Abstract
E-cadherin er kritisk for vedlikehold av vev arkitektur på grunn av sin rolle i celle-celle adhesjon. E-cadherin mutasjoner er den genetiske årsaken til arvelig Diffuse magekreft (HDGC) og missense mutasjoner representerer en klinisk byrde, på grunn av usikkerhet i deres patogene rolle. In vitro og in vivo, de fleste mutasjoner fører til tap-av-funksjon, selv om den utløsende årsak er ukjent for de fleste. Vi antok at destabilisering kunne redegjøre for patogenitet E-cadherin missense mutasjoner i HDGC, og testet vår hypotese hjelp i silico og in vitro verktøy. FoldX algoritme ble brukt for å beregne virkningen av hver enkelt mutasjon i E-cadherin nativ tilstand stabilitet, og analysen ble supplert med evolusjonær konservering, ved SIFT. Interessant, HDGC pasienter som hadde kimcellelinje E-cadherin destabiliserende mutanter presentere en yngre alder ved diagnose eller død, noe som tyder på at tapet av innfødte tilstand stabil E-cadherin står for sykdommen fenotype. For å belyse den biologiske betydningen av E-cadherin destabilisering i HDGC undersøkte vi en gruppe nylig identifiserte HDGC-mutasjoner (E185V, S232C og L583R), hvorav L583R er spådd å være destabiliserende. Vi viser at denne mutasjonen er ikke funksjonell in vitro, viser kortere halveringstid og er ute av stand til å modne, på grunn av tidlig proteasome avhengig nedbrytning, en fenotype falt av stabilisering med kunstig mutasjon L583I (strukturelt tolerert). Heri vi rapporterer E-cadherin strukturelle modeller egnet til å forutsi virkningen av de fleste kreftassosierte missense mutasjoner og vi viser at E-cadherin destabilisering fører til tap-av-funksjon in vitro og økt patogenitet in vivo.
Citation: Simões-Correia J, Figueiredo J, Lopes R, Stricher F, Oliveira C, Serrano L, et al. (2012) E-cadherin destabilisering Regnskap for patogenitet missense mutasjoner i arve Diffuse magekreft. PLoS ONE 7 (3): e33783. doi: 10,1371 /journal.pone.0033783
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 09.11.2011; Godkjent: 17 februar 2012; Publisert: 21 mars 2012
Copyright: © 2012 Simões-Correia et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Fundação para en Ciencia e Tecnologia, Portugal (PTDC /SAU-OBD /64319/2006, PTDC /SAU-OBD /104017/2008, SFRH /BPD /48765/2008), EMBO (kortsiktig fellesskap ASTF 60- 2009) og EU-støtten Prospects (HELSE-F4-2008-201648). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
E-cadherin er en celle-celle adhesjon glykoprotein som består av fem ekstracellulære cadherin-type gjentar, en transmembranregion og en sterkt konservert den cytoplasmiske hale [1], [2]. E-cadherin er uttrykt primært i epitelceller og er hovedkomponenten i Adherens Junctions (AJ). Disse knutepunktene klynge, via homofilist interaksjoner, gjennom de ekstracellulære domener av kalsiumavhengige E-cadherin molekyler på overflaten av homotypisk naboceller.
Rollen av E-cadherin i tumorutviklingen er godt beskrevet, og dens tap av uttrykk er et kjennetegn i karsinom [3]. Eksperimentelle bevis støtter en rolle for den E-cadherin kompleks både i å undertrykke invasjon og metastasedannelse [4]. Tap av E-cadherin uttrykk er ofte knyttet til genetiske hendelser som spleisesete og trunkering mutasjoner forårsaket av insersjoner, delesjoner, mutasjoner og nonsense, i tillegg til missense mutasjoner [5]. I sporadisk diffus magekreft, blir endringer i genet som koder for E-cadherin (CDH1) finnes fortrinnsvis i eksoner 7 til 9 [5], mens i lobular brystkreft de er spredt langs genet, med ingen preferensiell hotspot [6]. Missense mutasjoner er funnet i disse to typer sporadisk kreft og også i synovial sarkom [7].
Familiær aggregering av Diffuse magekreft (DGC) representerer 10% av tilfellene av magekreft (GC), og bare 1-3% er arvelig [8]. Fra disse familiære tilfeller er arvelig Diffuse magekreft (HDGC) definert av strenge kriterier som ble definert av den internasjonale Gastric Cancer Heis Consortium (IGCLC) i 1999: (1) to eller flere dokumenterte tilfeller av diffuse magekreft i første /andre grad slektninger, med minst en diagnostisert før fylte 50; eller (2) tre eller flere tilfeller av dokumentert diffuse magekreft i første /andre gradsslektninger, uavhengig av alder. Tidlig Onset Diffuse magekreft (EODGC) regnes når en isolert person er diagnostisert med DGC med mindre enn 45 år. Germline CDH1 mutasjoner er funnet i 30% av tilfellene HDGC [9]. Foreningen av CDH1 mutasjoner og familiær magekreft ble først beskrevet av Guilford
et al
i 1998 [10], og siden da har mange studier har rapportert ulike typer CDH1 mutasjoner i HDGC [11], [12], [13 ]. Blant alle rapporterte
CDH1
germline mutasjoner, 77,9% er tull, spleise-site og rammeskifte mutasjoner (anslått til å produsere for tidlig avslutning kodon) og 22,1% er missense mutasjoner [9]. Mutasjoner som genererer PTC er normalt skadelig, pasientene anses høy risiko bærere, og rådes til å ha profylaktisk total gastrektomi [14]. Patogenitet missense mutasjoner er ikke enkelt, og disse endringene blir ofte omtalt som Unclassified sekvensvarianter (USVs) på grunn av mangel på strenge kriterier for å evaluere effekten av dem. Flere parametere har blitt tatt hensyn til klassifisering av E-cadherin USVs i HDGC: 1) co-segregering av mutasjonen med DGC (innen stamtavler); 2) mutasjonsfrekvensen i frisk kontrollgruppe; 3) mutasjon tilbakefall (i uavhengige familier). Segregering analyse er ofte umulig, med et lite antall berørte tilfeller er tilgjengelige for molekylær diagnose [15], og fraværet av klinisk informasjon er en begrensende trinn for å utlede den patogene betydningen av disse mutasjoner. For å omgå denne begrensningen vi tidligere har utviklet
in vitro
funksjonelle analyser for å evaluere den funksjonelle effekten av E-cadherin kimcellelinje missense mutasjoner [16], [17]. Imidlertid har slike studier impliserer lab bestemte forsøksbetingelser, nemlig cellebiologiske analyser, og de er tidkrevende å bruke i rutinen.
I silikoaluminofosfater
spådommer er pålitelig og rask analyse som man kan bruke til å forutsi effekten av punktmutasjoner, spesielt når strukturell informasjon er tilgjengelig [18], [19].
I dette arbeidet, vi utforsket potensialet i strukturen baserte
i silikoaluminofosfater
spådommer for å evaluere effekten av E-cadherin missense mutasjoner, som finnes i arvelige og sporadisk kreft. Vår analyse er basert på beregning av innfødte statlige stabilitets endringer indusert av hver variant (ΔΔG = ΔG
WT-ΔG
Mut), innhentet av protein utformingen FoldX algoritme [20], [21]. Interessant, gruppen av pasienter som hadde destabiliserende mutasjoner (ΔΔG 0,8 kcal /mol) er preget av en yngre alder ved diagnose eller død ved DGC, noe som tyder på at tapet av E-cadherin innfødte tilstand stabilitet bidrar til sykdommen fenotype. Ved hjelp av en cellulær modell, analyserte vi fenotypen av E-cadherin destabilisering, og funnet ut at når en mutasjon induserer redusert nativ tilstand stabilitet, er E-cadherin tidlig forringes av proteasomet, oppviser kortere halveringstid, noe som resulterer i tap av klebe funksjon. Til sammen tyder våre resultater at destabilisering står for patogenitet E-cadherin missense mutasjoner funnet i HDGC.
Materialer og metoder
Innsamling av E-cadherin sekvensvarianter og PDBs
E-cadherin varianter assosiert til HDGC eller EODGC ble hentet fra litteraturen, og somatiske varianter ble hentet fra Katalog av somatiske mutasjoner i Cancer (COSMIC) database (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/kosmiske /). Tre nye E-cadherin sekvensvarianter hvor rapportert til vårt laboratorium for funksjonsanalyse: E185V, S232C og L583R. Nylig L583R ble rapportert, med funksjonelle data knyttet [22].
E-cadherin relaterte PDBs ble identifisert ved hjelp av automatisk søk med Swiss Model Repository (https://swissmodel.expasy.org). Sekvenssammenstilling av human E-cadherin, og hver av sekvensene som benyttes for de forskjellige modellene ble utført med M-kaffe [23], [24] (https://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/play?name=mcoffee ). Bilder ble forberedt med Pymol. Etter å ha analysert sekvens og strukturell homologi ble tre PDBs valgt å bruke som modeller. Xenopus C-cadherin ectodomain (PDB 1L3W), mus E-cadherin prodomene (PDB 1OP4) og mus β-catenin samspill domene (PDB 1I7X)
FoldX beregninger og sile analyse
Bruk (https://foldx.crg.es/) kommandoen FoldX
Buildmodel
vi bygget tre forskjellige modeller (prodomene, ekstracellulære og cytoplasmatiske); de tre strukturene ble humanisert ved substitusjon av hver annen aminosyre. Den resulterende strukturen ble optimalisert ved hjelp av kommandoen
RepairPDB Hotell og energiene der analysert med
Stabilitet
eller
AnalyseComplex
kommandoer. De sykdomsassosierte mutasjoner ble generert med
Buildmodel
kommando, hver mutasjon gjentatt i fem kjører. Energiene er en automatisk produksjon i FoldX, og den innfødte tilstand stabilitet endring, ΔΔG, mellom WT og mutant (ΔΔG = ΔG
WT-ΔG
Mut) er også generert i en egen fil, med tilsvarende standard avvik, og alle de energiske straffer knyttet til hver mutasjon. Kun mutasjoner med ΔΔG 0,8 kcal /mol ble ansett som skadelig
Vi brukte SIFT (https://sift.jcvi.org/, sortering Intolerant Fra Tolerant) for å vurdere bevaring av hver aminosyre substitusjon, som tidligere. beskrevet [25], med Blink funksjonen i GI. 31073. Kun mutasjoner med en score under 0,05 ble ansett for å være intolerant
pROP (https://www.cbs.dtu.dk/services /pROP /) [26] ble brukt til å vurdere om mutasjoner kan ha en effekt på prodomene cleavage.
Cellekultur kultur~~POS=HEADCOMP og trans
E-cadherin WT cDNA ble klonet i pIRES2-EGFP vektor i henhold å produsere instruksjoner (Clontech, Takara Bio) og mutasjoner E185V, S232C, L583R og L583I He-cadherin ble forårsaket av seterettet mutagenese som beskrevet tidligere [27]. Den tomme vektor (Mock) ble anvendt som kontroll
CHO (kinesisk hamsterovarie) celler (ATCC nummer: CCL-61). Ble dyrket i Alfa-MEM-medium (Gibco, Invitrogen) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Gibco, Invitrogen) og 1% penicillin-streptomycin (Gibco, Invitrogen). Celler ble sporadisk evaluert for mykoplasma forurensning av imunofluorescence med DAPI. -Celler ble transfektert med 1 jjg av hver av de vektorer som koder for de forskjellige former av E-cadherin (WT, E185V, S232C, L583R og L583I) ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen), i henhold til produksjon prosedyre. For stabil cellelinje etablering ble celler valgt ved antibiotisk resistens til 5 ug /ml blasticidin (Gibco, Invitrogen). Alle cellelinjer ble holdt i en fuktig inkubator med 5% CO
2 ved 37 ° C
funksjonelle analyser
transient transfektert CHO (kinesisk hamsterovarie) celler (ATCC nummer:. CCL -61) ble underkastet flyte citometry, ved hjelp av GFP fluorescens måling, for å evaluere transfeksjonseffektiviteten før hvert eksperiment. For den langsomme aggregering analysen ble brønnene i 96-brønns-plate belagt med 50 ul av agar-oppløsning (100 mg Bacto-Agar i 15 ml steril PBS). Cellene ble løsnet med trypsin og suspendert i kulturmedium. En suspensjon av 1 x 10
5 celler /ml ble fremstilt og 2 x 10
4 celler ble sådd i hver brønn. Platen ble inkubert ved 37 ° C i et fuktet kammer med 5% CO
2 i 48 timer. Aggregering ble evaluert i en invertert mikroskop (4 × forstørrelse) og fotografert med et digitalt kamera.
Western blotting
Cellelysater ble oppnådd med catenin lysebuffer (1% Triton X-100, en % Nonidet P-40 i PBS), supplert med protease inhibitor cocktail (Roche) og fosfatase-inhibitor cocktail (Sigma). Protein kvantifisering ble utført ved en modifisert Bradford assay (Bio-Rad). For hver prøve ble 25 mikrogram av protein lastet, separert i 7,5% SDS-PAGE og elektro til nitrocellulosemembran (GE Healthcare og biovitenskap). Membranene ble blokkert med 5% ikke-fet tørrmelk og 0,5% Tween-20 i PBS. Immunoblotting ble utført med antistoffer mot E-cadherin (1:1000; BD Biosciences), aktin (1:1000, Santa Cruz Biotechnology), og α-tubulin (1:10000, Sigma). Sheep anti-mus (GE Healthcare og biovitenskap) eller esel anti-geit (Santa Cruz Biotechnology) ble brukt som sekundære antistoffer, etterfulgt av ECL deteksjon (GE Healthcare og biovitenskap). Immunoblotter ble kvantifisert i Antall One-programvaren (Bio-Rad).
fluorescens-aktivert celle sortering (FACS)
Celler ble dyrket til en konfluent monolag, frittliggende med Versene (Gibco, Invitrogen) og resuspendert i iskald PBS med 0,05 mg /ml CaCl
2. En suspensjon av 5 x 10
5-celler ble sentrifugert i 5 minutter ved 1500 rpm 4 ° C, og vasket i PBS med 0,05 mg /ml CaCl
2 3% BSA. Celler ble inkubert i 60 minutter med et primært antistoff mot E-cadherin, HECD1 (Zymed Laboratories) ved 1:100 fortynning. Cellene ble vasket to ganger og deretter inkubert med anti-mus biotinilated (Dako) ved 1:100 fortynning. Cellene ble vasket to ganger og deretter inkubert med streptavidin-PE Cy5 (BD Pharmingen) ved 1:40 fortynning. Til slutt, ble cellene vasket, resuspendert i 500 ul PBS, og 50000-celler ble analysert i et strømningscytometer (Coulter Epics XL-MCL). Data ble analysert med WinMDI programvare.
Immunofluorescent flekker
For immunfluorescens og mikroskopi, ble cellene sådd på dekkglass og vokst til ca 80% samløpet, fast i iskald metanol i 15 minutter, vasket 2 ganger med PBS, og inkubert med primært antistoff, fortynnet i PBS 5% BSA, i 60 minutter ved romtemperatur. Primære antistoffer brukt: mus monoklonalt anti-E-cadherin (BD Biosciences); kanin anti-calnexin (Stressgen). Sekundære antistoffer brukes: Alexa Fluor 488 anti-mus (1:500, Invitrogen); Alexa Fluor 594 anti-kanin (1:500, Invitrogen). Glassene ble montert på glassplater, bruker Vectashield med DAPI for atom deteksjon (Vector Laboratories). Bilde Kjøpet ble utført på Carl Zeiss Apotome Axiovert 200 M fluorescens mikroskop bruker 40 × mål. Bilder ble kjøpt med Axiocam HRM kamera og behandles av programvare Axiovison versjon 4.8.
Cell Behandlinger
For proteinsynteseinhibisjon, celler ble behandlet med 25 mikrometer av Cycloheximide i 8 timer og 16 timer, og mengden av total E-cadherin ble analysert ved WB som beskrevet tidligere. For proteasomhemmingen analysen ble cellene sådd ut i 6-brønners plater, dyrket til omtrent 80% av konfluens, og inkubert i 16 timer med 10 uM MG132 (Calbiochem). Cellelysater ble analysert ved WB som beskrevet tidligere.
Resultater
1. E-cadherin strukturelle modeller
Det er få menneske E-cadherin (He-cad) strukturer tilgjengelig, og de dekker bare små deler av protein (tabell S1). Ved hjelp av automatisk søk av Swiss Model Repository, fant vi at PDB 1L3W, kommenterte for hele lengden ekstracellulære domene av Xenopus EP-cadherin (EP-cad), er svært homolog med det samme domenet i human E-cadherin. Vi analyserte sekvenshomologi ved justering ved hjelp av M-kaffe, en multippel sekvenssammenstilling som kombinerer produksjon av flere flere sekvens justerings pakker (PCMA, Poa, Mafft, Muskel, T-kaffe, ClustalW, ProbCons, DialignTX) [23], [24 ]. Figur 1A viser innrettingen av de to ekstracellulære domenesekvenser. De røde mursteins regioner representerer perfekt enighet blant metodene som brukes, som representerer svært lignende sekvenser. Å bygge modellstruktur, fjernet vi regioner uten likhet (figur 1A, stjerner), og begrenset modellen til regioner med pålitelig innretting (svart pil, figur 1A). Xenopus strukturen ble humanisert som beskrevet i Materialer og Metoder og 1B viser strukturelle justeringen av HE-cad EC1-EC2 domener (fra PDB 2O72) og EC1-EC2 domener av Xenopus avledet strukturelle modellen. De to strukturene er nesten overlagret, hvilket indikerer at likheten mellom de ekstracellulære domener av human E-cadherin og Xenopus EP-cadherin er ikke bare på sekvensen nivå, men også på det strukturelle nivå. Modellen struktur av menneskelig E-cad viser kompatible energier med strukturen fra Xenopus, med en liten nedgang på fri energi (ΔG) oppnådd for modellen (ΔG
real = 559,99 kcal /mol og ΔG
modell = 531,77 kcal /mol), noe som indikerer at humanisering ikke innfører ekstra sammenstøt. Nylig ble en struktur av den ekstracellulære mus domene sluppet (PDB 3Q2V, Tabell S1), og vi har også brukt denne strukturen som en modell, som en måte å avgrense resultatene oppnådd med den Xenopus modell.
A) sekvenssammenstillingen av de ekstracellulære domener av human E-cad og Xenopus EP-cad. Den ekstracellulære sekvenser ble oppnådd i Uniprot med de tilsvarende referanser (human E-cadherin, P12830, Xenopus EP-cadherin, P33148). M-Kaffe regelmessig ble anvendt for å utføre justeringen, en pakke som kombinerer forskjellige innrettingsmetoder. Red Brick regionene er i perfekt enighet på tvers av alle metodene, grønne og gule områdene er områder av enighet mellom de ulike justeringsmetoder. Den gjennomsnittlige poengsum konsistens oppnådd var 98, noe som bekrefter påliteligheten av innretting. De blå stjerner identifisere de aminosyrene som ble fjernet fra 1L3W strukturen før menneskelig. Den svarte pilen indikerer slutten av den strukturelle modellen oppnådd. B) Den menneskelige strukturen av domener EC1-EC2 (PDB 2O72, blå) ble på linje med de samme områder av den menneskelige modellen generert fra Xenopus struktur (PDB 1L3W, rød). Bilde laget med Pymol. C) Skjematisk fremstilling av menneske E-cadherin domener, fremhever dekning av de tre ulike strukturelle modeller oppnådd med FoldX (modeller av prodomene, ekstracellulære domene og catenin Binding Domain).
Vi etablerte to andre modeller, som dekker prodomene (PDB 1OP4, fra mus N-cadherin) og β-catenin cytoplasmaområde (PDB 1I7X, fra mus E-cadherin), ved hjelp av samme metode. Til sammen har de tre modellene dekker det meste av proteinstruktur (figur 1C): Den prodomene modellen dekker stillinger 28-117, de ekstracellulære modeller posisjonerer 155-697 og β-catenin cytoplasmaområde dekker 782-838. Ved nivået for den juxtamembrane domene, er en struktur kommentert, omfattende den interagerende overflate mellom E-cadherin og P120 [28]. Denne strukturen inneholder en liten, 18 aminosyrer lange peptid (som dekker posisjonene 756-773 på han-CAD), med meget lav strukturinnhold, faktorer som reduserer påliteligheten av energiberegninger, så vi forkastet denne strukturen fra analysen.
2.
I silico
prediksjon av virkningen av kreft-assosiert E-cadherin USVs
E-cadherin mutasjoner er ikke bare den genetiske årsaken til HDGC, men de er også ofte funnet i ulike typer sporadisk kreft. Vi analyserte
i silico
virkningen av alle kreftrelatert E-cadherin missense mutasjoner som lokaliserer til regionene som omfattes av strukturmodeller generert: 22 germline mutasjoner funnet i innstillingene til HDGC og EODGC, og 57 funnet i sporadiske kreft. Kimcellelinje E-cadherin USVs ble hentet fra litteraturen, og noen er personlig kommunikasjon i vår lab. Noen HDGC /EODGC mutasjoner er ikke mulig å modellere, på grunn av mangel på strukturell informasjon (for eksempel de som er lokalisert i den juxtamembrane domene av E-cadherin), og ble ikke inkludert i denne analysen. Somatiske mutasjoner ble samlet fra Kreft Genome Project database, og inneholder mutasjoner funnet i mage og lobular brystkreft (de eneste to typer kreft er knyttet til HDGC), men også andre typer kreft som synovial sarkom eller gallegang karsinom (Tabell S2 ).
Ved hjelp av de strukturelle modellene som er beskrevet tidligere, brukte vi FoldX å generere hver av kreft forbundet USVs, og evaluert mors-tilstand stabilitet, ΔG (ofte omtalt som total energi for enkelhet) [20]. Den energiske forskjellen mellom WT referanse og den tilsvarende mutant (ΔΔG = ΔG
WT-ΔG
Mut) ble beregnet for de 22 HDGC /EODGC E-cadherin USVs lokaliserte til regionene som omfattes av modellstrukturer, og resultatene er gjengitt i tabell 1. Når ΔΔG er negativt, gjenspeiler dette en gevinst på mors-state stabilitet i mutant skjema når det er positivt, innebærer det at mutanten er mindre stabil deretter WT referanse. Tidligere studier i andre proteiner har vist at stabilitetsendringer kalkulert med FoldX algoritme under 0,8 kcal /mol er innenfor feil endring av programvaren, og er dermed ansett for å være ikke-signifikant [21]. Følgelig vi bare betraktet mutasjoner for å være destabiliserende når de induserer energi endringer over 0,8 kcal /mol. I figur 2A, mutasjoner ovenfor ordningen er destabiliserende, mens de nedre de er strukturelt tolereres. Det er klart at destabiliserende mutasjoner er spead langs protein, uten fortrinnsrett domene påvirket.
A) Skjematisk fremstilling av E-cadherin domener, kartlegge alle de modellerte germline mutasjoner funnet i innstillingen av HDGC eller EODGC. Over ordningen er mutasjonene som resulterte i destabilisering, som spådd av FoldX (ΔΔG 0,8 kcal /mol) og under ordningen alle ikke-destabiliserende mutasjoner (ΔΔG 0,8 kcal /mol). De nylig identifiserte mutasjoner er understreket. B) FoldX og sile ble brukt for å evaluere effekten av mutasjonene som finnes i A) og spådommer ble klassifisert som: Sann Positiv (TP) når programvaren spår høy effekt og mutanter utstillings in vitro tap av funksjon; Sann Negativ (TN) når programvaren spår ingen innvirkning og mutant er funksjonell in vitro; False Positive (FP) når programvaren spår høy effekt, men mutantene er funksjonell in vitro; og falske negative (FN) når programvaren spår ingen innvirkning og mutanter utstillinger in vitro tap av funksjon. Resultatene fra begge prediktorene resultere i 70% overlapping med E-cadherin protein funksjon testes in vitro (TP + TN). C) Box-plott som representerer median og interkvartilt områder av innfødte statlige stabilitetsendringer (ΔΔG) av den destabiliserende og ikke-destabiliserende mutasjoner, som spådd av FoldX. D) Box-plott som representerer median og interkvartilt områder av alderen Gastric Cancer deteksjon eller assosiert død, tilsvarende den destabiliserende og ikke-destabiliserende mutasjoner bærere. Alle data ble oppsamlet fra litteraturen. Gruppen av pasienter som hadde destabiliserende mutasjoner er preget av en tydelig yngre alder av diagnose eller død, noe som tyder på bidraget fra E-cadherin destabilisering for sykdommen fenotype.
prodomene av HE-cad spaltes under modning, og hvis dette ikke er gjort, er E-cadherin lim funksjon svekket [29], [30]. For mutasjonene lokaliserte i dette domenet, vurderte vi effekten på total energi med FoldX, bevaring med SIFT, og også vurdert om interferens med prodomene kuttesete med prop (detaljer i Materialer og metoder). Vi fant at både arvelig (G62V og T118R) og sporadisk (P30T, G62D, H92Y, H121R og H123Y) mutasjoner lokalisert i E-cadherin prodomene er strukturelt tolerert, som spådd av FoldX (tabell S3). Når vi analyserer effekten basert på bevaring hjelp SIFT, fant vi også at ingen av mutasjonene ble ansett skadelig, fordi deres grad av bevaring er lav (tabell S3). Disse resultater indikerer at patogenitet E-cadherin USVs lokalisert i prodomene er sannsynligvis ikke avhengig av destabilisering. Vi har også funnet noen effekt på spaltning av propeptidet, som forutsagt ved PROP (data ikke vist). Derfor tror vi at patogenitet E-cadherin mutasjoner i dette domenet kan skyldes interferens med dokking av proteiner involvert i prodomene behandling, umulig å forutsi
i silico
.
Arvelig E -cadherin USVs spenner over den fulle lengde av det ekstracellulære domene, mens sporadiske mutasjoner er hovedsakelig funnet i EC2-EC3, som i henhold til den sone som tidligere er beskrevet i exoner 7-9 [5]. Fra de totale 18 germline HDGC /EODGC mutasjoner lokalisert i dette domenet, fant vi at 10 har en betydelig strukturell innvirkning på protein (tabell 1). Omtrent halvparten av de sporadiske mutasjoner er også destabilisere (tabell S3), uavhengig av EF-domenet der de er lokalisert, noe som tyder på at mors-state destabilisering kan knyttes til en betydelig del av sporadisk kreft involverer E-cadherin tap av punktmutasjon.
Bare tre mutasjoner er lokalisert i regionen kartlagt ved modellen av cytoplasma β-catenin bindende domene (P799R, V832M, S838G): de to første identifisert i HDGC /EODGC innstillingen og den andre en sporadisk, fant i eggstokk-karsinom [31]. For disse mutasjonene vi analyserte bindingsenergien mellom E-cadherin og β-catenin, og funnet at ingen av dem endrer signifikant bindingsaffinitet β-catenin, ifølge FoldX forutsigelse. Dette er i samsvar med
in vitro
resultater som viser at den arvelige mutasjonen V832M binder effektivt β-catenin, og dens patogenitet ser ut til å være avhengig av manglende evne til E-cadherin /β-catenin komplisert å binde α -catenin [32], [33].
Vi har samlet alle spådommer og funksjonell
in vitro
data fra HDGC /EODGC mutasjoner og analysert påliteligheten av prediktorer brukt (tabell 1). Vi klassifisert resultatene fra de spådommer som: Sann Positiv (TP) når mutasjonen er spådd som skadelig
i silico plakater (enten ved FoldX eller sile) og utstillings tap av funksjon
in vitro
; Sann Negativ (TN) når mutasjonen er spådd som tolereres
i silico Hotell og er funksjonell
in vitro
; False Positive (FP) når mutasjonen er spådd som skadelig
i silico
men er funksjonell
in vitro
; og falske negative (FN) når mutasjonen er spådd som tolereres
i silico
men utstillinger
in vitro
tap av funksjon. TP og TN er positive resultater, noe som betyr at prediktorer er i stand til å oppdage mutasjonen innvirkning på funksjon; FP og FN representerer deres grad av svikt. Vi fant at begge algoritmer er i stand til å forutsi den funksjonelle virkningen av opp til 70% av kimlinje HDGC /EODGC mutasjoner (11 av 16 mutasjoner), med forutsigelser overlappende til halvparten av mutasjoner (tabell 1, figur 2B).
Vi analyserte data tilgjengelig for kimcellelinje HDGC /EODGC mutasjoner bærere og, selv om informasjonen er begrenset, fant vi at den mest komplette sett med data er debutalder eller død knyttet til DGC. Når vi box-plot disse dataene, gruppering «destabiliserende» og «Non-destabilisere» mutasjonsbærere, ser vi en tydelig yngre alder av sykdomsutbruddet (diagnose eller død) for den første gruppen (figur 2D), noe som tyder på at mors-state destabilisering regnskapet for tidligere utbygging av DGC.
3. Biologiske betydningen av E-cadherin destabilisering
For å finne den biologiske betydningen av E-cadherin destabilisering, vi brukte som modell system tre nylig identifiserte E-cadherin germline missense mutasjoner rapporteres til vårt laboratorium for funksjonell karakterisering: E185V, S232C og L583R, den senere nylig beskrevet i litteraturen [22].
in silico
analyse beskrevet tidligere ble utført for disse tre nye mutasjoner, og resultatene er inkludert i tabell 1 (nedenfor mørk linje). Mutasjoner E185V og S232C er strukturelt tolerert, med ΔΔG = 0,29 kcal /mol og -0,9 kcal /mol (Tabell 1), regnes som ubetydelig om effekten i strukturen. Mutasjon S232C fremmer en reduksjon i energi, å stabilisere proteinet, og dette er på grunn av tap av den høye energien til en serin begravet OH-gruppe, som ikke er involvert i en H-binding, og til boligen av sidekjeden av cystein. Mutasjon L583R induserer destabilisering, med ΔΔG = 2,72 kcal /mol, noe som reflekterer den dramatiske endringen fra en hydrofob til hydrofil aminosyre, som resulterer i en Arginine ikke i stand til å danne H-bindinger, blir ufordelaktig begravet.
I
n vitro
funksjonelle analyser ble utført for de ovennevnte HDGC /EODGC mutasjoner, og vi fant en perfekt korrelasjon mellom funksjonaliteten
in vitro Hotell og tilstedeværelse /fravær av strukturell påvirkning: E185V og S232C beholde limet funksjon av E-cadherin, og er i stand til å danne tette cellulære aggregater, mens L583R viser en klar spredt mønster, ligner Mock celler (figur 3a), noe som indikerer at E185V og S232C er ikke-patogene og L583R er sykdomsfremkallende.
CHO-celler som var forbigående (A) eller stabilt (B-C) transfektert med tom vektor (Mock) eller WT, E185V, S232C, L583R E-cadherin cDNA. A) Funksjonell aggregering analysen ble utført som beskrevet i Materiale og metode. L583R celler viser E-cadherin tap av funksjon, noe som resulterer i et spredt mønster, som lignet Mock celler. ΔΔG ble beregnet ved hjelp FoldX algoritme og er 0 for WT referanse; B) Totale cellelysater ble fremstilt og E-cadherin ble påvist ved Western blot ved anvendelse av anti-E-cadherin antistoff. Anti-α-Tubulin-antistoff ble anvendt som en kontroll lasting. Ekspresjonen av L583R reduseres og forskjøvet til høyere molekylvekt, noe som indikerer for å bli beholdt som umoden (ca. 130 kDa). C) E-cadherin ekspresjon i plasmamembranen (PM) ble evaluert ved hjelp av flowcytometri, etter farging med en ekstracellulær anti-human E-cadherin antistoff. L583R er mindre uttrykt i PM.
Når vi analyserte E-cadherin uttrykk i de ulike cellelinjer, fant vi at den totale mengden av mutant L583R er lavere enn WT uttrykket under samme forhold, mens mutasjoner E185V og S232C, beholde normale nivåer (Figur 3B). Interessant er det bånd som tilsvarer L583R holdes i gelen, noe som indikerer at L583R er ikke i stand til på riktig måte å modne (umoden form av E-cadherin er 130 kDa, er moden 120 kDa) og flowcytometri resultatene viser at det er mindre uttrykt i plasma membran (Figur 3C).
Når protein modning svikter, dette ofte resulterer i endoplasmatisk retikulum (ER) oppbevaring av umoden protein.
