Abstract
mTOR veien er abnormt stimuleres i mange kreftceller, inkludert bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDAC), og dermed er det et potensielt mål for terapi. Men mTORC1 /S6K akse formidler også negative tilbakemeldinger looper som svekke signal via insulin /IGF-reseptoren og andre tyrosin kinase reseptorer. Undertrykkelse av disse feed-back løkker slipper løs over-aktivering av oppstrøms trasé som potensielt motvekt antiproliferative virkningene av mTOR-hemmere. Her viser vi at behandling av PANC-1 eller MiaPaCa-2 kreft i bukspyttkjertelen celler med enten rapamycin eller aktiv-språk mTOR-hemmere trykkes S6K og S6 fosforylering indusert av insulin og GPCR agonist neurotensin. Rapamycin forårsaket en slående økning i Akt fosforylering på Ser
473, mens de aktive-site hemmere av mTOR (KU63794 og PP242) helt avskaffet Akt fosforylering på dette området. Omvendt, aktiv-site hemmere av mTOR føre til en markant økning i ERK-aktivering mens rapamycin ikke hadde noen stimulerende effekt på ERK-aktivering. Resultatene antyder at første og andre generasjon av mTOR inhibitorer fremme overaktivering av forskjellige pro-onkogene baner i PDAC celler, hvilket antyder at undertrykkelse av feed-back løkker bør være en betydelig faktor ved bruk av disse inhibitorer for PDAC terapi. I kontrast, metformin avskaffet mTORC1 aktivering uten over-stimulerende Akt fosforylering på Ser
473 og hindret mitogen-stimulert ERK-aktivering i PDAC celler. Metformin forårsaket en mer uttalt inhibering av proliferasjon enn enten KU63794 eller rapamycin, mens, det aktive stedet mTOR-inhibitor var mer effektiv enn rapamycin. Dermed blir effekten av metformin på Akt og ERK-aktivering er påfallende forskjellig fra allosteriske eller aktiv-språk mTOR-hemmere i PDAC celler, selv om alle disse agentene potent hemmet mTORC1 /S6K akse
Citation. Soares HP, Ni Y, Kisfalvi K, Sinnett-Smith J, Rozengurt E (2013) ulike mønstre av Akt og ERK Tilbakemelding Activation for å håndtere Rapamycin, Active-Site mTOR hemmere og Metformin i kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 8 (2): e57289. doi: 10,1371 /journal.pone.0057289
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
mottatt: 28 august 2012; Godkjent: 20 januar 2013; Publisert: 21 februar 2013
Copyright: © 2013 Soares et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health Grants P30DK41301, P01CA163200 og R01DK55003, Department of Veterans Affair Grant 1I01BX001473 og midler fra utrustet Ronald S. Hirshberg Chair av kreft i bukspyttkjertelen Forskning alt til eR. (https://www.nih.gov/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mammalian target of rapamycin (mTOR) er en svært evolusjonært konservert protein kinase som spiller en nøkkelrolle i integreringen av vekstfaktor, næringsstoff og energi status av cellene [1]. mTOR fungerer som en katalytisk subenhet i to forskjellige multiprotein komplekser, mTOR kompleks 1 (mTORC1) og mTORC2. mTORC1, preget av den regulatoriske subenhet Raptor, kontrollerer minst to regulatorer av proteinsyntesen, de 40S ribosomalt protein subenhet S6 kinase (S6K) og eukaryote oversettelse initiering faktor 4E (eIF4E) -binding protein 1, omtalt som 4E-BP1 [1 ], [2]. Den heterodimer av tumor suppressor TSC2 (tuberin) og TSC1 (hamartin) undertrykker mTORC1 signalering ved å opptre som GTPase-aktivator protein for den lille G protein rheb (Ras homolog anriket i hjernen), en potent aktivator av mTORC1 signalering i sin GTP- bundet tilstand [3], [4]. Fosforylering av TSC2 av Akt og /eller ERK /p90RSK undertrykker dets GTPase aktiverende aktivitet overfor rheb, som fører til aktivering mTORC1 [5]. mTORC1 er akutt og allosterisk hemmet av rapamycin gjennom binding til FKBP12. mTORC2, karakterisert ved Rictor, hemmes ikke av kortvarig behandling med dette middel og fosforylerer flere AGC proteinkinaser, inkludert Akt ved Ser
473 [6], [7]. Den mTORC1 pathway spiller en nøkkelrolle i insulin /IGF-reseptor signalisering [8], [9] og er abnormt aktivert i mange kreftformer, deriblant bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC), en av de mest dødelige menneskelige sykdommer. Følgelig PDAC celler uttrykker insulin og IGF-1-reseptorer og over-express IRS-1 og IRS-2 [10] – [12] og PDAC (men ikke normal) vev visning aktivert (fosforylert) IGF-1R [13]. Gene variasjoner i IGF-1-signaleringssystemet har blitt forbundet til dårligere overlevelsen hos pasienter med PDAC [14]. Inaktivering av p53, som under utviklingen av 50-70% av PDAC, opp-regulerer insulin /IGF-1 /mTORC1 sti [15]. Krysstale mellom insulin /IGF-1-reseptorer og G-protein-koblet reseptor (GPCR) signalanlegg potente stimulere mTORC1, DNA-syntese og celle-proliferasjon i et panel av PDAC celler [16] – [20]. mTORC1 signalering spiller en sentral rolle i spredning og overlevelse av PDAC celler [21] og er aktivert i kreft i bukspyttkjertelen vev [20], [22] – [24]. Derfor har mTORC1 dukket opp som en attraktiv terapeutisk mål i PDAC og andre vanlige kreftformer.
I tillegg til vekstfremmende signal, mTORC1 /S6K formidler også negative tilbakemeldinger looper som beherske signaliserer gjennom insulin /IGF-reseptoren og andre tyrosin kinase-reseptorer via fosforylering og transkripsjonelle undertrykkelse av IRS-1 [25] – [30] og fosforylering av Grb10 [31], [32]. Følgelig undertrykkelse av mTORC1 aktivitet av rapamycin hindrer inhibitoriske IRS-1 phosphorylations og nedbrytning, for derved å forsterke PI3K /akt-aktivering i flere kreftcelletyper [30], [33] – [35]. Disse undersøkelser antyder at den potensielle anti-kreft-aktivitet av rapamycin (eller analoger) kan motvekts ved frigjøring av feedback hemming av PI3K /Akt aktivering [25], [30], [33] – [35]. Videre er rapamycin ufullstendig hemmer 4E-BP-1 fosforylering [36] – [40]. Følgelig har den kliniske antitumoraktivitet av rapamycin og dets analoger (rapalogs) blitt ganske begrenset i mange typer kreft [41], [42], inkludert PDAC [43], [44]. I et forsøk på å målrette mTOR vei mer effektivt, har nye hemmere av mTOR som fungerer på den katalytiske aktive området (aktiv-site mTOR-hemmere) er identifisert, inkludert PP242 [37], Torin [45], KU63794 [38] og dens analog AZD8055 [46]. Disse forbindelsene hemmer 4E-BP-1 fosforylering ved rapamycin-resistente områder (f.eks Thr
37/46) og blokkere Akt fosforylering på Ser
473 gjennom hemming av mTORC2. Men aktiv-site mTOR-hemmere også eliminere feedbacksløyfer som beherske PI3K aktivering [25] og følgelig kan deres terapeutiske effekten også bli redusert ved aktivering av oppstrøms veier som er i mot deres anti-proliferative effekter.
mTORC1 er også negativt regulert av metformin, den mest brukte medikament i behandlingen av type 2 diabetes mellitus (diabetes mellitus type 2). Metformin fremstår som en potensiell ny agent i kreft chemoprevention. Nyere epidemiologiske studier knyttet administrering av metformin til redusert forekomst, gjentakelse og dødelighet av en rekke kreftformer i diabetes mellitus type 2 pasienter [20], [47] – [56], inkludert PDAC [54], [56]. På cellenivå, metformin indirekte stimulerer AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) aktivering [57], selv om andre virkningsmekanismer, er blitt foreslått ved meget høye konsentrasjoner av dette biguanid. AMPK hemmer mTORC1 aktivisering gjennom stimulering av TSC2 funksjon [58] – [60], som fører til opphopning av rheb-BNP (den inaktiv form) og ved direkte fosforylering av Raptor, som forstyrrer sin tilknytning til mTOR, som fører til dissosiasjon av mTORC1 komplekse [61]. Den nøyaktige konsekvens av undertrykkelse av negative tilbakekoblingssløyfer som medieres av de mTORC1 /S6K akse som reaksjon på metformin forblir dårlig definert og, i særdeleshet, er det ikke kjent hvorvidt rapamycin, aktiv-site mTOR inhibitorer og metformin føre til over-aktivering av tilsvarende oppstrøms trasé i PDAC celler.
Her viser vi at behandling av PANC-1 eller MiaPaCa-2 kreft i bukspyttkjertelen celler med enten rapamycin eller aktiv-språk mTOR-hemmere trykkes S6K og S6 fosforylering indusert av insulin, en kombinasjon av insulin og GPCR agonist neurotensin eller serum. Rapamycin forårsaket en slående styrking av Akt fosforylering på Ser
473, mens de aktive-site mTOR-hemmere KU63794 og PP242 helt avskaffet Akt fosforylering på dette området. Et fremtredende trekk ved de resultater som er presentert her er at aktiv-språk inhibitorer av mTOR, i motsetning til rapamycin, føre til en markert økning i ERK-aktivering i PDAC celler. Resultatene antyder at første og andre generasjons mTOR-hemmere fremme over-aktivering av forskjellige pro-onkogene trasé i PDAC celler, nemlig Akt og ERK. Metformin også avskaffet mTORC1 aktivering men uten over-stimulerende Akt fosforylering på Ser
473. Videre metformin forhindret ERK-aktivering som respons på tverr snakker agonister i PDAC celler. Våre resultater viser at effekten av metformin på Akt og ERK-aktivering er påfallende forskjellig fra de utløses ved allosteriske eller aktiv-site mTOR-hemmere, selv om alle disse agentene potent hemmet mTORC1 /S6K aksen.
Materialer og metoder
Cell kultur
den menneskelige bukspyttkjertelkreft cellelinjer Panc-1 og MiaPaCa-2 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Disse cellelinjene havnen aktiverende mutasjoner i
KRAS
onkogen. Celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) med 2 mM glutamin, 1 mM Na-pyruvat, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære som inneholder 10% CO
2.
Western blot analyse
løpende kulturer av Panc-en eller MIA Paca-2 celler dyrket på 3 cm retter ble vasket og deretter inkubert i 24 timer med DMEM inneholdende 5 mM glukose og 1% FBS. Cellene ble vasket to ganger med DMEM inneholdende 5 mM glukose og inkubert i serumfritt medium i 4 timer og deretter behandlet som beskrevet i de enkelte forsøk. Kulturene ble deretter direkte lysert i 2 x SDS-PAGE-prøvebuffer [200 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2 mM EDTA, 0,1 M Na
3VO
4, 6% SDS, 10% glycerol, og 4% 2-mercaptoethanol], etterfulgt av SDS-PAGE på 10% geler og overføring til Immobilon-P membraner (Millipore, Bille, MA). Western blot ble så utført på membraner inkubert over natten med de angitte antistoffer i fosfat-bufret saltvann (PBS) inneholdende 0,1% Tween-20. De immunreaktive bånd ble påvist med ECL (forbedret chemiluminescence) reagenser (GE Healthcare Bio-Sciences Corp, Piscataway, NJ). Antistoffene som brukes oppdaget fosforylert tilstand av S6K på Thr
389, S6 hos Ser
235/236, 4E-BP1 på Thr
37/46 og Thr
70, Akt på Ser
473 og Thr
308 og ERK1 /2 på Thr
202 og Tyr
204 eller den totale nivåer av disse proteinene.
Anchorage-avhengig celleproliferasjon.
PANC -1-celler (10
5) ble sådd ut på 35 mm vevskulturskåler i DMEM inneholdende 10% FBS. Etter 24 timers inkubering ved 37 ° C, ble grupper av kulturene inkubert med neurotensin og insulin med eller uten metformin i DMEM inneholdende 0,25% FBS eller Rapamycin, KU63794 eller Metformin i DMEM inneholdende 2,5% FBS. Kulturene ble deretter inkubert i 4 d, og det totale celletall ble bestemt fra et minimum på seks brønner pr tilstand ved hjelp av en Coulter-teller etter at celleklumper ble disaggregert ved føring av cellesuspensjonen 10 ganger gjennom en 19-gauge, og deretter, en 21-gauge nål.
Material
DMEM ble hentet fra Invitrogen (Carlsbad, California). Neurotensin og insulin ble oppnådd fra Sigma Chemical (St. Louis, MO). Rapamycin, KU63794 og PP242 var fra R & D Systems, Inc. Minneapolis. Alle antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin-IgG og anti-mus IgG var fra GE Healthcare Bio-Sciences Corp (Piscataway, NJ). Alle andre reagenser var av høyeste kvalitet tilgjengelig.
Resultater
Stimulering av p70S6K og S6 fosforylering som respons på insulin og neurotensin i PDAC cellene er fullstendig avskaffet ved rapamycin eller KU63794
i utgangspunktet fastsettes vi påvirkning av rapamycin og KU63794 på mTORC1-mediert fosforylering av S6K i PDAC celler. Rapamycin er et allosterisk hemmer av mTORC1 som fungerer via FKBP-12, mens KU63794 er en svært spesifikk ATP-kompetitiv hemmer av mTOR som hemmer både mTORC1 og mTORC2. Kulturer av PANC-1 (fig. 1) eller MiaPaCa-2 (fig. 2) celler ble inkubert i 2 timer i fravær eller nærvær av rapamycin (ved 10 eller 100 nM) eller KU63794 (ved 1 eller 5 uM). Deretter ble kulturene stimulert med en kombinasjon av insulin (10 ng /ml), og GPCR agonist neurotensin (5 nM) i 2 timer for å fremkalle positivt crosstalk [18], [20]. Fosforylering av S6K på Thr
389, et direkte mål for mTORC1, og fosforylering av S6 (Ser
235/236), et substrat av S6K, ble overvåket ved hjelp av spesifikke antistoffer som gjenkjenner den fosforylert tilstand av de rester. Stimulering av enten PANC-1 eller MiaPaCa-2-celler med insulin og neurotensin indusert robust fosforylering av S6K på Thr
389 og S6 (fig. 1 og 2). Eksponering for enten rapamycin eller KU63794 fullstendig forhindret økning i fosforylering av disse proteiner som respons på stimulering av insulin og neurotensin i enten PANC-1 (fig. 1) eller MiaPaCa-2-celler (Fig. 2). Vi har bekreftet at de totale nivåer av S6K og S6 ikke endres i respons til behandlinger. Resultatene indikerer at allosteriske eller aktiv-språk inhibitorer av mTOR potent sperret mTORC1 /S6K akse i de konsentrasjoner som anvendes i PDAC celler
Kulturer av PANC-1-celler ble inkubert i fravær. (-) Eller i tilstedeværelsen av KU63794 (Ku) ved 1 uM eller 5 uM eller rapamycin (RAP) ved 10 eller 100 nM i 2 timer i DMEM inneholdende 5 mM glukose, som angitt. Deretter ble cellene stimulert i 2 timer med 5 nM neurotensin (NT) og 10 ng /ml insulin (moduler) og lysert med 2 x SDS-PAGE prøvebuffer. Prøvene ble analysert ved SDS-PAGE og immunoblotting med antistoffer som gjenkjenner den fosforylert tilstand av S6K på Thr
389, S6 hos Ser
235/236, 4E-BP1 på Thr
37/46 og Thr
70, Akt på Ser
473 og Thr
308 og ERK på Thr
202 og Tyr
204. Immunoblotting med antistoffer som gjenkjenner total S6K ble S6, 4E-BP1, Akt og ERK brukes til å bekrefte at celle behandlinger ikke endre det samlede nivået av disse proteinene og bekrefte lik gel lasting. Fold økning i ERK-fosforylering ble kvantifisert ved hjelp av Multi Gauge V3.0 og plottet som barer. Lignende resultater ble erholdt i 3 uavhengige eksperimenter
Kulturer av MiaPaCa-2-celler ble inkubert i fravær. (-) Eller i nærvær av KU63794 (Ku) ved 1 uM eller 5 uM eller rapamycin ( Rap) ved 10 eller 100 nM i 2 timer i DMEM inneholdende 5 mM glukose, som angitt. Deretter ble cellene stimulert i 2 timer med 5 nM neurotensin (NT) og 10 ng /ml insulin (moduler) og lysert med 2 x SDS-PAGE prøvebuffer. Prøvene ble analysert ved SDS-PAGE og immunoblotting med antistoffer som gjenkjenner den fosforylert tilstand av S6K på Thr
389 (pS6K), S6 hos Ser
235/236 (PS6), 4E-BP1 på Thr
37/46 og Thr
70, Akt på Ser
473 og ERK på Thr
202 og Tyr
204. Immunoblotting med antistoffer som gjenkjenner total S6K ble S6, 4E-BP1, Akt og ERK brukes til å bekrefte at celle behandlinger ikke endre det samlede nivået av disse proteinene og bekrefte lik gel lasting. Fold økning i ERK-fosforylering ble kvantifisert ved hjelp av Multi Gauge V3.0 og plottet som barer. Lignende resultater ble oppnådd i 3 uavhengige eksperimenter.
Differensial regulering av 4EBP1 fosforyleringsseter i respons til mitogen stimulering, rapamycin og KU63794 i PDAC celler
fosforylering av 4EBP1 ble også overvåket av bruker stedsspesifikke 4E-BP1 antistoffer som gjenkjenner p-Thr
37/46 eller p-Thr
70 i lysayes av PANC-1 (fig. 1) eller MiaPaCa-2 (fig. 2) celler. Disse cellene viste en høy basal nivå av 4E-BP1 fosforylering på Thr
37/46 som ikke ble ytterligere økt med stimulering med insulin og neurotensin. Men celle stimulering redusert mobilitet av 4E-BP1 i SDS /PAGE, et svar som tyder på økt fosforylering på andre områder. Faktisk behandling av PANC-1 eller MiaPaCa-2 celler med neurotensin og insulin markert stimuleres 4E-BP1phosphorylation på Thr
70. Den constituve fosforylering av 4E-BP1 på Thr
37/46 ble avskaffet ved behandling med KU63794 men ble ikke påvirket av rapamycin på enten 10 eller 100 nM, i samråd med rapporter som rapamycin og dets analoger ikke hemmer 4E-BP1 fosforylering på disse stedene i andre celletyper. I motsetning til dette ble det signal som reagerer fosforyleringen av 4E-BP1 på Thr
70 hindres ved behandling med enten KU63794 eller rapamycin ved 100 nM. Vi har bekreftet at de totale nivåer av 4E-BP1 ikke ble endret som reaksjon på treatments.These resultatene viste et lite verdsatt regulering av 4E-BP1 fosforylering på forskjellige rester som reaksjon på eksterne signaler og viser at rapamycin hemmer induserbar men ikke konstitutivt 4E-BP1 fosforylering i PDAC celler mens aktive-språk mTOR-hemmere undertrykke fosforylering av 4E-BP1 på alle områder.
Rapamycin og KU63794 indusere overstimulering av ulike oppstrøms baner i PDAC celler stimulert med insulin og neurotensin eller insulin alene
for å bestemme hvorvidt allosteriske og aktiv-språk mTOR inhibitorer eliminere tilbakekoplingssløyfer at begrense aktiviteten av oppstrøms signalveier i PDAC celler, undersøkte vi effekten av disse inhibitorene på fosforylering av Akt i respons til mitogen signalisering i PANC -1 og Mia Paca-2 celler. Stimulering av disse cellene med insulin og neurotensin induserte en markert økning i fosforylering Akt på Ser,
473 (fig. 1 og fig. 2). Behandling med enten 10 nM eller 100 nM rapamycin fremmet overstimulering av Akt fosforylering på Ser
473, i samsvar med undertrykkelse av mTORC1 /S6K aksen feedback looper. I motsetning til tidligere eksponering for det aktive stedet mTOR-inhibitor KU63794, som hemmer både mTORC1 og mTORC2, blokkerte Akt fosforylering på Ser,
473 i PANC-1 (fig. 1) og MiaPaCa-2-celler (Fig. 2), i tråd med forestillingen om at mTORC2 er den viktigste protein kinase som fosforylerer Akt på Ser
473 i PDAC celler. KU63794 hindret ikke Akt fosforylering på Thr
308.
ERK /RSK sti, som spiller en sentral rolle i PDAC celledeling fører også til mTORC1 aktivering [5], [62]. I bryst og blære kreftceller, hemming av mTORC1 /S6K akse av rapamycin indusert tilbakemeldinger aktivering av ERK [63]. Følgelig, undersøkte vi effekten av rapamycin og KU63794 på ERK-aktivering i PDAC celler. I samsvar med tidligere studier [16], [64], [65], stimulering av enten PANC-1 eller MiaPaCa-2 celler med insulin og neurotensin markert aktivert ERK (ERK fosforylert på Thr
202 og Tyr
204 ), som vist på fig. 1 og 2. I motsetning til de resultater som ble oppnådd i andre celletyper [63], behandling med enten 10 eller 100 nM rapamycin i 2 timer, forandret ikke den basale eller den stimulerte nivået av ERK-fosforylering i PANC-1 og MiaPaCa-2-cellene . Lignende resultater ble oppnådd når disse PDAC celler ble behandlet med rapamycin i 4 eller 24 timer (resultater ikke vist). I motsetning til dette eksponering for KU63794 (1-5 uM) øket det basale nivået av ERK-fosforylering og påfallende forbedret stimulering av ERK-fosforylering indusert av insulin og neurotensin i enten PANC-1 eller MiaPaCa-2-celler. Kvantifisering av resultatene med ERK er illustrert i de nedre paneler av fig. 1 og 2 (barer). Disse resultater viser at rapamycin, en allosterisk inhibitor av mTORC1, og KU63794, en aktiv stedet hemmer av mTOR, føre til over-aktivering av forskjellige oppstrøms pro-onkogene baner i PDAC cellene.
Stimulering av PANC-1 celler eller MiaPaCa-2 med insulin alene induserte sterk økning av PI3K /Akt /mTORC1, men induserer ikke signifikant økning i ERK fosforylert på Thr
202 og Tyr
204 (fig. 3). Følgelig har vi fastslått hvorvidt den differensielle effekter av rapamycin og KU63794 avbildet i PDAC stimulert med en kombinasjon av insulin og neurotensin (fig. 1 og 2) kan også fremstilles ved PANC-1 og MiaPaCa-2-celler blir utfordret med insulin alene. Kulturer av disse celler ble inkubert i 2 timer i fravær eller nærvær av rapamycin (10-100 nM) eller KU63794 (1-5 um) og deretter stimulert med insulin (10 ng /ml). Vi overvåkes fosforylering av S6K på Thr
389, S6 på Ser
235/236, Akt på Ser
473 og Thr
308 og ERK på Thr
202 og Tyr
204. Før eksponering for enten rapamycin eller KU63794 opphevet økning i fosforylering av S6K og S6 i respons på insulin i enten PANC-1 eller MiaPaCa-2-celler (Fig. 3). Eksponering for rapamycin over-aktivert mens behandling med KU63794 avskaffet Akt fosforylering på Ser
473 i insulin-stimulert PDAC celler. Rapamycin produserte ikke noen påviselig effekt på ERK-aktivering i ikke-stimulerte eller insulin-behandlede celler. Et særtrekk ved de resultatene som er vist i fig. 3 er at eksponering for KU63794 induserte en markert økning i fosforylering av ERK på Thr
202 og Tyr
204. Disse resultatene bekreftes at allosterisk hemmer av mTORC1 og det aktive stedet stedet hemmer av mTOR fremme over-aktivering av ulike oppstrøms baner i PDAC cellene utfordret med insulin eller insulin og neurotensin, en kombinasjon som utløser crosstalk mellom insulin /IGF og GPCR signalanlegg .
kulturer av PANC-1 (øvre panel) og MiaPaCa-2 (nedre panel) ble inkubert i fravær (-) eller i nærvær av KU63794 (Ku) ved 1 uM eller 5 uM eller rapamycin (Rap) ved 10 eller 100 nM i 2 timer i DMEM inneholdende 5 mM glukose, som angitt. Deretter ble cellene stimulert i 2 timer med 10 ng /ml insulin og lysert med 2 x SDS-PAGE prøvebuffer. Prøvene ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE og immunblotting med antistoffer som gjenkjenner de fosforylerte tilstand av S6K ved Thr
389, S6 ved Ser
235/236, Akt ved Ser
473 og Thr
308 og ERK på Thr
202 og Tyr
204. Immunoblotting med total S6K ble S6, Akt og ERK brukes til å bekrefte lik gel lasting. Fold økning i ERK-fosforylering ble kvantifisert ved hjelp av Multi Gauge V3.0 og plottet som barer. Lignende resultater ble oppnådd i 3 uavhengige eksperimenter.
PP242, som KU63794, øker ERK-aktivering i PANC-1 celler stimulert med insulin og neurotensin
Deretter vi avgjort om den slående løpet -activation av ERK av det aktive stedet mTOR-hemmer KU63794 kan også produseres av et strukturelt urelaterte aktiv stedet mTOR-hemmer. Kulturer av PANC-1 ble inkubert i 2 timer i fravær eller nærvær av PP242 (1-5 uM), en nylig identifisert aktiv stedet mTOR-inhibitor [37], og stimulert i 2 timer med insulin og neurotensin. Vi overvåkes fosforylering av S6K på Thr
389, S6 på Ser
235/236, 4EBP1 på Thr
37/46, Akt på Ser
473 og ERK på Thr
202 og Tyr
204. Som vist på fig. 4 A, før eksponering for PP242 avskaffet fosforylering av S6K, S6, 4EBP1 og Akt i PANC-1-celler. Den viktigste funksjonen av resultatene er at PP242, som KU63794, induserte en markert økning i fosforylering av ERK på Thr
202 og Tyr
204 (fig. 4A og kvantifisering i fig. 4B). Fordi PP242 er en mindre selektiv mTOR-hemmer [66], bestemt vi om konsentrasjonene av PP242 som fremmet ERK-aktivering sammenfallende med de som hemmer mTORC1 aktivitet. Som vist på fig. 4C, PP242 forbedret ERK-aktivering og hemmet S6 fosforylering ved nesten identiske konsentrasjoner
A
, Kulturer av PANC-1-celler ble inkubert i fravær. (-) Eller i nærvær av PP242 hos 1 pM eller 5 uM i 2 timer i DMEM inneholdende 5 mM glukose, som angitt. Deretter ble cellene stimulert i 2 timer med 5 nM neurotensin (NT) og 10 ng /ml insulin (moduler) og lysert med 2 x SDS-PAGE prøvebuffer. Prøvene ble analysert ved SDS-PAGE og immunoblotting med antistoffer som gjenkjenner den fosforylert tilstand av S6K på Thr
389, S6 hos Ser
235/236, 4E-BP1 på Thr
37/46, Akt på Ser
473 og ERK på Thr
202 og Tyr
204. Immunoblotting med antistoffer som gjenkjenner total S6K ble S6, 4E-BP1, Akt og ERK brukes til å bekrefte at celle behandlinger ikke endre det samlede nivået av disse proteinene og bekrefte lik gel lasting. Lignende resultater ble erholdt i 3 uavhengige eksperimenter.
B
, Søylene representerer økningen i ERK-fosforylering indusert av insulin (Ins) og neurotensin (NT) i celler uten eller med tidligere eksponering for PP242. Kvantifisering ble utført ved bruk av flersporet V3.0
C,
Kulturer av PANC-1-celler ble inkubert som i panel A, men i nærvær av økende konsentrasjoner av PP242. Prøvene ble analysert for å påvise fosforylerte tilstanden S6 ved Ser
235/236 og ERK ved Thr
202 og Tyr
204. Immunoblotting med total ERK og S6 (ikke vist) ble benyttet for å bekrefte lik gel lasting. Kvantifisering ble utført ved hjelp av Multi Gauge V3.0.
D
, Kulturer av PANC-1-celler ble inkubert i fravær (-) eller i nærvær av enten KU63794 (Ku) eller PP242 ved 5 uM i 2 timer. Deretter ble cellene stimulert i 2 timer med 5 nM neurotensin (NT) og 10 ng /ml insulin (moduler) og lysert med 2 x SDS-PAGE prøvebuffer. Prøvene ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE og immunblotting med antistoffer som gjenkjenner de fosforylerte tilstand av ERK ved Thr
202 og Tyr
204, Akt ved Ser
473 og Thr
308. Immunoblotting med total Akt og ERK ble brukt til å bekrefte lik gel lasting.
Vi har fått bekreftet at aktiv-site mTOR-hemmere KU63794 og PP242, i konsentrasjoner som markant forbedret ERK-aktivering og hemmet Akt fosforylering på Ser
473 ikke hindre Akt fosforylering på Thr
308 i PDAC celler (fig. 4D). Faktisk, den spesifikke mTOR-hemmer KU63794 litt forbedret Akt fosforylering på Thr
308, i samsvar med undertrykkelse av feedbacksløyfer som beherske PI3K aktivitet (fig. 4D). PP242 var mindre effektiv enn KU63794 i styrke Akt fosforylering på Thr
308, mest sannsynlig gjenspeiler off-target hemming av PI3K [66]. Dermed bestemte aktiv stedets språk mTOR-hemmere KU63794 og PP242 trykt Akt fosforylering på Ser
473, gikk ikke ned Akt fosforylering på Thr
308 og stimulert over-aktivering av ERK-fosforylering på Thr
202 og Tyr
204 i PDAC celler.
Den mekanismen som aktivt språk hemmere forbedre ERK-aktivering er ikke godt forstått. Våre resultater støtter ikke det foreligger i PDAC celler av en antatt mTORC1 /S6K /PI3K /ERK tilbakekoblingssløyfe, er foreslått i andre celletyper [63], ettersom potent inhibering av mTORC1 /S6K akse ved enten rapamycin eller everolimus ikke produserer overstimulering av ERK i PDAC celler. For å underbygge denne konklusjonen, ble PANC-1-celler behandlet med KU63794 eller PP242 og stimulert med insulin og neurotensin i fravær eller nærvær av A66 [67], en selektiv inhibitor av den katalytiske subenhet av 110α PI3K. Som vist på fig. 4D, eksponering til A66 ikke hindre forsterkning av ERK-aktivering som respons på eksponering for enten KU63794 eller PP242. Vi har bekreftet at A66, ved den konsentrasjon som benyttes, er en potent hemmende PI3K innenfor PANC-1-celler, siden det hindret insulin-indusert Akt fosforylering ved Thr
308, nøkkelrester i den Akt aktiverings sløyfen fosforylert av PI3K-avhengig PDK1.
for å oppnå en ytterligere innsikt i mekanismen som behandling med KU63794 induserer over-aktivering av ERK vi bestemmes også effekten av den aktive stedet mTOR-inhibitor på aktivering av MEK, oppstrøms kinase som fosforylerer ERK. MEK aktivering ble scoret ved å vurdere fosforylering av Ser
217 og Ser
221 i sin aktivering loop. Som vist på fig. S1, behandling av PANC-1 eller MiaPaCa-2-celler med KU63794 markert forbedret MEK fosforylering indusert av insulin og neurotensin. Kollektivt, resultatene viser at aktiv-språk mTOR-hemmere førte til MEK /ERK hyper-aktivering via et PI3K /S6K uavhengig feedback loop i PDAC celler.
Differensial mønstre av Akt og ERK-aktivering i respons til rapamycin, everolimus, KU63794 og PP242 i PANC-1 celler stimulert med serum
De foregående resultatene ble oppnådd med PDAC celler stimulert med definerte mitogener som virker gjennom spesifikke reseptorer. For å utvide ytterligere disse funnene vi også testet hvorvidt differanse mønstre av Akt og ERK-aktivering blir produsert når cellene blir stimulert med føtalt bovint serum. Kulturer av PANC-1-celler ble inkubert i 2 timer i fravær eller nærvær av rapamycin (100 nM), everolimus (100 nM), KU63794 (1 uM) eller PP242 (1 uM) og stimulert med medium inneholdende føtalt bovint serum. Vi overvåkes fosforylering av S6 på Ser
235/236, Akt på Ser
473 og ERK på Thr
202 og Tyr
204. Før eksponering for rapamycin, everolimus, KU63794 eller PP242 opphevet økning i fosforylering av S6 i respons til serum (fig. 5). Eksponering for rapamycin eller everolimus over-aktivert mens behandling med KU63794 eller PP242 avskaffet Akt fosforylering på Ser
473 i serumstimulert PDAC celler. Rapamycin eller everolimus ikke gi noen påvisbar effekt på ERK-aktivering, mens eksponering for KU63794 eller PP242 induserte en markert økning i fosforylering av ERK på Thr
202 og Tyr
204 i serum-behandlede celler (Fig. 5). Disse resultatene bekreftet at allosterisk og aktiv-område Område inhibitorer av mTOR fremme overaktivering av forskjellige oppstrøms baner i PDAC celler under forskjellige eksperimentelle betingelser, inkludert celler utfordret med insulin, insulin og GPCR agonist neurotensin eller med frisk føtalt bovint serum.
kulturene ble inkubert i fravær (-) eller i nærvær av 5 pM KU63794 (Ku), 5 uM PP242, 100 nM rapamycin (RAP) eller 100 nM everolimus i 2 timer i DMEM inneholdende 5 mM glukose, som angitt. Deretter ble cellene stimulert i 2 timer med føtalt bovint ved en endelig fortynning på 2% (serum) og lysert med 2 x SDS-PAGE prøvebuffer. Prøvene ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE og immunblotting med antistoffer som gjenkjenner de fosforylerte tilstand av Akt ved Ser
473, S6 ved Ser
235/236, og ERK ved Thr
202 og Tyr
204 . Som vist på fig. Som vist i fig.
