phos-tag akrylamid, Wako). Etter elektroforese ble Phos-tagg akrylamidgeler vasket med rennende buffer (25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,1% SDS) som inneholdt 5 mM EDTA i 10 minutter med forsiktig risting, og deretter vasket på ny med rennende buffer uten EDTA i 10 min i henhold til produsentens protokoll (Wako Chemical). Proteiner ble overført til nitrocellulosemembraner. Etter blokkering i 1 time i Tris-bufret saltvann (TBS) med 0,05% Tween-20 og 5% ikke-fett tørrmelk, ble membranene inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer fortynnet i blokkeringsbuffer. Membraner ble skylt tre ganger i TBS med 0,05% Tween-20 og inkubert med sekundær HRP-konjugert antistoff i 1 time ved romtemperatur. En forsterket kjemiluminescens (ECL) -metoden (GE Helse) ble anvendt for påvisning.
For immunutfelling (IP) ble cellene lysert i 1% NP40-buffer inneholdende 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl , 0,1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 5 mM NaF og EDTA-fri komplett protease cocktail tablett. Tre milligram protein lysatet ble anvendt for immunopresipitering med inkubering over natten ved 4 ° C og 2 ug av det gitte antistoff. Den følgende dag ble 30 ul av protein G-harpiks (Life Technologies) tilsatt og inkubert i 1 time ved 4 ° C. IP-adressene ble deretter vasket fire ganger med lyseringsbuffer hvoretter prøvebuffer ble tilsatt, og kulene ble kokt i 10 minutter ved 100 ° C.
klonogene assay for vurdering av Fas /TRAIL følsomhet
celler ble sådd i 35 mm retter på 1,0 x 10
5 celler per brønn og deretter tilført med kontroll eller PCTAIRE1 målretting sirnas. Etter 2 dager, agonistisk anti-Fas-ab (CH-11) eller TRAIL ble tilsatt, og cellene ble dyrket i 3 dager før fiksering og farging med 0,5% krystallfiolett fargestoff. For fiksering, ble celler inkubert med metanol ved -20 ° C i 20 minutter, vasket med PBS, og inkubert med 0,5% krystallfiolett fargestoff i 25% metanol i 15 minutter.
FACS-analyse av Fas /DR4 /DR5 uttrykk på celleoverflaten
PPC1 og MDA-MB-468 celler (1,0 x 10
5) som ble omvendt-transfektert med sirnas rettet mot PCTAIRE1 og rykke kontroll ble sådd i 6 cm retter. Førti-åtte timer etter revers-transfeksjon, ble adherente celler vasket en gang med PBS, frittliggende ved hjelp av TripleExpress (Gibco), og resuspendert i iskald FACS-buffer (1% FBS i PBS). Etter sentrifugering ble cellene resuspendert i FACS-buffer ved 3,0 x 10
5 celler /100 ul. Cellene ble deretter inkubert i mørke på is med mettende konsentrasjoner av fykoerytrin-merket anti-DR4, anti-DR5 (eBioscience), FITC-merket anti-Fas (BD Pharmagen), eller immunoglobulin G1 isotype kontroll-antistoff i 1 time i henhold produsentens instruksjoner. Totalt 10.000 hendelser ble analysert ved flowcytometri for hver behandling.
Synkronisering
Å arrestere HeLa-celler i tidlig S-fasen, dobbel tymidin block-metoden ble benyttet [10]. I korthet, tymidin (2,5 mM) ble tilsatt til kulturen i 14 timer, og cellene ble frigjort fra blokken ved å vaske tre ganger med PBS. Etter 8 timer ble tymidin lagt igjen. Etter en andre behandling i 14 timer ble cellene frigjort fra blokken.
kvantitativ måling og statistisk analyse
middelverdier og standardavvik (SD) ble beregnet statistisk fra tre bestemmelser. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Statistisk signifikans av forskjeller mellom forskjellige prøver ble bestemt ved t-test. P 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Identifikasjon av PCTAIRE1 kinase av siRNA bibliotek screening
For å identifisere kandidatdempere eller forsterkere av Fas-indusert apoptose i tumorceller, optimalisert vi to typer high throughput screening (HTS) analyser for siRNA bibliotek screening. Ved hjelp av PPC1 prostata kreftceller, fant vi ut at stimulering med lav dose anti-Fas-antistoff CH11 (3 ng /ml) resulterte ikke i cytotoksisitet, mens stimulering med høy dose anti-Fas-antistoff (25 ng /ml) drepes disse tumorcellene. Ved hjelp av kontroll siRNAs å validere analysen, fant vi ut at 3 av 3 sirnas målretting FLIP lysfølsomt PPC1 celler til lavdose (3 ng /ml) anti-Fas antistoff, mens 3 av 3 sirnas rettet mot FADD hemmet PPC1 drap indusert av høye doser ( 25 ng /ml) anti-Fas-antistoff. Etter å ha brukt disse kontroll sirnas å optimalisere HTS-analyser til en Z-faktor 0.5, vi deretter screenet et bibliotek med 16.800 siRNAs rettet mot 5.600 gener (3-fold dekning), som utgjør den såkalte «druggable genom». PPC1 celler i 384 brønners plater ble «omvendt» transfektert med sirnas, deretter 2 dager senere CH11 antistoff ble tilsatt og celleviabilitet vurdert ved hjelp av en bioluminiscens analyse for å bestemme ATP nivåer en dag senere (S1 Fig., S1 datasettet). Effekten av FAS-aktivering ble målt ved å beregne levedyktighet forhold Fas /DMSO for hver siRNA. For å produsere en endelig gen score, gjennomsnitt vi Z verdiene av de 2 eller 3 sirnas rettet mot hvert gen. For lav dose (3 ng /ml) skjermen, ble PCTAIRE1 kinase identifisert som en suppressor av Fas-indusert apoptose.
Gene knockdown av PCTAIRE1 sensitizes kreftceller til TNF-familien cytokiner
for å vurdere hvilken rolle PCTAIRE1 på TNF-familien cytokiner i prostatakreft PPC1 celler videre, brukte vi siRNAs rettet mot PCTAIRE1. Immunoblotting ble først utført for å bekrefte knockdown på proteinnivå (fig. 1A). Ved hjelp av 3 sirnas som på en vellykket slått ned PCTAIRE1 ekspresjon, observerte vi sensibilisering av PPC1 celler til anti-Fas-antistoff (CH-11), TRAIL, og TNF-alfa (fig. 1B og C, og S2A fig.). AnnexinV flekker eksperimenter uavhengig bekreftet disse resultatene, og gitt bevis for at en apoptotisk mekanisme var involvert (Fig. 1 D). I motsetning til Fas (CH-11), TRAIL og TNF, gjorde PCTAIRE1 knockdown ikke bevisst PPC1 cellene til andre celledødsveier, inkludert stimuli som kan initiere apoptose trasé fra det endoplasmatiske retikulum (thapsigargin) og mitokondrier (staurosporin) (S2B Fig. Og data ikke vist). Lignende konklusjoner ble nådd da klonogene overlevelse ble vurdert, med alle 3 sirnas rettet mot PCTAIRE1 sensibiliserende PPC1 celler til Fas (CH-11) og TRAIL (Fig. 1E og F). I kontrast, gjorde siRNA-mediert knockdown av PCTAIRE2 eller PCTAIRE3 ikke sensitiv PPC1 celler til Fas, TRAIL eller TNF (S2C-H fig.). Vi vurderte også effekten av PCTAIRE1-knockdown på kjemosensitivitet av celler til cisplatin og paclitaxel. PPC1 celler med PCTAIRE1-knockdown ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av cisplatin og paclitaxel, og vurdering av cellelevedyktighet viste ingen signifikante synergistiske cytotoksiske effekter i PPC1 celler (S2I-N Fig.). Vi vurderte ytterligere siRNA-mediert PCTAIRE1-knockdown i andre cellelinjer, og fant at i brystkreft MDA-MB-468-celler PCTAIRE1-knockdown var effektiv ved å gjenopprette sensitivitet overfor Fas eller TRAIL (S3A-F fig.). Men som ville bli forventet for heterogenitet sett i kreft hos mennesker, effekten av PCTAIRE1 knockdown var ikke ensartet i at mindre robuste effekter ble observert med human brystkreft MCF7 celler (S3G-I fig.).
( A) PPC1 celler ble transfektert med egge RNA eller tre forskjellige siRNAs rettet mot PCTAIRE1 (sirnas 1472, 1566, 1656). Lysater fra celler ved 48 timer etter transfeksjon ble fremstilt siRNA, normalisert til totalt proteininnhold, og aliquoter ble analysert ved immunoblotting ved anvendelse av anti-PCTAIRE1 (øverst) eller anti-alfa-tubulin (nederst) antistoffer. (B, C) PPC1 celler ble transfektert med kontroll RNA (lilla «x») eller ulike sirnas målretting PCTAIRE1 (blå diamanter, 1472; røde firkanter, 1566, grønne trekanter, 1656). Etter 48 timer ble celler stimulert med enten anti-Fas-antistoff (CH-11) (B) eller TRAIL (C) ved forskjellige konsentrasjoner som angitt. Etter 24 timer ble det cellulære ATP-nivåer målt som et surrogat indikator på cellelevedyktigheten ved hjelp av Cell Titer Glo reagenser, og dataene er uttrykt som forholdet mellom celler dyrket med og uten anti-Fas (B), og TRAIL (C). (D) apoptose analyser ble utført ved anvendelse av en annexinV kit. PPC1 celler ble transfektert med krafse RNA av siRNAs rettet mot PCTAIRE1. Etter 48 timer ble celler behandlet med anti-Fas-antistoff (100 ng /ml) eller TRAIL (50 ng /ml) i 4 timer. * P 0,05, *** P 0,001 ved t-test. Alle data representerer gjennomsnitt ± SD (n = 3). (E, F) klonogene overlevelsesanalyser. PPC1 celler ble sådd i 6 brønn (35 mm) retter på 1,0 x 10
5 celler per brønn og deretter reversere-transfektert med scramble-kontroll eller PCTAIRE1 målretting siRNAs som angitt. Etter 48 timer, anti-Fas antistoff (E, 10 ng /ml) eller TRAIL (F, 20 ng /ml) ble tilsatt, og cellene ble dyrket i 3 dager før fiksering og farging med 0,5% krystallfiolett fargestoff. (G, H) PPC1 celler ble transfektert med kontroll RNA eller tre forskjellige siRNAs rettet mot PCTAIRE1. Etter 48 timer ble cellene stimulert med Fas (G, 10 ng /ml) eller TRAIL (H, 10 ng /ml). Etter 3 timer, ble cellelysater fremstilt, normalisert til totalt proteininnhold, og analysert ved immunoblotting ved å bruke et antistoff som er spesifikt for spaltet caspase-8. Den delvis spaltede 43/41 kDa-bånd og fullstendig spaltet for 18 kDa-båndet er angitt, så er molekylvektmarkører (kDa). Blottet ble reprobed med beta-aktin antistoff som en lasting kontroll. (I) PPC1 celler ble transfektert med scramble-kontroll eller siRNA rettet mot PCTAIRE1 (si-1472). Etter 48 timer ble cellene eller ikke ble stimulert med anti-Fas-antistoff (CH-11, 10 ng /ml). Etter 3 timer, ble cellelysater høstet og immunopresipitert med anti-kaspase 8-antistoff, etterfulgt av immunblotting med de angitte antistoffer. De røde pilene indikerer uspesifikke bånd.
Aktivering av caspase-8 indusert av TNF-familien dødsreseptorer er ledsaget av proteolytisk prosessering av ~ 50 kDa pro-caspase-8 molekyl i første omgang å gi ~ 43/41 kDa delvis bearbeidet molekyler og til slutt å produsere de ~ 18 ~ og 10 kDa subenheter av katalytisk aktive protease. Vi brukte immunoblotting for å overvåke effekten av siRNA-mediert knockdown av PCTAIRE1 på den proteolytiske prosessering av pro-kaspase-8. SiRNA-mediert stanse av PCTAIRE1 i PPC1 celler faktisk økt Fas- og TRAIL-indusert behandling av caspase-8 sammenlignet med kontroll RNA (Fig. 1 G og H). Vi har også observert at sammenstillingen av FADD /caspase-8-kompleks (dødsinduserende aliserte kompleks: DISC) i Fas-behandlede PPC1 celler med PCTAIRE1 knockdown (Fig 1I.). Motsatt, knockdown av caspase-8 confered Fas-motstand på PPC1 celler med PCTAIRE1-knockdown (data ikke vist).
De siRNA-mediert PCTAIRE1-knockdown effekter på ytre celledød sti ble også gjengitt ved hjelp tetracycline- induserbare shRNA vektorer som introduseres av lentivirusinfeksjon [27]. I PPC1 celler som stabilt ble smittet med to forskjellige shRNAs som målretter PCTAIRE1 (shRNA # 1 og # 2), dyrking av den tetracyklin-analog doksycyklin i redusert PCTAIRE1 proteinnivåer (Fig. 2A). Korrelere med disse reduksjonene i PCTAIRE1 protein, doksycyklin også restaurert PPC1 følsomhet for Fas og TRAIL, som indikert av celleviabilitet analyseresultatene (Fig. 2B-E). Lignende resultater ble oppnådd med to andre tumorcellelinjer (MDA-MB-468 og Du145 celler) som var stabilt transdusert med tetracyklin-induserbar PCTAIRE1 shRNA vektorer (S4 og S5 fig.). Fra disse resultatene, konkluderer vi med at PCTAIRE1 overfører Fas /TRAIL motstand på epiteliale kreftceller.
(A) PPC1 celler som stabilt inneholder induserbare shRNAs rettet mot ulike steder på PCTAIRE1 mRNA (shRNA # 1, # 2) eller scramble- kontroll ble dyrket i 48 timer med doksycyklin (Dox, 100 ng /ml). Protein lysater ble samlet, normalisert til total proteinkonsentrasjon, og analysert ved hjelp av SDS-PAGE /immunblotting ved anvendelse av antistoffer for PCTAIRE1 (øverst) og beta-aktin (nederst). (B, C) PPC1-celler ble dyrket med (ON) eller uten (AV) 100 ng /ml Dox i 48 timer, deretter stimulert med forskjellige konsentrasjoner av enten anti-Fas-antistoff CH-11 (B) eller TRAIL (C). Etter 24 timer ble det cellulære ATP-nivåer målt, og dataene uttrykt som et forhold i forhold til celler dyrket uten anti-Fas eller TRAIL (gjennomsnitt ± SD; n = 3). (D, E) klonogene overlevelsesanalyser. PPC1 celler som stabilt inneholdende induserbar shRNAs (krafse eller shRNA # 2) ble dyrket med (ON) eller uten (AV) 100 ng /ml Dox i 48 timer, deretter stimulert med anti-Fas-antistoff (CH-11, 10 ng /ml) eller TRAIL (20 ng /ml). Cellene ble dyrket i 3 dager før montering og farging med 0,5% krystallfiolett farge.
Transformerte celler er fortrinnsvis avhengig PCTAIRE1 for motstand mot Trail
Blant de TNF-familien cytokiner, TRAIL regnes som den mest lovende våpen for å bekjempe kreftceller fordi TRAIL følsomhet er observert hovedsakelig i svulsten, men ikke normale celler [28,29]. Videre histopatologiske analyser av primær prostata og bryst vev viste at PCTAIRE1 immunfarging var meget lav i normalt vev, men vesentlig høyere i-kreft [10]. Disse observasjoner tyder på at PCTAIRE1-knockdown ikke vil påvirke den ekstrinsiske reaksjonsvei celledød i normale celler. For å støtte denne muligheten, undersøkte vi knockdown av PCTAIRE1 i humane diploide fibroblast linje IMR-90. I disse cellene siRNA-mediert PCTAIRE1-knockdown ikke påvirker TRAIL følsomhet som bedømt ved måling av ATP-nivåer (fig. 3A og D). For ytterligere å undersøke hvilken rolle PCTAIRE1 i normal versus transformerte celler, søkte vi PCTAIRE1-sirnas å udødelig 267B1 normale prostata epitelceller og deres K-ras (V12) forvandlet isogen motstykke, 267B1 /K-ras celler [26], etterfulgt av bekreftelse av siRNA effekt ved hjelp av immunblotting (fig. 3B og C). Følsomhet for TRAIL ble vurdert av ATP nivåer, noe som indikerte at 267B1 /K-ras celler med PCTAIRE1 knockdown var bemerkelsesverdig følsomme for Trail sammenlignet med kontroll 267B1 /K-ras celler med scramble-siRNA (Fig. 3F). I motsetning til dette, ikke-transformerte celler med 267B1 PCTAIRE1-knockdown viste ingen signifikant endring i TRAIL følsomhet i forhold til å rykke ut-kontrollceller (fig. 3E). Disse resultatene tyder på at de transformerte cellene er fortrinnsvis avhengig PCTAIRE1 for motstand mot TRAIL.
(AC) fibroblaster IMR-90 (A), 267B1 udødelig normale prostata epitelceller (B), og K-ras transform 267B1 (267B1 /K-ras) celler (C) ble transfektert med egge RNA eller tre forskjellige siRNAs rettet mot PCTAIRE1 (sirnas: SI-1472, si-1566, si-1656). Lysater av cellene 72 timer etter transfeksjon ble utarbeidet og analysert ved immunoblotting hjelp kanin anti-PCTAIRE1 (øverst) eller anti-beta-aktin (nederst) antistoffer. (D-F) IMR-90, ble 267B1 og 267B1 /K-ras celler transfektert med siRNAs. Etter 48 timer ble celler stimulert med TRAIL ved forskjellige konsentrasjoner som angitt. Etter 24 timer ble mobilnettet ATP nivåer målt, og dataene uttrykkes som et forhold mellom celler dyrket med og uten TRAIL (gjennomsnitt ± SD, n = 3)
PCTAIRE1-knockdown modulerer RIPK1 protein uttrykk.
for å utforske den mekanismen som PCTAIRE1 undertrykker apoptose indusert av TRAIL /Fas, vi undersøkt effekten av PCTAIRE1 knockdown på uttrykket av ulike proteiner som har vært innblandet i TNF-familien cytokin reseptor signalveien. Fordi PCTAIRE1-knockdown sensibilisert PPC1 celler til døden reseptor stimuli (FAS TRAIL), men ikke agenter som utløser andre celle dødsveier, mistenkt vi at PCTAIRE1 kan blokkere en proksimale skritt i Fas og TRAIL reseptor signalisering. Den kritiske hendelsen for å initiere apoptose vei indusert av TNF-familien cytokiner er aktivering av caspase-8, som krever adapter protein FADD, og blir motarbeidet av FLIP. Som vist ovenfor, PCTAIRE1-knockdown aktivert caspase-8-behandling (fig. 4A), men PCTAIRE1-knockdown påvirket ikke uttrykk nivåer av FADD, procaspase-8 eller c-FLIP (S6a fig.). Måling av celleoverflatenivå (ved FACS) eller total cellulære nivåer (ved immunblotting) av Fas, TRAIL-reseptor 1 (død receptor 4, DR4), eller TRAIL-reseptor 2 (død reseptor 5, DR5) viste heller ingen reproduserbare forskjell mellom kontroll og PCTAIRE1-knockdown celler (S6a og B fig., og data ikke vist). Videre, mens fosforylering av caspase-8 og FADD er angivelig involvert i motstanden mot TNF familie cytokiner [11,12,30], vi har oppdaget noe bemerkelsesverdig endring i fosforylering nivåer av caspase-8 (Ser387) eller FADD (Ser194) i PCTAIRE1 overekspresjon /knockdown PPC1 celler (S6C-F fig.).
(A) PPC1 celler ble transfektert med kontroll RNA eller tre forskjellige siRNAs rettet mot PCTAIRE1. Etter 48 timer, ble cellelysater fremstilt med RIPA-buffer, normalisert til totalt proteininnhold, og analysert ved immunoblotting ved å bruke de angitte antistoffer. (B) PPC1-celler ble transfektert med angitte sirnas i 48 timer, hvoretter cellelysater ble samlet i 1 x Laemmli-buffer og utsatt for immunblotting-analyse for RIPK1 (øverst) og beta-aktin (i midten). (C, D) PPC1-celler ble transfektert med de angitte sirnas. Etter 48 timer ble cellene behandlet med den proteasominhibitor MG-132 (10 uM) i 5 timer før fremstilling av cellelysater (C: 1 x Laemmli-buffer, D: RIPA-buffer). (E) PPC1 celler ble transfektert med kontroll RNA eller siRNA målretting RIPK1. Etter 48 timer, ble cellelysater fremstilt i RIPA-buffer, normalisert til totalt proteininnhold, og analysert ved immunoblotting ved å bruke de angitte antistoffer. (F, G) PPC1 celler ble transfektert med kontroll RNA eller siRNA målretting RIPK1. Etter 48 timer ble celler stimulert med enten anti-Fas-antistoff (CH-11) (F), TRAIL (G) ved forskjellige konsentrasjoner som angitt.
