Abstract
Bakgrunn
Dødeligheten er betydelig høyere i septik pasienter med kreft enn i septik pasienter uten en historie av kreft. Vi har tidligere beskrevet en modell for kreft i bukspyttkjertelen etterfulgt av sepsis fra
Pseudomonas aeruginosa
lungebetennelse som kreft septisk mus har høyere dødelighet enn tidligere friske septik mus, assosiert med økt gut epitel apoptose og redusert T-celle apoptose. Hensikten med denne studien var å finne ut om dette er en vanlig vertsrespons ved å opprette en ny modell der både type kreft og modellen av sepsis er endret.
Metoder
C57Bl /6-mus mottok en injeksjon på 250.000 celler av lungekreft linje LLC-en inn i sin høyre lår, og ble fulgt tre uker for utvikling av palpable tumorer. Mus med kreft og mus uten kreft ble deretter utsatt for cecal ligering og punktering og avlivet 24 timer etter utbruddet av sepsis eller fulgt 7 dager for å overleve.
Resultater
Kreft septisk mus hadde en høyere dødelighet enn tidligere frisk septisk mus (60% vs. 18%, p = 0,003). Cancer septisk mus hadde redusert antall og hyppighet av milten CD4 + lymfocytter sekundære økt apoptose uten endringer i milt CD8 + nummer. Tarm spredning ble også redusert i kreftseptik mus. Kreftseptik mus hadde et høyere bakteriemengden i bukhulen, men dette var ikke assosiert med endringer i lokale cytokin, nøytrofile eller dendrittiske celle responser. Kreft septisk mus hadde biokjemiske tegn på forverret nyrefunksjon, men det var ingen histologisk tegn på nyreskade.
Konklusjoner
Dyr med kreft har en betydelig høyere dødelighet enn tidligere friske dyr følgende sepsis. De potensielle mekanismer som er knyttet til denne forhøyede dødelighet variere betraktelig basert på den modell av kreft og sepsis utnyttet. Mens lymfocytt apoptose og tarm integritet både endret av kombinasjonen av kreft og sepsis, varierer mønstre av disse endringene i stor grad avhengig av modellene som brukes
Citation. Lyons JD, Mittal R, Fay KT, Chen CW, Liang Z, Margoles LM, et al. (2016) Murine lungekreft øker CD4 + T celle apoptose og Reduserer Gut proliferativ kapasitet i sepsis. PLoS ONE 11 (3): e0149069. doi: 10,1371 /journal.pone.0149069
Editor: Philip Alexander Efron, University of Florida, USA
mottatt: 26 august 2015; Godkjent: 27 januar 2016; Publisert: 28 mars 2016
Copyright: © 2016 Lyons et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra National Institutes of Health (GM104323, GM095442, GM072808, GM109779, GM113228). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Dr. Cooper er president i Society of Critical Care Medicine. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Sepsis er de viktigste årsakene til dødsfall blant kritisk syke pasienter i USA med mellom 230 000 og 370.000 mennesker dør av sykdommen hvert år [1]. Pasienter med kreft er nesten ti ganger større sannsynlighet for å utvikle sepsis enn den generelle befolkningen [2], og kreft representerer den vanligste tilleggslidelser i septik pasienter [3-5]. Sepsis er også den ledende årsak til ICU adgang i pasienter med kreft [6,7]. Viktigere, er kreft også co-morbiditet forbundet med høyest risiko for død i sepsis, med sykehus dødelighet over 50% hos pasienter med kreft og enten alvorlig sepsis eller septisk sjokk [5,7-9].
Årsaken bak den økte dødeligheten sett hos kreftpasienter som utvikler sepsis sammenlignet med tidligere friske pasienter som utvikler sepsis er multifaktoriell [2,10]. Mens noen dødsfall er relatert til immunsuppresjon forårsaket av kreftbehandling som cellegift eller stråling, andre er sannsynligvis relatert til en redusert evne til verten til å reagere på infeksjon i innstillingen av kroniske systemiske endringer knyttet til underliggende malignitet. Dyremodeller av kreft, isolert sett, viser at det ikke bare er svulsten mikromiljøet endret, men at systemisk T-celle utmattelse og generalisert immunsuppresjon er også indusert av kreft [11]. Videre er vertsrespons til en ikke-dødelig infeksjon vesentlig endret ved kreft, med fenotypisk utmattelse i T-celler assosiert med økt ekspresjon av ko-inhibitoriske reseptorer [12].
Det er mange likheter i vertsrespons til både kreft og sepsis [13]. I et forsøk på å forstå hvorfor verter med kreft har økt dødelighet etter sepsis sammenlignet med tidligere friske verter, har vi beskrevet en modell for kreft i bukspyttkjertelen etterfulgt av sepsis fra
Pseudomonas aeruginosa
lungebetennelse [14]. Dødeligheten var høyere i kreft septisk mus enn tidligere friske mus, og dette var forbundet med en reduksjon i T-lymfocytt apoptose og en økning både i tarm epitel apoptose og bakteriemi. Interessant, hindrer lymfocytt apoptose-en strategi knyttet til uniform suksess i andre prekliniske modeller av sepsis-var assosiert med økt dødelighet hos kreftseptik mus [15].
Til tross for at en større forståelse av patofysiologien ved sepsis enn noen gang før [16-18], har det vært en bemerkelsesverdig evne til å oversette prekliniske modeller for sepsis til effektive behandlinger på sengen, der ledelsen er generelt støttende ennå ikke-selektive, med unntak av målrettet antimikrobiell behandling [19]. En grunn (av mange) for svikt i pre-kliniske studier for å oversette til effektive behandlinger for sepsis er at dyreforsøk er utført i et homogent tidligere frisk befolkning, mens menneskelige studier er utført på heterogene pasienter ofte med flere tilleggslidelser. Som sådan, forsøkte vi å finne ut om våre tidligere pre-kliniske funn i kreft og sepsis vil kunne generaliseres hvis vi endret både type kreft og modellen av sepsis. For å undersøke dette, har vi utviklet en ny klinisk relevant modell av lungekreft etterfulgt av sepsis indusert av cecal ligering og punktering.
Materialer og metoder
Dyr
Mannlige og kvinnelige C57BL /6 mus ble benyttet i alle forsøk, med kjønn tilpasning mellom forsøks- og kontrollgrupper. Dyrene var 6-8 ukers alder før oppstart av eksperimenter. En undergruppe av dyr ble deretter injisert med tumorceller (se detaljer nedenfor), og alle musene ble deretter overvåket i ytterligere tre uker før en undergruppe ble utsatt for cecal ligering og punktering (CLP, også beskrevet nedenfor) da de ble overvåket for en -7 dager avhengig av om de ble brukt for ikke-overlevelse eller overlevelse eksperimenter. Dermed dyr var et minimum 9 uker gammel og maksimalt 12 uker gamle på tidspunktet for offer. Forsøk ble utført i henhold til National Institutes of Health Retningslinjer for bruk av forsøksdyr, og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Emory University School of Medicine (Protocol DAR-2001875-082815BN). Alle dyr ble plassert i et godkjent universitet dyr anlegget og fikk fri tilgang til mat og vann gjennom. Dyr som ble injisert med tumorceller ble overvåket for å sikre at svulster ikke sår og ikke hindre dyr ambulation henhold til Emory IACUC retningslinjer for tumorbyrde. Etter CLP, alle dyr mottok buprenorfin postoperativt i et forsøk på å minimalisere dyr lidelse. For ikke-overlevelse studier ble dyrene avlivet 24 timer etter operasjonen via kveling av CO2 eller blodtapping i henhold til dyp ketamin anestesi. En annen undergruppe av dyrene ble fulgt for å overleve i 7 dager postoperativt. I løpet av denne overlevelse eksperimentet ble dyrene sjekket to ganger daglig. I tillegg til å observere de samme endepunkt som er skissert ovenfor har med tumorvekst, ble dyrene også sjekket for å bestemme om de var døende relatert til operasjonen. Dyr som enten møtte kreft endepunkter eller var døende ble avlivet ved hjelp av humane endepunkter. Døende dyr ble identifisert som følger: a) kirurgiske komplikasjoner svarer til umiddelbar intervensjon (sårruptur, blødning, infeksjon), b) medisinske tilstander som ikke responderer på behandling som selvskading, alvorlig pustevansker, ikterus, stor organsvikt eller vanskelige diaré, eller c) kliniske eller atferdsmessige tegn som ikke reagerer på aktuelle tiltak som varer i en dag inkludert betydelig inaktivitet, anstrengt pust, innsunkne øyne, krum holdning, piloereksjon /sammenfiltret pels, en eller flere unresolving huden sår, og unormal vokalisering når håndteres. Dyr som overlevde 7 dager etter operasjonen ble avlivet ved avslutningen av dette eksperimentet ved hjelp av kvelning av CO2.
Kreft modell
En murine lungekarsinom cellelinje (LLC1, American Type Culture Collection, Manassas , VA) ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 1% glutamin, 1% penicillin-streptomycin og 1% 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre. Begrunnelsen for bruk av en kreftcelle lungelinjen er at lungekreft har den nest høyest dødelighet for solide svulster i septik pasienter (2) (kreft i bukspyttkjertelen er den høyeste og ble brukt for våre tidligere eksperimenter i sepsis og kreft). Etter ekspansjon ble kreftcellene dissosiert fra vekst kolber via inkubering med 0,25% trypsin, vasket, sentrifugert i 10 minutter ved 1500 rpm og deretter re-suspenderes i fosfat-bufret oppløsning (PBS) til en endelig konsentrasjon på 250.000 celler per 0,2 ml (levende celler utvalgte via trypanblått undersøkelse). Mus randomisert til å få kreft hadde en enkel subkutan injeksjon av 250.000 kreftceller langs høyre indre lår (kreft gruppe) og ble fulgt i 3 uker før CLP å tillate tumorvekst. Kontroll mus var umanipulerte og dermed hadde ingen intervensjon før CLP (tidligere frisk gruppe), men ble overvåket for en identisk tid som kreft mus så dyr ville være alder matchet.
Sepsis modell og eksperimentelle grupper
en undergruppe av kreft mus og tidligere friske mus ble deretter utsatt for CLP, en etablert modell av polymikrobielle peritonitt [20]. I korthet under isoflurananestesi, ble en liten midtlinjen abdominal snitt gjort, og cecum ble exteriorized og ligert under ileocecal ventil, unngå intestinal obstruksjon. Cecum ble punktert to ganger med en 25 gauge nål og presset forsiktig for å ekstrudere en liten mengde avføring. Etter å ha plassert cecum tilbake i magen, ble bukveggen stengt i lag. Umiddelbart etter CLP, mus mottok subkutane injeksjoner av a) fluider (1 ml 0,9% saltvann) for å ta høyde for umerkelige tap, b) antimikrobielle midler (50 mg /kg av ceftriakson, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO og 35 mg /kg metronidazol, Apotex Corp, Weston, FL) for å etterligne den kliniske situasjonen der septik pasienter får antimikrobiell terapi og c) smertestillende medikamenter (0,1 mg /kg buprenex, McKesson Medical, San Francisco, California) for å minimere smerte og lidelse. Dyr var enten fulgt 7 dager for å overleve eller ofret på 24 timer for prøvetaking. Antibiotika ble gjen dosert ved 12, 24 og 36 timer etter operasjonen i overlevelse studier.
Vi har tidligere publisert en omfattende immunologisk vurdering av lungekreft i umanipulerte mus [11] så ikke gjenta disse studiene. Vi har imidlertid ikke tidligere har data på mange av resultatene analysert i denne studien og så utførte eksperimenter i både septik og ikke-septisk dyr eventuelt, for å forstå effekten av kreft i isolasjon, sepsis isolert, og kombinasjonen av kreft og sepsis. Følgende er terminologien som brukes for hver forsøksgruppe: a) umanipulerte (mus som fikk verken kreft eller sepsis), b) kreft (mus som fikk svulst celle injeksjon alene), c) tidligere frisk septik (mus som gjennomgikk CLP alene uten forhånds intervensjon), og d) septisk cancer (mus med tumorcelle-injeksjon, etterfulgt tre uker senere av CLP).
Leukocyte analyse
Fenotypisk strømningscytometrisk analyse av leukocytter ble utført på bearbeidede cellulære suspensjoner av splenocytter (hele milten fjernet på tidspunktet for offer) eller peritoneal væske (2,5 ml PBS injisert i bukhinne og trukket tilbake etter 5 sekunder med forsiktig risting). Antallet celler pr ml av suspensjonen ble beregnet ved bruk av en Nexcelom Auto Cellometer, og resultatene av disse ble anvendt for å bestemme absolutte celle tall. Følgende antistoffer ble brukt til å farge cellene før analyse: for peritoneal væske, anti-GR1.1 FITC (BD Biovitenskap, San Jose, CA), anti-CD11b PerCP (BioLegend, San Diego, CA), anti-CD11c PeCy7 ( eBioscience, San Diego, CA), og anti-MHC II APC Cy7 (eBioscience); for splenocytt fenotyping, anti-F4 /80 PerCP (BioLegend), anti-CD11c PeCy7 (eBioscience), anti-CD11b APC (eBioscience), anti-B220 Alexa700 (BD Biovitenskap), og anti-MHC II APC Cy7 (eBioscience).
for å bestemme frekvensen av apoptotiske lymfocytter, splenocytter ble samlet inn fra ofret dyr og bearbeidet til en suspensjon av 1×10
7cells /ml, og 1×10
6 splenocytes ble deretter behandlet med en kommersielt tilgjengelig Annexin V og 7-AAD kit (BioLegend) etter produsentens anvisninger. Cellene ble deretter farget med anti-CD4-PO (Invitrogen, Carlsbad, CA), anti-CD8-PB (eBioscience) for å bestemme frekvensen av pro-apoptotiske CD4 og CD8 T-celler. En lede strategi utelukket døde celler farging positiv for 7-AAD fra analysen.
For prøver som gjennomgår intracellulær farging cytokin, 1 x 10
6 splenocytter ble platet inn i en 96-brønns plate. Cellene ble suspendert og inkubert i RPMI 1640-dyrkningsmedium og stimulert i fire timer ved anvendelse forbol 12-myristat 13-acetat (30ng /ml) og ionomycin (400ng /ml) med 10 ug /ml av Brefeldin A ved 37 ° C. Etter stimulering ble cellene farget med anti-CD4 PacBlue (BD Bioscience), anti-CD8 PacOrange (Life Technologies Carlsbad, CA), anti-IL-2-FITC (BD Bioscience), anti-IL-4-PE (eBioscience), anti-CD44 PerCP (BioLegend), anti-CCR4 PeCy7 (BioLegend), anti-CXCR3 APC (eBioscience), og anti-IFNy Alexa700 (BD Biovitenskap). En LSR II flowcytometer (BD Biosciences) ble brukt til å kjøre alle prøvene og FlowJo 10.0.8r1 programvare (Tre Star, San Carlos, CA) ble brukt til å analysere alle data.
Intestinal permeabilitet
ved 19 timer etter CLP ble mus gavaged med 0,5 ml av fluorescein isotiocyanat-dekstran (FD4) ved en konsentrasjon på 22 mg /ml i PBS (Sigma-Aldrich) [21,22]. Plasma oppsamlet ved tidspunktet for avlivelse 5 time senere ble deretter fortynnet med et likt volum PBS, og FD4 Konsentrasjonen ble bestemt ved flourospectrometry med eksitasjon /emisjonsbølgelengder på 485/520 nm med en standardkurve av serielle fortynninger (BioTex Synergy HT, Winooski, VT).
tarm~~POS=TRUNC spredning
prolifererende intestinale epitelceller ble farget med 5-Bromo-2’deoxyuridine (BrdU). 90 minutter før avlivning, mus mottok intraperitoneale injeksjoner av BrdU (5 mg /ml i 0,9% saltvann, Sigma-Aldrich) å merke S-faseceller [23,24]. Jejunal Vevet ble deretter fiksert i 10% formalin i 24 timer før den ble innstøpt i parafin og glidemontert på 5 um seksjoner. Slides ble deretter deparaffinized, utvannet, og inkubert i 1% hydrogenperoksid i 15 minutter før de blir varmet opp i en trykkoker i antigen decloaker (Biocare Medical, Concord, CA) i 45 minutter. Protein blokk (Dako, Carpinteria, CA) ble utført i 30 minutter ved værelsestemperatur og snittene ble inkubert over natten ved 4 ° C med monoklonale rotte anti-BrdU (1: 500; og Accurate Chemical Scientific, Westbury, New Jersey). Prøvene ble deretter inkubert med geite-anti-rotte-antistoff (1: 500; Accurate Chemical Dako), hver i en time ved romtemperatur. Diaminobenzidin (DAB) ble anvendt for å utvikle lysbilder i 2-3 minutter, og kontra ble utført med hematoksylin. BrdU-positive celler ble kvantifisert i 100 sammenhengende, godt orientert tarm krypter
Tarm apoptose
apoptose av intestinale epitelceller ble kvantifisert ved hjelp av to komplementære teknikker. Aktiv caspase-3 farging og morfologiske analyser av Hematoxylin-eosin fargete snitt [25,26]. Snittene ble behandlet som ovenfor med antigen decloaker og ble deretter blokkert med 20% normalt geiteserum (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Platene ble inkubert over natten ved 4 ° C med kanin-anti-kaspase-3 (1: 100; Cell Signaling, Beverly, MA), og deretter med geite-anti-kanin-biotinylert antistoff (1: 500; Vector Laboratories) og streptavidin pepperrot peroksidase ( 1: 500; Dako) i en time hver ved romtemperatur. Lysbilder ble utviklet med DAB og deretter kontra. Caspase-3 positive celler ble talt opp i 100 sammenhengende tarm krypter.
apoptotiske celler ble identifisert på hematoksylin-eosin-farget seksjoner ved å identifisere karakteristiske morfologiske endringer inkludert cellen svinn med kondensert og fragmenterte kjerner og kvantifisere dem i 100 sammenhengende krypter .
villus lengde
villus lengde ble målt som avstanden i mikrometer fra krypten nakken til villus spissen i 12 sammenhengende godt orientert jejunal villi bruker Nikon Elements bildebehandling programvare- EIS-Elements BR 3.10 (Nikon Instruments, Melville, New York).
Bakteriekulturer kulturer~~POS=HEADCOMP
Kvantitative kulturer av fullblod og peritonealvæsken var forberedt fra serielle 10-gangers fortynning av prøver i steril 0,9% saltvann. En 100 ul aliquot av ufortynnet prøve og hver fortynning fra 10
-1-10
-3 ble platet ut på blodagarplater (Remel, Lenexa, KS) og inkubert ved 35 ° C i en 5% CO
2 atmosfære i 24 timer. Kimtall ble oppnådd fra plater inneholdende mindre enn 300 kolonier. Antallet kolonidannende enheter (CFU) per ml av opprinnelig prøve ble bestemt ved å multiplisere antallet av kolonier av den resiproke verdi av fortynningen tellet og justert til volumet av prøven belagt.
Cytokiner
Fullblod, peritoneal væske og bronkoalveolær lavage (BAL) væske ble oppsamlet og deretter sentrifugert ved 10.000 rpm i 10 minutter. Supernatanten fra hver ble deretter samlet og analysert for cytokin konsentrasjoner ved hjelp av en 6-Plex cytokin perle utvalg i henhold til produsentens instruksjoner (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
Nyrefunksjonen
Hele blodet ble sentrifugert ved 10.000 rpm i 10 minutter. Serumkreatinin ble deretter målt ved anvendelse av en mikroplate kreatinin assay (Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, MI), mens blod-urea-nitrogen (BUN) ble bestemt ved å bruke en urea-nitrogen kolorimetrisk deteksjon kit (Arbor Assays, Ann Arbor, MI). Hele nyrer ble fjernet og fiksert i 10% formalin i 24 timer før parafinfiksering og seksjonering. Etter hematoxylin-eosin farging, ble seksjonene vurderes for skade av en patolog blindet å prøve identitet (ABF). Animal vekter ble målt ved CLP og umiddelbart før å ofre for å vurdere potensielle vekttap på grunn av dehydrering.
Leverskade
Leverskade ble evaluert av både serum leverenzymer og histologi. Alaninaminotransferase (ALAT) ble målt på en Beckman AU480 kjemi auto-analysator (Beckman Diagnostics, LaBrea, CA) etter produsentens anvisninger. I tillegg ble deler av hele leveren fjernet og fiksert i 10% formalin i 24 timer før parafin innebygging. Seksjoner ble skyv montert og farget med hematoksylin-eosin for analyse av en patolog (ABF) blindet å prøve identitet.
Lung skade
For histologisk analyse, lungene av dyr ble spylt med 1 ml 10% formalin, og delene ble deretter fjernet og fiksert i 10% formalin i 24 timer før den ble innstøpt i parafin. Lunge delene ble deretter farget med hematoksylin-eosin og undersøkt av en patolog (ABF) blindet å prøve identitet.
Myeloperoxidase (MPO) aktivitet ble også vurdert i BAL væske. Luftrøret ble overrislet med 1 ml PBS, og væske ble deretter tatt ut og sentrifugert ved 10000 rpm i 10 minutter. Substrat buffer inneholdende 0,0005% hydrogenperoksyd og O-dianisidin ble tilsatt til supernatanten, og MPO-aktivitet ble analysert i løpet av 6 minutter ved bølgelengde 460 (BioTek Synergy HT, Winooski, VT). MPO-aktivitet ble beregnet som optisk tetthet /minutt per ul av BAL fluid.
Lung fluid proteinkonsentrasjon ble målt ved å analysere prøvene som er behandlet med proteinanalyse-reagens (Thermo Scientific, Rockford, IL) ved 660 nm i forbindelse med en standardkurve av bovint serumalbumin.
komplette blodtellinger
Helblod oppsamlet ved tidspunktet for avlivelse ble oppsamlet i antikoagulerende-lined blodprøverør, og ble analysert for hemoglobinkonsentrasjon, leukocyttall, og trombocytter på en Heska HemaTrue
® veterinær hematologimaskin per produsentens retningslinjer (Heska, Loveland, CO).
statistikker
Alle data ble analysert ved bruk av statistisk programvare programmet Prism 6.0 (GraphPad , San Diego, California) og er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Data ble testet for Gaussian distribusjon ved hjelp av D’Agostino-Pearson omnibus normalitet test. To veis sammenligninger på data med en gaussisk fordeling ble utført ved hjelp av t-test. Toveis sammenligninger på data som ikke har en gaussisk fordeling ble utført med Mann-Whitney test. Multi-gruppe sammenligninger ble analysert via enveis ANOVA, etterfulgt av Tukey post-test. Overlevelse ble analysert ved bruk av log-rank test. En p-verdi på 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant hele
Resultater
Mus som fikk subkutane injeksjoner av murine lungekreftceller utviklet godt avgrensede ensomme svulster på injeksjonsstedet tre. uker senere (midlere størrelse 1,5 cm i diameter). Post-mortem gjennomgang av lunge histologi viste mikroskopisk metastatisk sykdom hos noen dyr, selv om ingen brutto tumor spredning ble sett i noen dyr på tidspunktet for offer.
Tilstedeværelsen av eksisterende lungekreft forverres dødelighet etter sepsis
Seven-dagers dødelighet var 18% hos tidligere friske septik mus. I motsetning til syv-dagers dødelighet var 60% i kreft septisk mus (fig 1).
Tidligere friske mus og de som fikk en injeksjon av LLC1 celler tre uker tidligere (n = 15-17 /gruppe) ble utsatt til CLP. Kreft septisk mus hadde betydelig høyere dødelighet enn tidligere frisk septisk mus (p = 0,003).
Tilstedeværelsen av eksisterende lungekreft minsker CD4 + lymfocytter, men ikke CD8 + lymfocytter følgende sepsis
Cancer septisk mus hadde en reduksjon i både frekvens og absolutte tall av milt CD4 + lymfocytter sammenlignet med tidligere frisk septisk mus (figur 2A og 2B). I tillegg kreft septisk mus hadde en høyere frekvens av annexin-positiv farging CD4 + lymfocytter sammenlignet med tidligere friske septik mus, noe som tyder på økt apoptose var ansvarlig for tap av CD4 + celler (Fig 2C og 2D). I motsetning til dette, mens frekvensen av milt-CD8 + lymfocytter var høyere hos kreft septisk mus (figur 3A), dette var sannsynligvis på grunn av reduksjon i CD4 + celler, siden ingen forskjell ble observert i CD8 + celle tall (fig 3B) eller annexin-farging (fig 3C og 3D) mellom kreftseptik mus og tidligere friske septik mus. CD4 + celle-ekspresjon av Th1 markør CXCR3 ble øket i kreft septisk mus (figur 4A og 4C), mens ekspresjon av Th2 markør CCR4 var ikke forskjellig mellom tidligere friske septik mus og kreft septisk mus (figur 4B og 4C). Stimulert produksjon av Th1 effektor cytokin IFN-γ av CD4 + T-celler ble ikke påvirket av kreft (figur 4D, 4F og 4G), mens produksjonen av Th2 effektor IL-4 ble betydelig redusert i kreft septisk mus (Fig 4E, 4F og 4G) .
Cancer septisk mus hadde en signifikant lavere hyppighet av CD4 + T-celler som en prosentandel av totale CD3 + T-celler (A, p = 0,02, n = 7-9), så vel som en reduksjon i det totale antallet CD4 + T-celler (B, p = 0,03, n = 8-10) sammenlignet med tidligere friske septik mus. Dette var forbundet med en økning i annexin-positive CD4 + T-celler i kreft septisk mus (C, p = 0,04, n = 7-8). En representant flowcytometri histogram demonstrerer økt annexin flekker i septisk kreft (blå) CD4 + T-celler i forhold til tidligere frisk septisk (rød) CD4 + T-celler (D).
Kreft septisk mus hadde en betydelig økt frekvens av CD8 + T-celler som andel av totale CD3 + T-celler (A, p = 0,007, n = 8-10). Imidlertid var det ingen statistisk signifikant endring i total antall CD8 + celler (B, p = 0,10, n = 8-10) eller annexin-positive CD8 + T-celler (C, p = 0,31, n = 7-10), og antyder at endringen i prosentandel av CD8 + -celler var relatert til reduksjon i CD4 + -celler. En representant flowcytometri histogram viser ingen forskjell i annexin flekker i kreft septisk (blå) og tidligere frisk septisk (rød) CD8 + T-celler (D).
Kreft septisk mus hadde en beskjeden økning i CD4 + T celle ekspresjon av Th1 markør CXCR3 (A, p = 0,01, n = 9-10), men ikke har en signifikant endring i ekspresjon av Th2 markør CCR4 (B, p = 0,21, n = 9-10). En representant flowcytometri tomten for begge merkene er inkludert (C). Stimulert produksjon av IFN-γ var ikke statistisk forskjellig i CD4 + T-celler fra kreft septisk mus (D, p = 0,17, n = 9-10); imidlertid, stimulerte produksjonen av IL-4 var lavere i CD4 + T-celler fra kreft septisk mus (E, p = 0,006, n = 9-10). Representant flowcytometri tomter for både unstimulated og stimulert IFN-γ og IL-4 er vist for tidligere frisk septisk mus (F) og kreft septisk mus (G).
Tilstedeværelsen av eksisterende lunge kreft reduserer evnen til å fjerne lokal infeksjon
Peritoneal bakteriemengden ble høyere i kreft septisk mus enn tidligere frisk septisk mus (fig 5A). Dette var ikke assosiert med endringer i interleukin (IL) -1β, IL-6, IL-10, IL-13, MCP-1, TNF-α eller IFN-γ i peritonealvæske (figur 5B-5H). Peritonealvæsken også inneholdt tilsvarende prosenter av nøytrofile (figur 6a) og dendrittiske celler (fig 6B) mellom tidligere friske septik mus og septik kreft mus. Dendrittiske celleaktivering som bestemmes av MHC II-ekspresjon i celler fra peritoneal væske var også lik mellom gruppene (figur 6C). Milt dendrittisk celle frekvens og aktivering var også upåvirket av nærværet av kreft (figur 6D og 6E). Det var ingen forskjell i absolutte tall av neutrofiler eller dendritiske celler (data ikke vist).
Cancer septisk mus hadde høyere nivåer av bakterier i deres peritoneale hulrom enn tidligere frisk septisk mus (A, p = 0,005, n = 8-9). Denne endringen ble ikke forbundet med forskjeller i konsentrasjonen av peritoneal IL-1β (p = 0,32), IL-6 (p = 0,18), IL-10 (p = 0,52), IL-13 (p = 0,97), MCP-1 (p = 0,67), TNF-α (p = 0,40), eller IFN-γ (p = 0,27) (BH, n = 8 for alle grupper).
Cancer septik mus og tidligere frisk septisk mus hadde lignende frekvenser av neutrofiler (A, p = 0,52, n = 7 /gruppe) og dendrittiske celler (B, p = 0,52, n = 7 /gruppe) i sin peritoneal væske, og det var ingen forskjell i frekvens av dendrittiske cellen MHC II uttrykk mellom de to gruppene (C, p = 0,52, n = 7 /gruppe). Kreftseptik mus og tidligere friske septik mus også hatt lignende frekvenser av dendrittiske celler (D, p = 0,73, n = 9-10) og aktivert dendrittiske celler (E, p = 0,83, n = 9-10) i splenocytes.
serumcytokinene var lik mellom kreftseptik mus og tidligere friske septik mus med unntak av en økning i MCP-1 i kreft septisk mus (Fig 7). Ingen forskjell i bakteriemengden ble identifisert i kvantitative blodkulturer mellom tidligere friske septik mus og kreft septisk mus (data ikke vist).
Ingen signifikante forskjeller ble observert i IL-1β (p = 0,10), IL-6 (p = 0,63), IL-10 (p = 0,24), IL-13 (p = 0,07), eller TNF-α (p = 0,99) (BF, n = 7-8 /gruppe). I motsetning til dette økte MCP-1 ble detektert i serum fra kreft septisk mus sammenlignet med tidligere frisk septisk mus (E, p = 0,04, n = 7-8).
Tilstedeværelsen av pre- eksisterende lungekreft minsker krypten spredning, men endrer ikke andre komponenter i tarm integritet følgende sepsis
kreft i isolasjon reduserer krypten spredning i forhold til umanipulerte mus. Sepsis isolert reduserer også krypten spredning i forhold til umanipulerte mus. Kombinasjonen av kreft og sepsis fører til en ytterligere uforholdsmessig nedgang i krypten spredning i forhold til sepsis alene som kreftseptik mus har lavere spredning enn tidligere frisk septisk mus (Fig 8A-8C).
Tidligere sunn septisk mus (A) hadde kvalitativt høyere nivåer av spredning enn kreft septisk mus (B, BrdU-positive krypten celler flekken brun). Kvantitativt, både kreft i isolasjon og sepsis i isolasjon reduksjon krypt spredning (C, p = 0,02 og 0,008 henholdsvis i forhold til umanipulerte mus). Kombinasjonen av kreft og sepsis ytterligere redusert intestinal proliferasjon, mer så enn det som ble observert med enten variabel isolert (p 0,001 tidligere frisk septisk vs. septisk kreft, n = 8-10 for alle grupper i panel C). I motsetning til dette ble mens villus lengde ble redusert med sepsis (men ikke kreft) i isolasjon (p = 0,008), var det ingen forskjell i villus lengde mellom tidligere frisk septisk og kreft septisk mus (D, p 0,99, n = 8-9 for alle grupper).
i kontrast er villus lengde ikke berørt av kreft i isolasjon, er redusert som tidligere har blitt vist av sepsis (26), men er ikke forskjellig mellom tidligere friske septik mus og kreft septik mus (fig 8D). Kreft og sepsis heller ikke påvirke tarm permeabilitet eller krypten apoptose i forhold til sepsis alene (data ikke vist).
Tilstedeværelsen av eksisterende lungekreft forverres biokjemiske nyrefunksjonen uten å forårsake leverskade følgende sepsis
Verken kreft eller sepsis isolert påvirket nyrefunksjon som Mahmood og Cr nivåene var like i umanipulerte, kreft og tidligere friske septik mus. I motsetning til dette, både BUN og Cr var høyere i kreft septisk mus (figur 9A og 9B); men nyrer dukket grovt normalt histologisk (data ikke vist).
