Abstract
Molecular målrettet behandling har vært fokus for siste kliniske forsøk for behandling av pasienter med residiverende ovarialcancer (EOC). Flertallet har ikke klart seg godt som monoterapier for å bedre overlevelse av disse pasientene. Dårlig biotilgjengelighet, mangel på prediktive biomarkører, og tilstedeværelsen av flere overlevelsesreaksjonsveier kan alle minske suksess for en målrettet middel. Dasatinib er en tyrosin kinase inhibitor av Src-familie kinaser (SFK) og i prekliniske studier vist seg å ha betydelig aktivitet i EOC. Imidlertid, når de evalueres i en fase 2 klinisk studie for pasienter med tilbakevendende eller vedvarende EOC, ble det funnet å ha minimal aktivitet. Vi antok at syntetiske dødelighet skjermer utføres ved hjelp av en overbevisende designet siRNA bibliotek ville identifisere andre-språk molekylære mål som kan virke synergistisk med SFK hemming og forbedre dasatinib effekt. Ved hjelp av en systematisk tilnærming, utførte vi primært siRNA screening ved hjelp av et bibliotek med fokus på 638 gener som tilsvarer et nettverk som er sentrert på EGFR, HER2, og SFK-stillasproteiner BCAR1, NEDD9, og EFS å screene EOC celler i kombinasjon med dasatinib. Vi fulgte opp med valideringsstudier inkludert deconvolution screening, kvantitativ PCR å bekrefte effektiv genet stanse, korrelasjon av genekspresjon med dasatinib følsomhet, og vurdering av den kliniske relevansen av hits som bruker TCGA ovarialcancer data. En raffinert liste med fem kandidater (
CSNK2A1
,
DAG1
,
GRB2
,
PRKCE
, og
VAV1
) ble identifisert som viser størst potensial for å bedre følsomhet for dasatinib i EOC. Av disse
CSNK2A1
, som koder for den katalytiske alfa subenheten av protein kinase CK2, ble valgt for ytterligere evaluering. Synergistisk aktivitet i klinisk relevant hemmer av CK2, CX-4945, med dasatinib redusere celleproliferasjon og økt apoptose ble observert over flere EOC cellelinjer. Denne generelle tilnærming for å forbedre legemidlets effekt kan brukes til andre målrettede midler som på samme måte har vist dårlig klinisk aktivitet
Citation. Pathak HB, Zhou Y, Sethi G, Hirst J, Schilder RJ, Golemis EA, et al . (2015) En syntetisk Overskrift skjermen ved hjelp av en fokusert siRNA bibliotek for å identifisere Sensibilisator til Dasatinib terapi for behandling av ovarialcancer. PLoS ONE 10 (12): e0144126. doi: 10,1371 /journal.pone.0144126
Redaktør: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 16 september 2015; Godkjent: 15 november 2015; Publisert: 04.12.2015
Copyright: © 2015 Pathak et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. studien ble finansiert delvis av et stipend fra National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/) (CA140323) og Kansas biovitenskap Authority (https://www.kansasbioauthority.org/) Eminent Scholar Program til AKG. HBP er et tverrfaglig kvinner Health Research Scholar gjennom BIRCWH K12 Program ved University of Kansas Medical Center sponset av et stipend fra National Institute of Child Health and Human Development (https://www.nichd.nih.gov) (K12 HD052027 ). JH er en mottaker av Madison Lila Selv Graduate Fellowship (https://selfgraduate.ku.edu/). EAG arbeid støttes av en bevilgning fra National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/) (CA181287). Forfatterne erkjenner støtte fra National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/) Cancer Center Support tilskudd P30 CA168524 (University of Kansas Cancer Center) og P30 CA006927 (Fox Chase Cancer Center). AKG er Chancellors Distinguished Chair i Biomedical Sciences Velsignet professor. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den nest vanligste gynekologiske kreft afflicting kvinner i USA [1]. Med omtrent 14 000 dødsfall og 22.000 nye tilfeller årlig beregning, har eggstokkreft den høyeste dødeligheten til ny sak forholdet mellom alle gynekologiske kreftformer [1]. Det er tre hovedtyper av ovarietumorer klassifisert basert på deres vev av opprinnelse (overflate epitel, stromale endokrine celler og kjønnsceller), med epitelceller karsinom regnskap for 90% av eggstokkene malignitet [2]. Disse epiteltumorer er vanligvis delt basert på deres mobilnettet morfologi, de fire vanligste subtypene blir serøs, endometrioid, klare celle, og mucinous, med hver subtype ha forskjellig patogenese, chemo sensitiviteter, og prognoser [2, 3]. Foreløpig standard vare for kvinner diagnostisert med avansert stadium sykdommen er optimal debulking kirurgi etterfulgt av taxan og platina-basert kjemoterapi (vanligvis paclitaxel eller docetaxel i kombinasjon med carboplatin) [2]. Til tross for den gode responsen til dette innledende behandling, ~ 75% av pasientene etter hvert oppleve en gjentakelse av en svulst som til slutt blir behandlingsresistent. Respons på behandling er ofte mindre hyppig hos pasienter med residiverende sykdom og av kortere varighet enn initial terapi. Selv om bedret seg i det siste tiåret, er den samlede fem års overlevelse for pasienter med kreft i eggstokkene fortsatt bare 44% [1]. Men som flere molekylære karakterisering av sykdoms subtyper og en bedre forståelse av deres kliniske biologi og prediktive biomarkører blir tilgjengelige, personlig medisin kan gis for å bedre pasientens utfall gjennom inkludering av målrettet terapi [3-6].
molekylære målrettet terapi er i dag den viktigste fokus for kliniske forsøk for behandling av pasienter med tilbakevendende eggstokkreft [7-11]. De Src-familie kinaser (SFKs), det mest fremtredende medlem av den ni-medlem familien å være SRC kinase, er membranassosiert ikke-reseptor-tyrosin-kinaser ofte overuttrykt og aktivert i en rekke humane kreftformer og cellelinjer [12], inkludert en flertallet av sene stadier av serøs, mucinkjertler, og endometrioid epiteliale ovarietumorer og EOC cellelinjer [13-16]. De spiller viktige roller i regulering av signaloverføring fra celleoverflatereseptorer [17-19] og derfor modulerer mange cellulære funksjoner inkludert tumorprogresjon og metastase i en rekke humane tumorer, og har fått en fornyet interesse som potensielle mål for terapi [20-23 ]. Dasatinib er en oralt administrert ATP-konkurrerende kinase inhibitor av SFKs og BCR-ABL-fusjonsprotein, så vel som andre tumorrelevante kinaser [24, 25]. Dasatinib er en av tre behandlinger tilgjengelig for pasienter nylig diagnostisert med Philadelphia kromosom-positiv kronisk myelogen leukemi [26]. Det fortsetter å bli undersøkt for anti-tumorigen aktivitet mot en rekke hematologisk og solide tumorer (https://www.clinicaltrials.gov/). Vi har nylig rapporterte resultatene av en gynekologisk Oncology Group (GOG) sponset fase 2 klinisk studie GOG170M, evaluere dasatinib for behandling av pasienter med tilbakevendende eller vedvarende EOC eller primær peritoneal carcinoma [27]. Dasatinib viste minimal aktivitet som monoterapi hos disse pasientene [27], i likhet med resultatene fra mange tidligere GOG-170 serie Fase 2 kliniske studier som evaluerte andre målrettede midler som monoterapier ([4], www.GOG.org).
i de aller fleste av disse mono studier pasientens valg basert på en bestemt biomarkør ble ikke gjort noe som kan ha forbedret de observerte responsen. I tillegg er feilregulering og integrering av flere overlevelses baner i ovarietumorer [4] gjøre monoterapi utsatt å gi etter for teser aktiverte nettverk. Derfor, i denne studien, var vårt mål å eksperimentelt identifisere og validere andre stedet molekylære mål (e) som kan hjelpe bevisst eggstokkreft celler til dasatinib og dermed forbedre sin effekt. For å oppnå dette målet, vi opprinnelig utført små interfererende RNA (siRNA) -mediert genet Slå bruke et bibliotek rettet mot protein nettverk som er relevante for eggstokkreft og SFK funksjon. Dette biblioteket ble sentrert på reseptor-tyrosinkinaser (RTK) inkludert epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) og HER2; deres effektorer SHC1 og SHC3; og tre CAS-familien proteiner, NEDD9, BCAR1, og EFS, som direkte binder og påvirker SFK og BCR-ABL, og i noen tilfeller har vist seg å påvirke dasatinib svar [28-31]. Vi brukte dette biblioteket for å identifisere syntetisk dødelige kombinasjoner som forbedrer følsomheten av EOC celler til dasatinib. Vi så systematisk smalere vår trefflisten fra den primære skjermen og identifisert flere kandidat dasatinib allergifremkallende (
CSNK2A1
,
DAG1
,
GRB2
,
PRKCE
, og
VAV1)
. Av disse
CSNK2A1
som genereres av en av de mer fremtredende allergiske reaksjoner i siRNA skjermene og dens ekspresjonsnivåer ble funnet å være prediktive for dasatinib følsomhet i et panel av EOC cellelinjer. I tillegg
CSNK2A1
ble overexpressed med nesten to ganger hos pasienter med serøs cystadenocarcinomas. Derfor
CSNK2A1
ble ansett for å være den mest lovende mål blant de fem treff for hemming for å forbedre dasatinib aktivitet.
In vitro
legemiddel kombinasjonsstudier utført ved bruk av dasatinib og CX4945 (silmitasertib), den første og eneste klinisk relevant CK2-inhibitor [32], viste en betydelig synergi på tvers av et panel av EOC-cellelinjer for å redusere proliferasjon og øke apoptose. Den fokusert, systematisk tilnærming som vi har tatt i denne studien å identifisere andre-språk sensitive å forbedre dasatinib effekt kan også brukes på andre målrettede midler som på samme måte har vist dårlig klinisk aktivitet.
Resultater
Identifisering av dasatinib-sensibiliserende treff
den primære screening av en EOC cellelinje ble utført ved hjelp av en spesialdesignet, siRNA bibliotek fokusert på kommunikasjon signal protein nettverk som er sentrert på EGFR, HER2, SHC1, SHC3, NEDD9, BCAR1 og EFS. Denne skikken bibliotek besto av 1,276 siRNA tomannsboliger rettet mot 638 menneskelige gener (en pool av to sirnas per genet per brønn). Design og utvikling av denne nettverksbasert fokusert siRNA screening bibliotek ble tidligere beskrevet av Astsaturov
et al
. [33]. Vi valgte dette biblioteket fordi det målrettet mange av signalproteiner som virker oppstrøms, nedstrøms, eller parallelt med SFK, gitt sin samspill med RTK [34, 35] og sin fremtredende rolle i å tilrettelegge signaltransduksjon fra RTK [17-19], gi oss med de mest relevante og sannsynlige kandidater til å målrette i kombinasjon med hemming av SFK.
Vi brukte denne fokusert biblioteket for å skjerme en EOC cellelinje, A1847, avledet fra en pasient med en ubehandlet, udifferensiert ovarialcancer [ ,,,0],36, 37], for å identifisere gener som gir resistens mot SFK-inhibering via dasatinibbehandlingen. Denne cellelinje ble valgt fordi det ga stabile, reproduserbare transfeksjon dataene under high-throughput screening betingelser i et siRNA-basert skjerm av det humane druggable genom [38], og fordi det var følsom for dasatinib forhold til andre EOC-cellelinjer (Pathak og Godwin , upubliserte resultater). Vi antok at identifisering av andre-språk mål som ytterligere bevisst en følsom cellelinje vil sikkert gi en viss grad av overfølsomhet overfor mer resistente cellelinjer. Figur 1 gir en generell skjematisk av den samlede eksperimentell design (se Materialer og metoder for detaljer om screening). Etter statistisk analyse av de normaliserte cellelevedyktighet data oppnådd fra den primære screening av A1847-celler i nærvær av siRNA + dasatinib eller siRNA + dimetylsulfoksyd (DMSO, kjøretøy som brukes til å oppløse dasatinib), en sensibilisering indeks (SI) verdi ble beregnet for hver siRNA bassenget. Totalt 84 gener med en SI verdi ≤ 0,85 og en falsk funnrate (FDR) 10% representerer ~ 13% av genene målrettet av dette biblioteket ble valgt for inkludering i den neste runden av screening (S1 Table, primære skjermen).
A-F. En generell skjematisk av den eksperimentelle arbeidsflyt av primære og sekundære siRNA screening og påfølgende validering og raffinement eksperimenter utført for å identifisere de andre-språk sensitive for dasatinib. Detaljer for hvert sett av eksperimenter er gitt i de påfølgende figurene og supplerende figurer og tabeller i hele under resultatene.
eliminere falske positive treff
For å eliminere potensielle falske positive hits fra det første skjermbildet som kan skyldes off-target effekter av opprinnelig brukt sirnas, vi satt sammen et nytt bibliotek som inneholder fire individuelle siRNAs (1 siRNA /brønn) rettet mot hver av de 84 gener som er identifisert i den primære skjermen. Med denne nye bibliotek med de-convoluted sirnas, utførte vi en sekundær skjerm i tre eksemplarer og beregnet SI-verdien for hver siRNA som ble gjort for primærskjermen. S1 Fig viser korrelasjonen for 2 av de 3 skjermer for både kjøretøy og dasatinib behandlinger. Vi vurderte gener som dasatinib-sensibiliserende bare hvis de ga en gjennomsnittlig SI verdi ≤ 0,85 for
minst
to av de fire individuelle siRNAs rettet mot et bestemt gen på tvers av de tre biologiske replikere eksperimenter (S1 Tabell, sekundær skjerm). Basert på disse strengere kriterier, fjernet vi 44 potensielle falske positive treff identifisert i det første skjermbildet.
For de resterende 40 treff, vi samlet de to beste sirnas rettet mot hvert gen (
i
.
e
. de med de to laveste SI verdier identifisert fra de sekundære skjermer) og tilført de A1847 celler med dette optimal pool av de to mest effektive sirnas (2 sirnas /brønn /gen) eller negativ kontroll siRNA , GL2, målretting firefly-luciferase genet. Førti-åtte timer etter transfeksjon, utførte vi kvantitativ RT-PCR for å bestemme mRNA nivåer i celler målrettet av genet spesifikke siRNA bassenger i forhold til nivåene i cellene målrettet av den negative kontrollen siRNA. Vi vurderte å være på målet bare de siRNA bassenger som redusert genekspresjon med minst 70%. Basert på disse kriteriene for QRT-PCR resultater, smalere vi vår trefflisten av dasatinib-sensibiliserende hits til 31 gener (S2 Table).
Spesifisitet av dasatinib-sensibiliserende treff
Gitt at dasatinib hemmer andre tyrosinkinaser i tillegg til de SFKs, slik som BCR-abl, c-KIT, og PDGFR [24], ved fast vi nivået av spesifisitet av de 31 treff for sensibiliserende EOC celler til SFK inhibering. Vi brukte bassenget av de to beste sirnas rettet mot hvert gen (identifisert fra de-konvolusjonsteknikker studier) og vist de 31 treff i kombinasjon med dasatinib eller i kombinasjon med andre tyrosinkinasehemmer, imatinib, som hovedsakelig er rettet mot BCR-ABL, PDGFR, og cKIT, med begrenset aktivitet mot SFKs [39, 40]. siRNA-mediert genet Slå i kombinasjon med imatinib resultert i kun to av de 31 treff viser en allergi effekt på ≤ 0,85, mens alle 31 siRNA bassenger generert SI verdier ≤ 0,85 når vist i kombinasjon med dasatinib (S3 tabell). De to treff identifisert fra imatinib kombinasjon skjermen (
GAB1 Hotell og
JUP
) ble betraktet som vanlige allergifremkallende med dasatinib og derfor ble fjernet fra flere studier, raffinering dasatinib spesifikke hitliste videre til 29 treff.
Korrelere genuttrykk til dasatinib følsomhet
for ytterligere å avgrense andre-språk sensitive til dasatinib, basalnivået av genuttrykk for 29 dasatinib sensibiliserende treff ble målt i syv EOC cellelinjer (A1847, A2780, C30, CP70, OVCAR5, SKOV3, og UPN275) ved hjelp 96☓96 dynamiske arrays på BioMark microfluidic kvantitativ PCR (qPCR) plattform (Fluidigm) (figur 2A). Disse EOC cellelinjer ble valgt fordi de viste varierende grad av dasatinib følsomhet i tidligere upublisert arbeid av Pathak og Godwin. Derfor, erholdt vi et mer nøyaktig måling av dasatinib følsomhet i disse cellelinjer ved å måle responsen dose av hver og beregne dens levedyktighet ved en dasatinib konsentrasjon på 1 pM (figur 2B). Størrelsen av korrelasjons (Spearman-koeffisient r) og statistisk signifikans (p-verdi) ble beregnet for hvert gen for å identifisere potensielle gener hvis ekspresjon nivåer korrelert med dasatinib følsomhet (S3 tabell). Fire slike gener (
BCAR3
,
CSNK2A1
,
PRKCA
, og
PRKCE
) ble identifisert til å være prediktive for dasatinib følsomhet, med en statistisk signifikant sammenheng mellom uttrykk og narkotika følsomhet (p 0,05, S3 tabell og figur 2C). Av disse
CSNK2A1 Hotell og
PRKCE
er omvendt korrelert med dasatinib sensitivitet (
i
.
e
., Lave nivåer av disse to genene føre høyere følsomhet for dasatinib) og derfor er potensielle sekundære mål (
e
.
g
., legemidler som reduserer deres nivå eller aktivitet i tumorceller vil bevisstgjøre disse cellene til dasatinib).
A. Den basale nivået av genuttrykk av 29 dasatinib-allergifremkallende gener i sju EOC cellelinjer ble målt ved hjelp av kvantitativ PCR utført med en 96☓96 dynamisk matrise på Fluidigm BioMark microfluidic plattform. Det er vist en representativ varme kart av den dynamiske matrise. Delta-C
t-verdier ble beregnet for hvert gen i hver cellelinje (se Materialer og metoder for detaljer). B. Data om doserespons av dasatinib.Til for syv EOC-cellelinjer ble generert og cellelevedyktigheten ved 1 uM dasatinib ble beregnet for hver cellelinje som en prosent av bærerbehandlede celler ved hjelp av GraphPad Prism. Vist er den gjennomsnittlige ± standardavvik av gjennomsnittet for hvert datapunkt. C. Delta C
t og dasatinib sensitivitetsdata (dvs. levedyktighet på 1fiM legemiddelkonsentrasjon) ble utsatt for Spearman korrelasjonsanalyse ved hjelp GraphPad Prism. Størrelsen av korrelasjons (Spearman r-verdi) er vist for de fire gener som viste en statistisk signifikant korrelasjon (p 0,05). Hvert punkt representerer en EOC cellelinje med fargen passer inn koden vist i panel 2B. Linjen gjennom datapunktene er kun ment som illustrasjon. S3 tabell viser r og p-verdier for de andre gener evaluert, men som ikke viser signifikans.
Klinisk relevans av dasatinib allergifremkall
Gener som protein produkter er abnormt produsert i overkant i eggstokkreft pasienter kan potensielt være målrettet med hemmere for å redusere sin aktivitet. Disse proteinene ville bli betraktet som klinisk relevante terapeutiske mål. Derfor analyserte vi genuttrykk data tilgjengelig gjennom Kreft Genome Atlas (TCGA) data portal på eggstokkreft [41] for de 29 dasatinib spesifikke sensitive oppført i S3 tabell. Genuttrykk data fra 518 serøs cystadenocarcinomas, den store histologisk subtype for EOC, og eggleder prøver fra 8 friske individer ble hentet fra databasen. Egglederen Epitel har vært implisert som en kilde utstedt høy grad serøs eggstokk-kreft [42-45] og derfor en passende sammenligningsgruppe. Av de 29 gener som er undersøkt, en gjennomsnittlig økning i genuttrykk større nivåer enn 1,5 ganger i tumorprøver i forhold til de vanlige prøvene ble observert i fem gener (
CSNK2A1
,
DAG1
GRB2
,
VAV1
, og
Ja1;
figur 3 og S4 tabell). Interessant, to av disse genene (
CSNK2A1 Hotell og
DAG1
) var også blant de fem beste hits med hensyn til nivået av overfølsomhet overfor dasatinib observert når genene ble helt stille på tribunen (S3 tabell).
Agilent genuttrykk data fra TCGA på 518 serøs cystadenocarcinomas og 8 egglederen prøver fra friske individer ble spurt for 29 dasatinib sensibiliserende gener. De seks Agilent sondene som viste ≥ 1,5 ganger økning i den gjennomsnittlige genuttrykket av de respektive gener i tumorprøver (grå bokser) i forhold til kontrollene (hvite bokser) vises. Linjene til hver boks tomten representerer uttrykket verdi på 5
th og 95
th persentiler. P-verdiene ble beregnet ved hjelp av en uparet tosidige t-test med GraphPad Prism. S4 tabell viser gjennomsnitts uttrykk verdier av Agilent sonder over svulsten og normale prøver for alle 29 gener.
In vitro
narkotika kombinasjon av dasatinib og CX-4945
med sin over-uttrykk i et flertall av eggstokkene tumorprøver, den lave SI verdi fra skjermen, og sin katalytiske natur,
CSNK2A1
er en topp kandidat for potensielle narkotika screening /utvikling og prekliniske studier i kombinasjon med dasatinib.
CSNK2A1
genet koder for den katalytiske alfa subenheten av protein kinase CK2, en serin-treonin kinase, og en CK2 inhibitor, CX-4945 (silmitasertib) [46-48], har nylig gjennomført en fase 1 klinisk rettssaken som en potensiell kreft narkotika [32]. Det er det eneste ATP-kompetitiv hemmer mot CK2 å ha denne statusen. Derfor valgte vi CX-4945 for å studere effekter på cellevekst i et panel av etablerte EOC cellelinjer når det kombineres med dasatinib. Celler ble behandlet med hvert enkelt middel eller en kombinasjon av de to medikamenter i et fast molart forhold over et område av konsentrasjoner. Figur 4A viser dose-responskurver for CX-4945 som et enkelt middel (sort linje) og kombinert med dasatinib ved et 20: 1 molforhold (grå stiplet linje). Doseresponskurvene for to andre molare forhold evaluert (8: 1 og 3: 1) er vist i fig S2. Kombinasjonsindeks (CI) verdiene ble beregnet for hver av de tre relasjoner og er vist i figur 4B. Medikamentkombinasjoner som resulterer i Chou-Talalay CI-verdier mindre enn 1 anses for å være synergistisk, mens kombinasjoner som resulterer i CI-verdier større enn 1 anses for å være antagonistiske [49, 50]. Disse dataene antyder at narkotika arbeider sammen for å hindre spredning over mesteparten av EOC cellelinjer.
A. Den Chou-Talalay metode [78] ble brukt til å utføre narkotika kombinasjonsstudier av dasatinib og CX-4945. Punktene representerer gjennomsnittet levedyktighet ± standardavvik av middelverdi etter 72 timer av medikamentbehandling ved de indikerte konsentrasjoner av CX-4945 (•) og CX-4945 + dasatinib (◆; konstant molart forhold på 20: 1 av CX-4945: dasatinib ) for de forskjellige EOC cellelinjer som prosent av bærerbehandlede celler. Kurve-fit linjer ble generert ved hjelp av ikke-lineær regresjonsanalyse i GraphPad Prism. Data for de andre molare forhold som ble evaluert er presentert i S2 fig. B. dose-responsdata ble anvendt for å beregne kombinasjonsindeksen (CI) -verdier for hver cellelinje på forskjellige molare forhold ved hjelp av CalcuSyn programvare [79]. CI-verdier mindre enn 1 tyder på at narkotika arbeider synergistisk. Vist er den gjennomsnittlige beregnede CI verdi ± standardavvik av gjennomsnittet.
evaluert ved virkningene av medikamentkombinasjonen på cellesyklusprogresjon og celledød ved hjelp av propidiumjodidfarging (S3 Fig). Vi har ikke funnet noen vesentlige endringer i cellesyklus fase fordeling med en av de enkle midler ved doser brukt. Imidlertid kombinasjonsbehandlingen økte prosentandelen av sub-G1-celler i de fleste av cellelinjene, noe som tyder på tilstedeværelsen av celler som gjennomgår apoptose (figur 5 og S3 Fig). Vi utførte derfor en direkte måling av apoptose ved å måle annexin V og spaltning av caspase-3 og -7 (figur 5). Begge analyser indikerte økte nivåer av apoptose i kombinasjons behandlede celler sammenlignet med de andre behandlinger. I mange tilfeller økningen i sub-G1 og apoptotisk cellepopulasjon følgende kombinasjon behandling var større enn additiv som indikert ved verdier som er større enn de som er beregnet ved hjelp av Bliss uavhengighet modellen [51].
cellesyklus og apoptose data ble kvantifisert for de angitte brette endringer i forhold til kjøretøy behandlede celler og blir presentert som søylediagram som viser gjennomsnittlig fold-endring ± standard feil av gjennomsnittet. I alle tre analysene, singel (das, 0,5 pM; CX-4945, 10 mM) og kombinasjoner medikamentbehandlinger (das, 0,5 uM; CX4945, 10 uM) var i 72 timer. P-verdiene ble beregnet ved hjelp av en t-test for sammenligning av kombinasjonsbehandling gruppen til hver enkelt middel behandlingsgruppe. Den stiplede linjen viser den teoretiske verdi hvis narkotika virke additivt beregnes med Bliss uavhengighet modellen (Bliss additivity verdi = FC
Das + (FC
CX-4945 (100-FC
Das)) /100 hvor FC er fold-endring [51]. Observerte verdier større enn Bliss additivity verdi indikerer synergi. Se Materialer og metoder for ytterligere analyse detaljer.
Diskusjoner
Dasatinib er godkjent terapeutisk for behandling av flere typer leukemi og blir brukt over hele verden hos pasienter både nydiagnostiserte og de tidligere behandlet for disse sykdommene [26, 52-55]. det blir også undersøkt i tidlig stadium kliniske studier av andre krefttyper ( https://www.clinicaltrials.gov/, [56]). Selv om, som vi tidligere har rapportert, det viste en begrenset respons som monoterapi hos tidligere behandlede pasienter med residiverende EOC [27], er det likevel en potent hemmer av Src-familie og BCR-ABL-tyrosin-kinaser som er godt tolerert av pasienter og hvor våre studier tilveie preklinisk rasjonale for å evaluere i kombinasjon med andre målrettede midler. I tillegg har hemming av SFKs blitt foreslått som en mekanisme for å forsterke antitumor-aktivitet av paclitaxel [57], stoffet som vanligvis brukes i førstelinjeterapi for pasienter med EOC. Identifisere måter å forbedre dasatinib aktivitet mot EOC ville ha betydelig og umiddelbar klinisk effekt.
Mot dette målet, har vi tatt en systematisk og rasjonell tilnærming til å identifisere andre-språk molekylære mål som sensitize EOC celler til dasatinib. Vi har identifisert fem gener (
CSNK2A1
,
DAG1
,
GRB2
,
PRKCE Hotell og
VAV1
) som kandidat andre- språk allergifremkallende til dasatinib og fire gener (
BCAR3
,
CSNK2A1
,
PRKCA
, og
PRKCE
) som predikator for dasatinib følsomhet. Selv
Ja1
ble identifisert som en potensiell andre stedet sensitive (fig 3 og S4 tabell), gjorde vi ikke anser det som et levedyktig alternativ for kombinasjon med dasatinib. Dette er fordi
Ja1
koder for JA, et medlem av SFK med en høy grad av strukturelle og funksjonelle homologi med andre familiemedlemmer [58, 59]. I tillegg hemmer dasatinib JA med samme selektivitet som andre SFK medlemmer [24]. Derfor trenger vi ikke vurdere
Ja1
som andre stedet molekylære mål gitt at det ser ut til dasatinib hemmer direkte Ja1 allerede. Av de resterende kandidatene,
CSNK2A1
er toppkandidat for kombinasjonsbehandling basert på de resultatene som presenteres i denne studien. Dens rolle i biologi av cellen og eggstokkreft og dets interaksjon med SFK medlemmer er kort omtalt nedenfor. En tilsvarende diskusjon er gitt for de resterende treff som tilleggsinformasjon.
CSNK2A1
koder for den katalytiske alfa subenhet av protein kinase CK2. Dette proteinet er en allestedsnærværende, konstitutivt aktiv serin /treonin kinase med viktige roller i celle levedyktighet og divisjon, og i undertrykkelse av apoptose [60-62]. CK2 er en promiskuøs kinase, med over 300 potensielle substrater [63] og en dobbel rolle både i celleproliferasjon og død gjør, som har vært innblandet i mange sykdommer [61]. CK2 protein nivåer er forhøyet i alle kreftformer som har blitt undersøkt [62, 64]. TCGA data på eggstokkreft viser at den katalytiske alfa-subenhet av CK2 er overuttrykt i et flertall av ovarietumorer (figur 3) og MEK-MAPK-CK2 veien har vært implisert i fenotypiske endringer i en cellekulturmodell som representerer progressive trinn i utviklingen av eggstokkreft [65]. CK2 har blitt identifisert som et lovende terapeutisk mål for kreftbehandling [62] og CX-4945, den kliniske fasen CK2 inhibitor som har blitt undersøkt i fase 1 forsøk, ble vist til synergize med gemcitabin og platinabaserte kjemoterapeutika
in vitro
bruker eggstokkreft cellelinjer og
in vivo
bruke en mus xenograft modell av eggstokkreft [51]. CK2 forhold til de SFK medlemmene er gåte med studier som viser at CK2 kan ned-regulere aktiviteten av minst tre SFK medlemmer (SRC, Fyn, og JA) via direkte fosforylering av deres treoninresiduer [66, 67], mens en annen studie viser at tyrosinfosforylering av CK2 ved SFK medlemmer øker CK2 katalytisk aktivitet [68]. Hvordan disse to kinaser samhandle med hverandre og om dette er direkte eller gjennom molekylære anstand som CDC37 [69] eller andre signalveier og hvordan deres virksomhet er modulert er ikke helt klart i øyeblikket. Detaljerte mekanistiske studier er nødvendig for å gi en mer inngående bilde og for å bidra til å generere en begrunnelse for hvordan synergi mellom disse to kinaser kan forekomme. Likevel er ytterligere preklinisk utvikling ved hjelp av dasatinib og CX-4945 eller andre relevante hemmere rettet mot SFK og CK2 for behandling av ovarialcancer garantert.
Gitt tid og penger investert og de mest verdifulle ressurser av alt, pasienter, i å utvikle trygge, svært potente målrettede medikamenter som dasatinib og andre lignende molekylært målrettede midler, er det viktig at alle potensielle veier for å forbedre disse eksisterende legemidler vurderes. Dette inkluderer identifisering rasjonell legemiddelkombinasjoner, reformulering etter alternative ruter for levering av legemidler, og gjenbruk for andre sykdommer som stoffet ikke ble opprinnelig godkjent. Til slutt, er identifisering av prediktive biomarkører for respons avgjørende for målrettet terapi for å ha større presisjon i pasientens valg, slik som måles for et gitt legemiddel uten en sann svarprosenten blir komplisert av inklusjon av pasienter som ikke svarer rett og slett fordi de ikke var egnede kandidater til å dra nytte av et bestemt legemiddel. I denne studien har vi tatt en fokusert tilnærming for å identifisere flere kandidater for kombinasjonsbehandling med dasatinib, en strategi som kan brukes på andre målrettede midler som på samme måte har vist dårlig klinisk aktivitet.
Materialer og metoder
Cell kultur
ovarialcancer cellelinjer brukt i denne studien har tidligere blitt etablert eller avledet av oss under en protokoll godkjent av Fox Chase Cancer Center Institutional Review Board og skriftlig informert samtykke (C30 og CP70 fra foreldre A2780 celler [70]; UPN275 [38]). [33].
