Abstract
Rollen til neo-angiogenese i prostatakreft (PCA) vekst og metastasering er godt etablert, men utviklingen av effektive og ikke-giftige farmakologiske hemmere av angiogenese fortsatt en unaccomplished mål. I denne forbindelse kan målretting aberrant angiogenese gjennom ikke-toksiske fytokjemikalier være en attraktiv angiopreventive strategi mot PCA. Begrunnelsen for denne studien var å sammenligne antiangiogene potensialet i fire rene diastereoisomere flavonolignans, nemlig Silybin A, silybin B, isosilybin A og isosilybin B, som vi etablert tidligere som biologisk aktive bestanddeler i Milk Thistle ekstrakt. Resultatene viste at oral tilførsel av disse flavonolignans (50 og 100 mg /kg kroppsvekt) effektivt hemmer veksten av avanserte humane PCA DU145 xenografter. Immunhistokjemiske analyser viste at disse flavonolignans hemme tumor angiogenese biomarkører (CD31 og nestin) og signaliseringsmolekyler som regulerer angiogenese (VEGF, VEGFR1, VEGFR2, fosfo-Akt og HIF-1α) uten negativ innvirkning på fartøyet-telleverdien i normale vev (lever, lunge, og nyre) i tumorbærende mus. Disse flavonolignans inhiberte også microvessel spirende fra mus rygg Aorta
ex vivo
, og VEGF-indusert celleproliferasjon, kapillar-rør som dannes og invasivitet av human navlestrengvene endotelialceller (HUVEC)
in vitro
. Videre studier i HUVEC viste at disse diastereoisomerene målrette cellesyklus, apoptose og VEGF-indusert signalkaskade. Tredimensjonal vekstanalyse samt co-kultur invasjon og
in vitro
angiogenese studier (med HUVEC og DU145 cellene) foreslo differensial effektiviteten av diastereoisomerene mot PCA og endotelceller. Samlet disse studiene belyst den komparative antiangiogene effekt av rene flavonolignans fra Milk Thistle og foreslå sin nytte i PCA angioprevention
Citation. Deep G, Gangar SC, Rajamanickam S, Raina K, Gu M, Agarwal C , et al. (2012) Angiopreventive Effekt av Pure Flavonolignans fra Milk Thistle Extract mot prostatakreft: Targeting VEGF-VEGFR signale. PLoS ONE 7 (4): e34630. doi: 10,1371 /journal.pone.0034630
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 23 desember 2011; Akseptert: 2 mars 2012; Publisert: 13 april 2012
Copyright: © 2012 Deep et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NCI R01 tilskudd CA102514 og CA104286. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den hyppigst diagnostisert non-kutan malignitet blant menn i USA, og er den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall [1]. Klinisk og eksperimentelle bevis har antydet at humane tumorer kan vedvare i årene som mikroskopiske skader i en tilstand av dvalen og deres videre vekst er kritisk avhengig av å oppnå en «angiogen fenotype [2], [3], [4], [5] . «Angiogene brytere» som involverer høy VEGF og VEGF reseptor (VEGFR) nivåer har blitt identifisert og anses som ansvarlig for PCA progresjon fra lav karakter PIN (prostata intraepitelial neoplasi) scenen til høy klasse PIN og videre til mer aggressiv, dårlig differensiert, og androgen- uavhengige ondartede stadier [6]. Videre har angiogenese nivå i PCA vært korrelert direkte med Gleason score, tumor stadium, progresjon, metastaser og overlevelse [6], [7], [8]. Derfor har rettet mot angiogenese har vært gjenstand for flere kliniske undersøkelser for å forbedre livskvaliteten til kreftpasienter [9], [10], [11]. Videre hindrer inntreden av angiogenese i tumorer lat (betegnet som «angioprevention «) har blitt foreslått som en ny og begrunnelsen tilnærming til kontroll PCA vekst, ondartet progresjon og metastasering til sekundærsider.
DU145 xenotransplantater ble igangsatt og mus ble administrert enten bærer (CMC) eller 50 og 100 mg /kg kroppsvekt dose av hver diastereoisomer. (A) Tumorvolumet ble målt og plottet som en funksjon av tid (dager). Hver verdi i kurvene er middelverdi ± SEM av 10-12 mus. (B-D) xenograft vev ble analysert for PCNA, TUNEL og spaltet caspase-3 (CC3) av IHC. Dataene som vises i søylediagrammene er gjennomsnitt ± SEM av 4-5 prøver. Forkortelser: Sil A: Silybin A; Sil B: Silybin B; Iso A: Isosilybin A, Iso B: Isosilybin B; * P ≤ 0,001; #, P ≤ 0,01; $, P ≤ 0,05.
DU145 xenograft vev ble analysert for CD31, nestin, VEGF og VEGFR2 av IHC. Kvantitative analyser ble utført ved hjelp av Zeiss Axioscope 2 mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland) og bildene ble opprinnelig tatt (ved 400x) med en Carl Zeiss AxioCam MRC5 kamera med Axiovision Rel 4.5 software. Dataene som vises i søylediagrammene er gjennomsnitt ± SEM av 4-5 prøver. Forkortelser: Sil A: Silybin A; Sil B: Silybin B; Iso A: Isosilybin A, Iso B: Isosilybin B; * P ≤ 0,001.
DU145 xenograft vev ble analysert for VEGFR1, HIF-1α, fosforylert Akt
ser473 og total Akt nivåer ved IHC. Kvantitative analyser ble utført ved hjelp av Zeiss Axioscope 2 mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland) og bildene ble opprinnelig tatt (ved 400x) med en Carl Zeiss AxioCam MRC5 kamera med Axiovision Rel 4.5 software. Dataene som vises i søylediagrammene er gjennomsnitt ± SEM av 4-5 prøver. Forkortelser: Sil A: Silybin A; Sil B: Silybin B; Iso A: Isosilybin A, Iso B: Isosilybin B; * P ≤ 0,001.
Om fire tiår siden, Judah Folkman først spådde den potensielle rolle for anti-angiogene hemmere mot solide kreftformer, og til dags dato, har flere angiogenesehemmere blitt testet mot mange kreftformer [ ,,,0],12], [13], [14], [15]. Mange av disse inhibitorer har allerede blitt godkjent av FDA for deres anvendelse, enten alene eller i kombinasjon med cancer kjemoterapeutiske medikamenter [13], [15], [16]. For eksempel ble humanisert VEGF-antistoff godkjent mot kolorektal-, hjerne, lunge og nyre-kreft [16]. Tilsvarende tyrosinkinasehemmere sorafenib og sunitinib, som målrette VEGFR aktivitet, har blitt godkjent for bruk mot avansert nyrecellekreft [16]. Selv om inhibering av angiogenese i kreft, i prinsippet, er et godt forebyggende /terapeutisk strategi, den nåværende metode for å målrette en enkelt molekyl, slik som VEGF eller VEGFR er feil, som kreftcellene utvikle resistens gjennom omgå disse molekylene og fortsette å spre vaskulære nettverk [17 ]. Foruten deres begrenset effekt i form av bedring i pasientens overlevelse, disse behandlingsalternativene er ekstremt dyre og har vist uakseptable nivåer av toksisitet [18], [19]. Derfor rasjonalisert vi behovet for å identifisere ikke-giftig naturlige agenter med bredspektret anti-angiogen effekt; og i denne forbindelse, i denne studien, har vi fokusert på antiangiogene effekt av fire rene diastereoisomerene fra Milk Thistle (
Silybum
) ekstrakt, nemlig silybin A, silybin B, isosilybin A og isosilybin B. disse diastereoisomerene er flavonolignans med en identisk flavonoid-del og skiller seg bare i sine konfigurasjoner om lignan del, og deres kjemiske og biologiske egenskaper har blitt beskrevet tidligere [20], [21], [22], [23], [24]. Her, for første gang vi analyserte angiopreventive effekten av disse flavonolignans i PCA xenograft modell og diverse
ex vivo
,
in vivo Hotell og
in vitro
angiogenese analyser.
(A-B) lunger, lever og nyrer fra hver mus ble samlet og analysert for CD31 immunreaktiviteten så vel som for histopatologiske analyser. Kvantitative analyser ble utført ved hjelp av Zeiss Axioscope 2 mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland) og bildene ble opprinnelig tatt (ved 400x) med en Carl Zeiss AxioCam MRC5 kamera med Axiovision Rel 4.5 software. Forkortelser: Sil A: Silybin A; Sil B: Silybin B; Iso A: Isosilybin A, Iso B: Isosilybin B.
(A) Flavonolignans hemme angiogenese
ex vivo
. Muse Aorta ble sådd ut på matrigel og behandlet med flavonolignans. Pilene på bildet markerer de nye fartøyene fra Aorta. (B) Flavonolignans hemmer VEGF-indusert tube formasjonen i HUVEC. HUVEC ble sådd ut på matrigel og virkning av diastereoisomerer behandling på VEGF-indusert rør-dannelse ble analysert. Representative rørformet nettverk photomicrographs vises på 100x (topplaten). Rørlengde ble kvantifisert som beskrevet i «metoder» (nederst panel). Forkortelser: Sil A: Silybin A; Sil B: Silybin B; Iso A: Isosilybin A, Iso B: Isosilybin B; * P ≤ 0,001.
(A) HUVEC ble indusert med VEGF og behandlet med hver flavonolignan i 0,5% serum media, og total celle nummer ble analysert etter 24 timer. (B) HUVEC ble sådd ut i det øvre kammer med DMSO eller individuell diastereoisomer, mens VEGF ble tilsatt i det nedre kammer og HUVEC invasjon ble studert. Forkortelser: Sil A: Silybin A; Sil B: Silybin B; Iso A: Isosilybin A, Iso B: Isosilybin B; * P ≤ 0,001; #, P ≤ 0,01; $, P ≤ 0,05.
(A-B) HUVEC ble behandlet med DMSO eller individuell flavonolignan og analysert for total celle nummer og cellesyklus distribusjon. (C) HUVEC ble behandlet med flavonolignans, og 24 timer senere, totale cellelysater ble fremstilt og analysert for cellesyklus regulatorer. De densitometry verdiene som presenteres nedenfor bandene er «ganger endring» i forhold til kontroll etter lasting kontroll (α-tubulin) normalisering. (D) HUVEC ble behandlet med flavonolignans (ved 30 mikrometer dose) i 36 timer og analysert for morfologi (representative photomicrographs vises på 100x), nivåer av cPARP, kløyvde caspase 3 og 9, og prosent apoptotiske celler. Forkortelser: Sil A: Silybin A; Sil B: Silybin B; Iso A: Isosilybin A, Iso B: Isosilybin B; * P ≤ 0,001; #, P ≤ 0,01; $, P ≤ 0,05.
HUVEC ble serum sultet i 22 timer, behandlet med diastereoisomerer i 2 timer og stimulert med VEGF (10 ng /ml) i 10 minutter. Totale cellelysater ble fremstilt og analysert for nevnte signaliseringsmolekyler. De densitometry verdiene som presenteres nedenfor bandene er «fold change» i forhold til kontroll etter lasting kontroll (β-aktin) normalisering.
(A) Effekt av flavonolignans (90 mikrometer dose) på den tredimensjonale vekst av DU145 celler ble undersøkt som beskrevet i «Materialer og metoder». Representative sfæroider photomicrographs vises på 100x og 400x. (B) In Transwell invasjon assay, enten DU145-celler (sådd ut i det nedre kammer) eller HUVEC (sådd ut i det øvre kammer) ble behandlet med individuelle diastereoisomerer (ved 30 uM dose), og HUVEC invasivitet ble målt. (C) DU145-celler ble behandlet med individuelle diastereoisomerer (ved 30 uM dose) og kondisjonert medium ble oppsamlet. HUVEC ble sådd ut på matrigel sammen med 0,5% FBS eller kondisjonert medium fra forskjellige behandlingsgrupper; og rør formasjonen ble analysert. Representative mikrofotografier av rørformet nettverk er vist på 100x. Forkortelser: Sil A: Silybin A; Sil B: Silybin B; Iso A: Isosilybin A, Iso B: Isosilybin B; CM: Betinget media; * P ≤ 0,001; #, P ≤ 0,01.
Silybin A, silybin B, isosilybin A og isosilybin B målet angiogenese i prostatakreft gjennom målretting signalmolekyler i PCA celler samt i endotelceller, den viktigste komponenten i PCA mikromiljøet.
Metoder
Cell line og reagenser
Menneskelig PCA DU145 cellene var fra ATCC (Manassas, Virginia) og dyrket som beskrevet tidligere [25]. HUVEC var fra Lonza (Walkers, MD) og ble dyrket i EBM2 media med EGM-2 SingleQots kosttilskudd. Matrigel og invasjon kammeret var fra BD Biosciences (New Bedford, MA). TUNEL assay kit var fra Promega (Madison, WI). Karboksymetylcellulose (CMC), Harris hematoksylin og β-aktin-antistoff var fra Sigma (St. Louis, MO). DAB kit var fra Vector Laboratories (Burlingame, California). Streptavidin og PCNA antistoff var fra Dako (Carpinteria, CA). Antistoffer for CD31, VEGF og nestin var fra Abcam (Cambridge, MA). Antistoffer til VEGFR1, VEGFR2, og HIF-1α [brukes for immunhistokjemi (IHC) analyse], så vel som antistoffer for Cdk2, Cdk4, Cdc2, cyklin D1, cyklin D3, cyklin B1, p21, p27, Skp 2, Cdc25A og Cdc25C og normal geit serum var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). p27 antistoff var fra Neomarkers (Fremont, California) og p21 antistoff var fra Upstate (Charlottesville, VA). Antistoffer som gjenkjenner de fosforylerte og /eller totale proteinnivåer VEGFR1, VEGFR2, Src, ERK1 /2, Akt, Bad, mTOR, p70S6K, kløyvde caspase 3, kløyvde caspase 9, og geit anti-kanin HRP-konjugert sekundære antistoffer var fra Cell signalering (Beverly, MA). ECL deteksjonssystem og anti-mus HRP-konjugert sekundært antistoff var fra GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). VEGF var fra R D (Minneapolis, MN). Silybin A, silybin B, isosilybin A og isosilybin B ble isolert (renhet 97%) fra pulverisert ekstrakt av fruktene av
Silybum product: (L.) Gaertn. [Hentet fra Euromed, S.A. (Barcelona, Spania)]. De hybrid kromatografiske /precipitative teknikker og prosedyrer for gram skala rensing av disse flavonolignans er allerede rapportert tidligere [26].
In Vivo
Tumor Xenotransplantat Study
atymiske (
nu /nu
) mannlige naken mus var fra NCI (Frederick, MD). Behandlingsprotokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Colorado Denver. Omtrent 3 x 10
6 DU145-celler ble suspendert i 50 ul serumfritt medium, blandet med 50 ul av Matrigel, og injisert s.c. i den høyre flanken til hver mus. Dagen etter xenograft implantering ble musene tilfeldig delt inn i ni grupper, og alle behandlinger ble utført ved oral tvangsforing som: gruppe I-mus (bærerkontroll gruppe) med 200 mL av 0,5% CMC (w /v) i sterilt vann; Gruppe II og III mus med 50 og 100 mg /kg kroppsvekt dose av silybin A; Gruppene IV og V mus med 50 og 100 mg /kg kroppsvekt dose av silybin B; Grupper VI og VII mus med 50 og 100 mg /kg kroppsvekt dose av isosilybin A; og grupper VIII og IX mus med 50 og 100 mg /kg kroppsvekt dose av isosilybin B, henholdsvis. Alle disse behandlingene (5 dager /uke) fikk i 200 mL av 0,5% CMC. Siden alle fire forbindelser som har samme molekylvekt (482,1), hvert dosenivå var ekvimolar på tvers av disse midler. Når tumor xenograft vekst startet, ble svulststørrelser målt to ganger ukentlig ved bruk av digital caliper og tumorvolum ble beregnet ved formelen: 0,5236 L
1 (L
2)
2, hvor L
1 er lang diameter, og L
2 er kort diameter.
IHC Analyser
tumorprøver ble behandlet og immuno-farget følgende publiserte metoder [27], [28], [29]. Prosentandelen av PCNA, TUNEL, ble spaltet caspase 3 og HIF-1α positive celler beregnes ved å telle antallet positive fargede celler (brun farget), og det totale antall celler i fem vilkårlig valgte felt fra hver tumor ved 400x forstørrelse. Microvessels farget med CD31 og nestin ble kvantifisert i 5 tilfeldige mikroskopiske (400x forstørrelse) felt per svulst. VEGF, VEGFR1, VEGFR2, Pakt
ser473, og Akt immunoreaktivitets ble analysert i 5 tilfeldige områder for hver svulstvev og ble scoret som 0+ (ingen flekker), 1+ (svak flekker), 2+ (moderat farging), 3+ (sterk farging), 4+ (veldig sterk farging).
Ex Vivo
Capillary Formation analysen
Aorta isolert fra mus ble renset, skåret i små fragmenter og plassert på Matrigel dekket brønner og dekket med en annen 100 mL matrigel. Etter disse Aorta ble dyrket i 24 timer, ble mediet (komplett HUVEC media) erstattes med eller uten flavonolignans (30 og 60 uM). Behandlinger ble erstattet etter 48 timer. Etter 6 dager med total inkubasjon ble fartøyene spire fra Aorta fotografert ved hjelp av Cannon Power Shot A640 kamera på Zeiss invertert mikroskop.
Tube Dannelse analysen
HUVEC (4 × 10
4) ble dyrket i 1 ml EBM2 (supplert med 0,5% FBS og 4 ng /ml VEGF) med forskjellige diastereoisomerer (5-30 um) på Matrigel belagte plater. Etter ni timers inkubering ble rørformet struktur formasjon kvantifisert ved beregning av slangelengde (ved 100x) med Zeiss invertert mikroskop ved hjelp Cannon Power Shot A640 kamera og AxioVision Rel.4.7 programvare. I et beslektet forsøk ble DU145-celler behandlet med 30 pM av hver dose flavonolignan i 72 timer, og friskt medium (0,5% FBS) ble tilsatt, og oppsamlet etter 12 timer (merket som «kondisjonert medium»). De kondisjonerte media blandet med 0,5% FBS supplert EBM2 media (75:25 forhold) ble deretter tilsatt til HUVEC og rør-dannelse ble undersøkt som beskrevet ovenfor.
celleviabilitet Assay
HUVEC ble behandlet med eller uten VEGF (10 ng /ml) og forskjellige konsentrasjoner av flavonolignans (5-30 uM). Etter at den ønskede behandling, ble totalt celleantall bestemt ved anvendelse av et hemocytometer.
Transwell Invasion Assay
I denne analysen ble de nedre kamre av Transwell fylt med EBM2 media inneholdende 0,5% FBS supplert med 4 ng /ml VEGF, og i de øverste kammere HUVEC (4 x 10
4) ble sådd ut i 500 ul EBM2 (0,5% FBS) pluss 30 uM dose av hver flavonolignan. Etter 10 timer ble cellene invasive kvantifisert som beskrevet tidligere [30], [31]. Lignende analyse ble også utført med DU145-celler sådd ut i den nederste kammer (RPMI-medium med 0,5% serum) og HUVEC (EBM2 media med 0,5% serum) i det øvre kammer. I to separate forsøk, ble flavonolignans tilsettes enten i forkamrene eller i nedre kamre og invasivitet av HUVEC ble studert i hvert enkelt tilfelle.
Cellesyklus Distribusjon og apoptose
Cellesyklus distribusjon (saponin /PI farging) og apoptose (Annexin-PI-farging), ble analysert ved FACS [32], [33].
Immunoblotting
HUVEC ble behandlet med 30 pM av hver dose flavonolignan med eller uten VEGF-stimulering, lysater ble fremstilt og analysert ved immunblotting standard fremgangsmåte som beskrevet tidligere [33], [34]. α-tubulin og β-actin ble brukt til å bekrefte lik protein lasting.
Three Dimensional spheroid Formation analysen
I 24 brønners plater, ble 100 ul matrigel lagt. Deretter 100 ul RPMI-1640 og matrigel blanding (50:50) som inneholder ~ 1 × 10
3 DU145 cellene ble tilsatt. Etter 15 min, 1 ml RPMI-1640 medium med 10% FBS inneholdende DMSO kjøretøy eller 90 pM konsentrasjon av hver flavonolignan ble tilsatt i brønnen; behandlinger ble erstattet hver 48. time i 2 uker. Ved slutten av forsøket ble spheroid formasjon tellet under Zeiss invertert mikroskop ved 100x.
Statistiske analyser
Statistiske analyser ble utført ved hjelp av Sigma Stat programvareversjon 2.03 (Jandel Scientific, San Rafael, CA ). Den statistiske signifikans av forskjeller mellom kontroll og behandlede-grupper ble bestemt av Student t test og p 0,05 verdi ble ansett som signifikant. En måte ANOVA etterfulgt av Tukey test ble brukt for multiple sammenligninger. Autoradiogrammene /band ble skannet, og mener tettheten av band (der nevnt) ble bestemt ved hjelp av Adobe Photoshop 6.0 (Adobe Systems, San Jose, California).
Resultater
Effekt av Flavonolignans på PCA DU145 Xenotransplantat vekst
Når det gjelder anti-tumor effekt, oral administrasjon av flavonolignans effektivt hemmet veksten av DU145 xenotransplantater i nakne mus, og dette var merkbar fra tredje uke og utover (fig 1A.). Ved slutten av eksperimentet (10 uker), silybin En behandling inhiberte tumorvolumet med 44 og 50% med 50 og 100 mg /kg kroppsvekt doser, henholdsvis (p 0,05) (Fig. 1A); mens silybin B hemmet tumorvolumet med 38 og 47% ved samme doser, henholdsvis (p 0,05) (figur 1A.). I isosilybin A-behandlede mus, ble tumorvolumet inhibert med 44 og 50% (p 0,05) (Fig. 1A), mens i mus behandlet med isosilybin B tumorvolumet ble inhibert med 46 og 67% med 50 og 100 mg /kg kroppsvekt doser, henholdsvis (s 0,05) (figur 1A.). Totalt, isosilybin B var mest effektive i å hemme DU145 xenograft vekst, etterfulgt av silybin A eller A isosilybin og silybin B. Selv om disse forskjellene i den biologiske effekten av hver diastereoisomer oppnådde ikke statistisk signifikans; disse resultatene var konsistente med tidligere rapportert
in vitro
studier [21], [22].
På tidspunktet for obduksjon, ble alle dyr undersøkt for grov patologi, og vi ikke observere noen tegn på abnormitet i alle vitale organer undersøkt. Videre har administrasjon av disse forbindelsene gjennom oral gavage ikke forårsake noen vesentlig forandring i dietten forbruksmønster eller vektøkning av mus (data ikke vist). Også vi ikke observere noen negativ effekt i form av generelle oppførselen til dyr, noe som tyder på en generell trygg natur av disse forbindelsene.
Effekt av Flavonolignans på spredning og apoptose i DU145 xenografter
IHC analyse av DU145 tumorprøver viste at flavonolignans behandling inhiberer signifikant immunfarging for PCNA (en biomarkør for celle-proliferasjon) (fig. 1B), men øker TUNEL og spaltede-kaspase 3 positive celler (biomarkører for apoptose) (fig. 1C og 1D ). Selv om det er statistisk signifikant, effekten av flavonolignans på proliferasjon og apoptose relatert biomarkør var beskjedne, og kunne ikke helt forklare den observerte lavere xenograft vekst og nær 50% vekstinhibering med flavonolignan behandling (Fig. 1A). Derfor neste vi analyserte tumorvev for flavonolignans effekt på angiogenese, som er helt nødvendig for svulstene å vokse utover 1-2 mm størrelse [3].
Effekt av Flavonolignans på Angiogenese i DU145 xenografter
for å undersøke om disse individuelle flavonolignans hemmet xenograft vekst ved å undertrykke tumor angiogenese, farget vi svulsten delen med CD31 (en biomarkør for modnet microvessels) og nestin (en biomarkør for umodne og nydannede microvessels). Alle fire forbindelser inhiberte microvessel tetthet, både modne og nylig forming, men isosilybin B var forholdsvis mer effektive i sin inhiberende effekt på nestin-positive microvessels (fig. 2). VEGF er et potent pro-angiogene faktor [17], [35], og IHC analyser av tumorsnitt viser klart at behandling med disse diastereoisomerer reduserer både VEGF og VEGFR2 ekspresjon i tumorvev (fig. 2). Spesielt, med unntak av silybin A, VEGFR1 ekspresjon ble også signifikant redusert med disse midlene (fig. 3). Totalt sett isosilybin B var relativt mer potent i sin effekt på VEGF, VEGFR2 og VEGFR1 uttrykk. HIF-1α er master transkripsjonelle faktor som er stabilisert i henhold til hypoksiske betingelser i voksende tumorer og tumorkontroll metabolisme, så vel som ekspresjon av pro-angiogene faktorer, slik som VEGF [36], [37], [38]. Selv om HIF-1α stabilisering skjer under lave oksygenbetingelser, er dens ekspresjon også styres av serin /treonin kinase Akt [39]. Akt spiller også en viktig rolle i flere cellulære prosesser, slik som celleoverlevelse, apoptose, migrasjon og metabolisme [40], [41]. IHC analyser av svulster viste at alle de fire flavonolignans sterkt redusere HIF-1α og Pakt
ser473 nivåer, med marginal effekt på total Akt uttrykk bare ved isosilybin A og isosilybin B (Fig. 3).
effekt av Flavonolignans på Angiogenese i non-target Organs
for å bekrefte at anti-angiogene effekten av disse flavonolignans er spesifikke for tumorvev, analyserte vi utenfor målgruppen organer (lever, lunge og nyre) for CD31 uttrykket for å bestemme microvessels tetthet. Det var ingen forskjell i microvessel tetthet i lever, lunge og nyre mellom kontroll og mus som ble matet med rent flavonolignans (fig. 4A, CD31 kvantifisering data ikke vist). H E analyser viste også at disse diastereoisomerer har noen ugunstig effekt på histologi av normale organer (Fig. 4B).
Effekt av Flavonolignans på Angiogenese i
Ex Vivo
og
In Vitro
Analyser
Vi undersøkte videre antiangiogene aktivitet av flavonolignans i
ex vivo
kapillær-analysen ved hjelp av muserygg Aorta. Etter seks dagers dyrking på matrigel henhold angiogene betingelser, ble det observert et signifikant antall skip sprouting fra muse aortaer (markert med piler), som ble inhibert på en doseavhengig måte ved flavonolignans behandling (Fig. 5A).
en av de viktige trinnene i løpet av neo-angiogenese er dannelsen og sammenslåing av rørene som er produsert av endotelceller som danner et komplekst nettverk av fartøyer og kapillærer [42], [43]. For å forstå effekten av flavonolignans på denne biologiske hendelse, utførte vi tube-analysen. Som vist på fig. 5B, bunnfelt, alle fire forbindelsene inhiberte signifikant VEGF-indusert rørlengde i HUVEC. Som vist på bildene (Fig. 5B, topp panel), VEGF behandling indusert dannelse av rørformede nettverk av HUVEC, som ble avbrutt av flavonolignan behandlinger.
Effekt av Flavonolignans på VEGF-indusert spredning og Kiemotaktisk motilitet
VEGF spiller en viktig rolle i løpet av neo-angiogenese gjennom sin mitogen og motogenic virkning på endoteliale celler [17], [35]. I våre studier, VEGF-behandling induserte HUVEC veksten som ble sterkt hemmet av flavonolignans behandling (Fig. 6A). Slike behandlinger har også hemmet den kjemotaktiske motilitet av HUVEC mot VEGF i Transwell invasjon analysen (fig. 6B). Viktigere, isosilybin B var den minst effektive i forhold til de andre diastereoisomerene i form av hemmende effekt på kjemotaktisk motilitet av HUVEC.
Effekt av Flavonolignans på levedyktighet, cellecyklusprogresjonen og apoptose i HUVEC
for ytterligere å belyse den biologiske effekten av disse flavonolignans på endotelceller, analyserte vi levedyktighet, cellesyklus og apoptose i HUVEC. Som vist på fig. 7A, de fire flavonolignans (5-30 pM) hemmet HUVEC levedyktighet i en dose- og tidsavhengig måte. Cellesyklus analyser avslørte at alle diastereoisomerene indusert G1 arrest etter 24 timer med behandling, men bare silybin A, silybin B og isosilybin A også forårsaket G2 /M arrest (Fig. 7B). Etter 48 timer med behandling, den merkbare effekten av silybin A, silybin B og isosilybin A i HUVEC var induksjon av G2 /M arrest, som manglet med isosilybin B-behandling (Fig. 7B). Isosilybin En behandling (ved 30 uM) signifikant induserte S-fase rest etter 48 timers behandling, noe som kan være knyttet til sterk apoptotisk død indusert av isosilybin A (fig. 7B).
neste undersøkt effekten av disse flavonolignans på ulike cellesyklusregulerende molekyler, nemlig cykliner, CDK og Cdk inhibitorer samt deres regulatorer Skp2 og fosfataser Cdc25. Som vist på fig. 7C, de fire flavonolignans redusert nivåene av Cdk2 og Cdk4 med marginal effekt på Cdc2. Disse forbindelser har også reduserte nivåene av cyklin D1, cyklin D3, cyklin A, og cyklin B1. Silybin A og isosilybin En moderat økt p27 uttrykk, men det ble redusert med isosilybin B (Fig. 7C). Tvert imot, ble p21 ekspresjon ble redusert med silybin A, B silybin og isosilybin A, men ikke ved isosilybin B (Fig. 7C). Men alle fire diastereoisomerer sterkt redusert ekspresjon av Skp2 og Cdc25C med ingen eller moderat hemmende effekt på Cdc25A nivå (Fig. 7C). Disse resultatene antydet at disse fire diastereoisomerer ha noen lignende (men forskjellig i grad) og noen kontrast virkninger på ekspresjonen av cellesyklusregulerende molekyler.
Vi undersøkte deretter effekten av de rene flavonolignans (30 pM) på apoptose etter 36 timer med behandling i HUVEC. Som vist på fig. 7D, isosilybin B var den minst effektive når det gjelder å indusere apoptose relaterte morfologiske trekk (avløsning og avrunding), signalmolekyler involvert i apoptose (cPARP, kløyvde caspase 3 og 9) og prosentandel av apoptotisk cellepopulasjon i HUVEC. Omvendt, silybin A, silybin B og isosilybin En sterkt indusert apoptotisk død i HUVEC (Fig. 7D).
Effekt av Flavonolignans på VEGF-indusert signale i HUVEC
Deretter undersøkte vi flavonolignans effekt på VEGF-indusert signalkaskade som styrer spredning, bevegelighet og tube dannelse i endotelceller [35]. VEGF behandling sterkt økte VEGFR2 fosforylering på Ser1175 stedet, en pålitelig markør for sin aktivitet, som ble hemmet av forbehandling med flavonolignans (Fig. 8). Tilsvarende økte VEGF fosforylering av VEGFR1, Src, ERK1 /2, Akt, BAD, mTOR, og p70S6K. Som vist på fig. 8, bortsett ERK1 /2 og mTOR, fosforylering på andre områder ble hemmet av disse forbindelsene om enn i ulik grad. Sammenlignet med de andre diastereoisomerene, isosilybin B var det minst effektive når det gjelder effekt på VEGF-indusert signalmolekyler i HUVEC.
Differensial Følsomhet for Flavonolignans Mot PCA og endotelceller
Tidligere funn [ ,,,0],20], [21], [22], [24] og denne studien antydet at blant de fire rene flavonolignans, isosilybin B er den mest effektive når det gjelder effekt mot PCA celler, men overraskende nok har den minste effekt i form av dens virkning på HUVEC (hemming av kjemotaktisk motilitet eller apoptose-induksjon) (fig. 6 og 7). Derfor utførte vi en rekke eksperimenter for å belyse den relative effekten av disse fire diastereoisomerene mot PCA celler vis-à-vis endotelceller. Først analyserte vi deres effekt på den tredimensjonale veksten av DU145 cellene i matrigel. Behandling med disse forbindelser sterkt inhibert antallet og størrelsen av sfæroide dannet av DU145-celler med isosilybin B å være mest effektive (Fig. 9A). Deretter utførte vi co-kultur studier med Transwell kamre. Vi belagt HUVEC i det øvre kammer, mens DU145-celler ble dyrket i det nedre kammer. I to separate eksperimenter ble HUVEC eller DU145-celler behandlet med ren flavonolignans, og deretter, HUVEC invasjon gjennom matrigel ble undersøkt i hvert tilfelle. Som vist på fig. 9B, isosilybin B var den mest effektive i å redusere HUVEC migrasjon når DU145 cellene ble behandlet, men var minst effektive når HUVEC ble behandlet.
For å følge dette, behandlet vi DU145 cellene med disse diastereoisomerene (30 mm) og samlet den kondisjonerte medier. Den pro-angiogene potensialet av det kondisjonerte mediet ble analysert i et rør formasjon analyse ved bruk av HUVEC. Som vist på fig. 9C, kondisjonert medium fra DU145 cellene økt slangelengden samt rørformet nettverk dannet av HUVEC. Kondisjonerte medier fra behandlede flavonolignan DU145 cellene betydelig redusert rørlengden samt rørformet nett (fig. 9C). I dette assay også, isosilybin B var den mest effektive diastereoisomer (fig. 9C).
