Abstract
NQO1 er en ny og lovende terapeutisk mål i kreftbehandling. Denne studien var å bestemme hvorvidt anti-tumor effekt av Tanshinone IIA (TSA) er NQO1 avhengig og for å belyse de underliggende apoptotisk celledød veier. NQO1
+ A549 celler og isogenically avstemt NQO1 transfektert og negative H596-celler ble brukt til å teste egenskapene og mekanismene for TSA-indusert celledød. In vivo anti-tumor effekt og de vev fordelingsegenskapene av TSA ble testet i tumor xenopodet nakne mus. Vi observerte at TSA induserte en overdreven dannelse av ROS, DNA-skade, og dramatisk apoptotisk celledød i NQO1
+ A549 celler og H596-NQO1 celler, men ikke i NQO1
– H596-celler. Hemming eller stillhet NQO1 samt antioksidant NAC markert reverseres TSA induserte apoptotiske effekter. TSA behandling signifikant forsinket tumorvekst av A549 tumor xenografter, som var betydelig antagonisert av dikumarol ko-behandling til tross for den økte og langvarig TSA ansamlinger i tumorvev. TSA aktivert en ROS utløst, p53 uavhengig og caspase avhengig mitokondrier apoptotisk celledød sti som er preget med økt ratio av Bax til BCL-XL, mitokondriemembranen potensial avbrudd, cytokrom c release, og påfølgende caspaseaktivering og PARP-1 cleavage. Resultatene av disse funnene tyder på at TSA er en svært spesifikk NQO1 mål agent og er lovende i å utvikle som et effektivt medikament i behandlingen av NQO1 positiv NSCLC
Citation. Liu F, Yu G, Wang G, Liu H, Wu X, Q Wang, et al. (2012) En NQO1 Initiert og p53-Uavhengig apoptotiske Pathway Bestemmer Anti-tumor effekt av Tanshinone IIA mot ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE syv (7): e42138. doi: 10,1371 /journal.pone.0042138
Redaktør: Siyaram Pandey, University of Windsor, Canada
mottatt: 16 mars 2012; Godkjent: 02.07.2012; Publisert: 27.07.2012
Copyright: © Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansielt støttet av en stiftelse for forfatteren av National Excellent doktoravhandling fra Kina (200 979), Foundation Natural Science of Jiangsu provinsen (BK2011065), Science Foundation for Youth Scholars av Ministry of Education of China (200 803 161 012), Program for New Century gode talenter i University (NCET-09-0770), og National Natural Science Foundation Kina (nr. 91029746, 30801422). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for omtrent 80~85% av alle tilfeller av lungekreft, og er den vanligste dødsårsaken hos menn og andre til brystkreft hos kvinner [1]. Kombinasjon kjemoterapi, vanligvis platina-basert, er i dag den førstelinjebehandling av valget for NSCLCs. Men prognosen for pasienter med avansert NSCLC er fortsatt dårlig med en median overlevelse på 8 to11 måneder og en 1-års overlevelse på 30% [2], [3]. Den langsiktige overlevelse (5-årig) var enda dårlig på rundt 15% [4]. Den siste utviklingen av ulike molekylære mål rusmidler og deres kombinasjon med kjemoterapi narkotika forbedrer utfallet av NSCLC terapi; Imidlertid er det fortsatt skuffende i behandling av avansert NSCLC. Selvfølgelig, det er et presserende behov for å identifisere nye terapeutiske mål og utvikle tumor-selektiv cellegifter som er spesifikke for NSCLCs
NAD (P) H:. Kinonoksidoreduktase (NQO1, EC 1.6.99.2) er en cytosolic flavoenzyme som katalyserer den obligatoriske to-elektron-reduksjonen av en rekke kinon substrater, ved å bruke både NADH og NADPH som elektrondonorer [5]. Opprinnelig NQO1 ble antatt å være en avgiftning enzym i lys av sin to-elektron reduksjon eiendom, utenom ett elektron reduksjon produsere ustabil og svært reaktive semiquinone [6], [7]. I det siste, ble det funnet at noen kinoner slik som mitomycin C, streptonigrin, E09, og RH1 [8], [9], ble [10], [11], [12] bioaktiveres av NQO1. Den bioaktive eiendom NQO1 lover det et ideelt mål for utvikling av anti-svulst narkotika, fordi ulike humane tumorer [13] har forhøyede NQO1 aktiviteter. I tilfelle av lungesvulster, er NQO1 aktivitet økes opp til 80 ganger i NSCLC-tumorer i forhold til normal lunge, og 20~35 ganger i forhold til SCLC-cellelinjer [14]. En slik differensiert uttrykk måte NQO1 mellom tumorer og normalt vev tyder på at NQO1 målet narkotika ville være svært selektiv i å drepe kreftceller og samtidig spare normalt vev. RH1 er en medikamentkandidat bioaktiveres ved NQO1 å frem hydrokinon i aktivering av aziridinet ringer og etterfølgende DNA-alkylering og interstrand tverrbinding. I dette tilfellet er NQO1 benyttes som en svulst selektiv enzym for å bioactivate prodrug og således å realisere en tumor spesifikk toksisitet. I tillegg til sin egenskap som en oksidoreduktase har NQO1 er også funnet direkte involvert i stabilisering av vital tumor-suppressorer p53 /p73 /p33 [15], [16]. Dessuten har NQO1 polymorfisme som fører til enzymet aktivitet er funnet å være en sterk prognostisk og prediktiv faktor i dårlig resultat av brystkreft [17]. Disse funnene tyder på at den farmakologiske rollen NQO1 er langt utover sin enzymaktivitet på å redusere kinoner. Tar sammen, ville det være av stor interesse å bestemme de terapeutiske potensialer og de underliggende mekanismer for NQO1 target midler på tumorer. p-Lapachone (Lap), en godt studert NQO1 substrat, er blitt identifisert som et lovende middel for forskjellige kreftterapi [18]. Men gjentatt oral behandling av Lap induserer anemi hos både rotter og mennesker som kan i stor grad begrenser sin søknad [19], [20]. En annen begrensning av Lap er dens NQO1 spesifikke aktiviteten kan bare gjennomføres innenfor et relativt smalt konsentrasjonsområde og eksponeringstidsvinduet [18]; det er tvilsomt om en slik tilstand kan være godt kontrollert i in vivo statene.
Tanshinone IIA (TSA) var et derivat av fenantren-kinon isolert fra Salvia miltiorrhiza (Danshen, i kinesisk), en mye brukt urte medisin. Selv om tradisjonell bruk i hovedsak fokusert på kardiovaskulære og cerebrovaskulære sykdommer [21], [22], [23], [24], anti-tumor aktivitet av TSA og andre liknende struktur tanshinones ble bekreftet i løpet av de siste tiårene [25], [ ,,,0],26], [27]. Forskjellige studier viste at TSA som utøves cytotoksiske virkninger mot en rekke humane tumorcellelinjer [28]. Til tross for tidligere innsats på å avsløre dens mekanismer [29], [30], den molekylære målet for TSA å lokke fram sin anti-tumor forblir effekt unnvikende. Vi har nylig funnet ut at NQO1 katalysert kinon reduksjon etterfulgt av umiddelbar glukuronidering er den dominerende metabolismen av TSA i både rotter [31] og mennesker [32]. NQO1 reduserer TSA for å danne en svært ustabil katekol mellomprodukt som auto-oksyderes tilbake til moder TSA og utgjør en intetsigende redoks-syklus fremstilling av oksidativt stress [31]. Disse funnene bedt oss å hypoteser om at NQO1 kan være den primære intracellulære mål av TSA i kreftceller.
Denne studien tar sikte på å fastslå om NQO1 spiller en sentral rolle i å initiere anti-tumor effekt av TSA både in vitro og in vivo. Isogenically matchet NQO1
+ og NQO1
– menneskelige H596 og NQO1 høy uttrykk menneskelig A549 NSCLC cellelinjer ble brukt for å bestemme NQO1 avhengig cytotoksisitet, apoptotisk effekt, ROS produksjon, DNA-skade, og cellulært opptak av TSA. Vi viser at TSA er en lovende NQO1 bestemt mål agent, som induserer celledød ved apoptose av NSCLC celler via en unik NQO1-initiert og ROS-mediert aktivering av p53-uavhengig, men caspase-avhengige mitokondrie apoptotiske sti.
resultater
TSA indusert cytotoksisitet er NQO1 avhengig og p53-uavhengig
for å finne ut hvilken rolle NQO1, ble TSA cytotoksisitetsassayer utført i NQO1 høy uttrykk A549 celler, NQO1 negative og transfektert H596 celler; NQO1 proteinnivåer og enzymaktiviteter i NSCLC-celler er vist i fig. 1A. Proteinekspresjon, og enzymaktiviteten av NQO1 kunne ikke påvises i H596-celler; den NQO1 enzymaktivitet i H596-celler NQO1 er mye lavere enn den i A549-celler, noe som er i overensstemmelse med tidligere funn [18]. TSA induserte en konsentrasjonsavhengig cytotoksisitet i A549-celler med en IC50-verdi på 5,32 uM. I motsetning til dette, NQO1 negativ H596-celler var stort sett motstandsdyktige mot TSA cytotoksisitet med en IC50 40 uM (Fig. 1B). NQO1 hemming av den spesifikke NQO1 inhibitor dicoumarol (DIC, 10 mm) kunne i stor grad hindre TSA cytotoksisitet i A549 celler; NQO1 siRNA knockdown kan også oppheve den cytotoksiske effekten av TSA, om enn i mindre grad til at ved DIC (fig. 1 C, D). Transfeksjon av NQO1 til H596-celler gjenopprettet dens mottakelighet for TSA-indusert cytotoksisitet. IC50 av TSA i H596-NQO1 og i H596-vektor cellelinjer er av 23,56 uM og 80 um, respektivt (figur 1E.). Av notatet, IC50 verdiene i A549 cellene var mye lavere enn i H596-NQO1 celler, som er i overensstemmelse med forskjellen på enzymaktivitet mellom disse to cellelinjer. Alle disse resultatene sterkt at TSA indusert cytotoksisitet er NQO1 avhengig. I tillegg ser det ut til at TSA viste bedre NQO1 target spesifisitet enn Lap; IC50-verdien forskjellen mellom A549 celler og H596 celler for TSA (5,32 mikrometer VS 40 mm) er mye høyere enn for Lap (1,94 mikrometer VS 3,93 mikrometer). Videre er forbehandling med typiske p53 inhibitor pifithrin-α (PFT-α) [33] og p53 stillhet ved siRNA hadde ubetydelig virkning på TSA-indusert cytotoksisitet (fig. 1F), noe som tyder på TSA indusert cytotoksisitet i et p53-uavhengig måte.
A, protein nivåer og enzymaktivitetene NQO1 i NSCLC celler. NQO1 aktivitet 1,0 nmol⋅min
-1⋅μg
-1 ble indikert ikke-detekterbare (ND). B, cytotoksisitet av TSA og Lap i NSCLC celler; Cellene ble utsatt for graderte konsentrasjoner av TSA (0,4 til 40 um) eller Lap (0,5-10 uM) i 72 timer. C, effekter av NAC eller DIC forbehandling; A549-celler ble forbehandlet med 5 mM av NAC i 1 time eller 10 uM av DIC i 30 min. D, effekter av NQO1 stillhet i A549 celler. E, TSA cytotoksisitet i H596 og NQO1-transfektert H596 celler. F, effekten av P53 hemming eller taushet; A549-celler ble forbehandlet med 10 pM av PFT-α i 5 timer eller forbehandlet med P53 siRNA. Data er vist som gjennomsnitt ± SE av tre uavhengige eksperimenter.
TSA induserer NQO1 avhengig og p53-uavhengig apoptotisk celledød
tunel analysene ble utført for å bekrefte at TSA indusert celledød er på grunn av induksjon av NQO1 avhengig apoptose. Som vist på fig. 2A, TSA induserte en konsentrasjonsavhengig apoptose og Tunel positive celler nådd over 80% ved 40 mikrometer av TSA behandling i A549 celler, mens tunel positive celler detektert fra H596 celler på TSA behandling er ingen forskjell fra kontrollbehandling. I tillegg kan både DIC og NQO1 siRNA betydelig omvendt TSA-indusert apoptose i A549-celler (Fig. 2A, B). Likeledes er transfeksjon av NQO1 til H596-celler i betydelig grad gjenopprettet dens mottakelighet for TSA indusert apoptose, karakterisert med en 38,02% versus 7,28% TUNEL-positive celler i H596-celler og NQO1 H596-vektor-celler (fig. 2C), respektivt. Resultatene av Tunel analysene er helt enige med de fra MTT basert cytotoksisitetstester studier, sterkt tyder på at TSA induserer en NQO1 avhengig apoptotisk celledød i NSCLC. I samsvar med den MTT resultat tunel analysen viste også at p53 inhibitor PFT-α og P53 siRNA hadde ubetydelig effekt på TSA indusert apoptose, noe som indikerer en p53 uavhengig apoptose indusert av TSA.
A, øvre, A549 celler og H596-celler ble utsatt for indikerte konsentrasjon av TSA i 48 timer; lavere, A549-celler ble forbehandlet med 10 uM av DIC i 30 min, 5 mM av NAC i 1 time, eller 10 uM av PFT-α i 5 timer og deretter eksponert for 40 uM av TSA i 48 timer. B, effekter av NQO1 eller p53 stillhet på TSA indusert apoptose i A549 celler. C, H596-H596 og vektor-NQO1 celler ble eksponert for TSA i 48 timer; Tunel analysen ble utført ved hjelp av Klikk-iT TUNEL Alexa Fluor 594 Imaging Assay Kit. Åtte til ti felt ble undersøkt i hvert forsøk, er tunel signal vises i rødt og Hoechst 33342 atom flekken er vist i blått. Høyre er de representative bilder av TUNEL farging. Alle data er vist som gjennomsnitt ± SE av tre uavhengige forsøk (# P 0,05, ## P 0,01, ### P 0,001, NAC, DIC forbehandling sammenlignet med TSA behandling alene, NQO1 siRNA forbehandling sammenlignet med kontroll siRNA forbehandling, H596-NQO1 celler sammenlignet med H596-vektor celler; ** P 0,01, *** P 0,001, TSA behandling sammenlignet med kontrollceller)
TSA induserer NQO1 avhengig DNA skade
.
Fordi DNA skade er en sentral initiativtaker på indusere apoptotisk celledød [34], forsøkte vi å finne ut om TSA behandling induserer NQO1-avhengig DNA skade og pauser. Som forventet, TSA induserte en dramatisk og konsentrasjonsavhengig DNA-skade i A549 og H596-celler, men NQO1 minimal i NQO1 negativ H596 og DIC eller siRNA forbehandlet A549-celler (fig. 3A, B og C). H
2o
2 (200 mm) behandling i 4 timer induserte nesten identisk DNA-skader i alle cellelinjene. Tidsforløpsdata viste at TSA induserte NQO1-dependnet DNA skade nådde maksimum etter 24 timers behandling, men litt redusert etter 48 timer, muligens på grunn av overdreven celledød (Fig. 3A). Det ble også bemerket at TSA 40 uM indusert ganske lik mengde av DNA-skade i A549-celler og H596-celler NQO1 på tross av forskjellig NQO1 enzymatisk aktivitet mellom A549 celler og H596-NQO1 celler. Vi foreslått at det er mulig at TSA 40 pM kan induseres en maksimal DNA-skader både for A549 og H596-NQO1 celler og således ingen forskjell ble observert. Imidlertid A549 celler er faktisk å være mye mer følsomt enn H596-celler til NQO1 TSA-indusert DNA-skade ved lavere dose utfordring (fig. 3B, C).
DNA-lesjoner bestemt ved alkaliske komet analyser. A, TSA induserte DNA-skade i A549 og H596-celler, så vel som effekten av NAC eller DIC forbehandling. B, effekten av NQO1 stillhet i TSA indusert DNA skade i A549 celler. C, skade DNA i H596-NQO1 og H596-vektor celler. Venstre panel, representant morfologiske utseende av celler med TSA behandling i 24 timer; høyre panel, kvantitative resultater uttrykt som ganger endring (T /C) av komet hale lengder eller uttrykt som komet hale lengder (vilkårlig enhet). Data er vist som gjennomsnitt ± SE av minst tre uavhengige eksperimenter. (# P 0,05, ## P 0,01 NQO1 stillhet vs. kontroll siRNA eller H596-NQO1 vs H596-vektor; * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, TSA eller H
2o
2 behandling sammenlignet med kontrollceller).
ROS produsert fra NQO1 bioaktive er en viktig mediator på TSA indusert apoptotisk celledød
Vi har funnet at TSA ble redusert ved NQO1 for å fremstille en meget ustabil katekol mellomprodukt som kan være enten konjugert med glukuronsyre i nærvær av UDP-glukuronsyre-transferaser (UGTs) eller auto-oksyderes tilbake til TSA uten dem [31]. Siden mangel på UGTs ble observert hos NSCLC-celler, er det rimelig å postulere at TSA kan utløse et fåfengt Redox syklus produsere overdreven ROS i NQO1 positive celler. For å støtte dette hensynet, ble DCF farging og glutation sykling analysen brukes til å overvåke TSA indusert ROS formasjon. Tidsforløpet for DCF fargedata viste at TSA (10 pM) indusert overdreven ROS dannelse i løpet av 30 minutter, og nådde metning i 60 min i A549-celler, men ikke i H596 og DIC forbehandlet A549-celler (fig. 4A). NQO1 stillhet i stor grad forhindres TSA indusert ROS-dannelse i A549-celler (fig. 4C). Konsekvent, transfeksjon av NQO1 til H596 celler restaurert evnen til TSA indusert produksjon av ROS fra fåfengt syklus (fig. 4D). Resultater hentet fra glutation sykling analysen (fig. 4E, F) støttes videre at TSA indusert ROS produksjon i en NQO1 avhengig måte. I kontrast, H
2o
2 induserte nesten identisk ROS-produksjon i alle tilfeller, uavhengig av NQO1 uttrykk.
Intracellulær ROS generasjon målt ved DCF farging. A, for tidsforløpsstudium ble cellene behandlet med 10 pM av TSA med eller uten forhåndsbehandling av 10 uM av DIC eller 5 mM NAC; B-celler ble utsatt for angitte doser av TSA i 1 time; C, effekten av NQO1 stillhet på TSA utløst ROS formasjon; Cellene ble utsatt for fire uM eller 40 uM av TSA i 1 time; D, H595-H596-celler og NQO1-vektor-celler ble utsatt for 10 uM eller 40 uM av TSA i 1 time. H
2o
2 (400 uM) ble anvendt som en positiv kontroll. E og F, glutation sykkel analyser; E, NSCLC-celler ble utsatt for angitte doser av TSA med eller uten forbehandling DIC i 24 timer. F, H596-H596-vektor og NQO1 celler ble eksponert for TSA i 24 timer. Data er vist som relative endringer av tomme kontroller, og uttrykt som gjennomsnitt ± SE av minst tre uavhengige eksperimenter. (# P 0,05, ## P 0,01, ### P 0,001 NQO1 siRNA vs. kontroll siRNA, H596-NQO1 vs H596-vektor, A549 med DIC vs. TSA alene; * P 0,05, ** P 0,001, TSA eller H
2o
2 behandling vs. sine respektive kontrollceller)
I lys som NQO1 utløste ROS produksjon er en veldig tidlig og kontinuerlig hendelse, er det viktig å finne ut om ROS produsert fra TSA kinon og katekol resirkulering er en sentral aktør i TSA indusert apoptotisk celledød. Forbehandling av A549-celler med 5 mM N-acetylcystein (NAC), en typisk ROS scavenger, var tilstrekkelig til å fjerne TSA indusert intracellulær ROS (Fig. 4A). NAC forbehandling kunne gi en betydelig forhindre TSA indusert cytotoksisitet (fig. 1C), apoptose (Fig. 2A), og DNA-skade (fig. 3A). Videre, i alle test aspekter, reverserings virkningene av NAC forbehandling er nesten sammenlignbar med det som oppnås ved DIC forbehandling. Alle resultatene indikerte at ROS produsert fra NQO1 katalyserte gjenvinningsprosess er en viktig mediator på å indusere apoptotisk celledød av NSCLC-celler.
TSA forårsaket NQO1 og ROS-mediert, p53 uavhengig aktivering av mitokondrisk veien
Som vist i fig. 5, TSA forårsaket en doseavhengig avbrudd av MMP, som er i overensstemmelse med en tidligere studie av Chiu et al [35], hvor TSA ble funnet å indusere en ROS-mediert mitokondriell apoptotisk celledød. Fordi vi fant her at TSA indusert apoptotisk celledød var NQO1 avhengig, og dermed søkte vi å finne ut hvilken rolle NQO1 i aktivering av mitokondrielle apoptotisk celledød veien. NQO1 inhibitor DIC, NQO1 siRNA, samt NAC forbehandling kunne gi en betydelig omvendt TSA indusert MMP avbrudd, noe som indikerer en NQO1 avhengig og ROS-mediert mitokondriell forstyrrelser indusert av TSA. P53 siRNA hadde ingen effekt på TSA indusert ødeleggelse av MMP, noe som tyder på en p53-uavhengig mekanisme.
A549-celler ble utsatt for TSA av graderte konsentrasjoner (4, 10, og 40 uM) alene eller forbehandlet med DIC, NAC eller utsatt for NQO1 og p53 stillhet, før behandlingen av 40 uM av TSA. Celler behandlet som indikert i 24 timer ble fylt med 3 uM av JC-1 i 15 minutter ved 37 ° C, deretter forsiktig vasket med PBS to ganger. I cytosol, den monomere formen av dette fargestoff fluorescerer grønne og innenfor den mitokondrielle matriks, sterkt konsentrerte JC-1 danner aggregater som fluorescerer rødt. A, representative bilder tatt av Leica BMI3000 B mikroskop med en konfokalmikroskop søknad. B, ble fluorescensen avlest ved 488 nm eksitasjon og 530 nm emisjon for grønt, og ved 540 nm eksitasjon og 590 nm emisjon for rødt ved hjelp av en Synergy-H1 fluorimeter (Bio-Tek Instruments) og forandringene i mitokondrie potensial ble beregnet som rød /grønn ratio for hver tilstand. (## P 0,01, ### P 0,001, DIC, NAC forbehandling sammenlignet med TSA behandling alene eller NQO1 siRNA forbehandling sammenlignet med kontroll siRNA forbehandlet celler; ** P 0,01, *** P 0,001, sammenlignet TSA behandling med kontrollceller).
TSA induserte behandlingen en gang og konsentrasjonsavhengig oppregulering av pro-apoptotisk Bax og nedregulering av pro-overlevelse BCL-XL i en NQO1 og ROS avhengig men p53 selvstendig måte (fig. S1, fig. 6A). Dette fører til en dramatisk øket forhold av Bax /Bcl-xl, som er godt kjent en viktig faktor i styrende celle apoptose via brudd i mitokondriene [36]. Mitokondrier avbrudd da føre til frigjøring av cytokrom c fra mitokondrier, som dokumentert fra cytosoliske økningen men mitokondriell reduksjon av cytokrom c (fig. 6B).
A549-celler ble utsatt for TSA av graderte konsentrasjoner (4, 10 , og 40 uM) alene eller forbehandlet med DIC, NAC, eller utsettes for NQO1 og p53 stillhet, før behandlingen av 40 uM av TSA i 48 timer. A, helcellelysater ble utarbeidet etter angitte behandling og western blot analyse ble utført ved bruk av anti- Bax, -Bcl-xl, -PARP, -cleaved PARP, -NQO1, -p53, og -GAPDH antistoffer. B, cytosoliske og mitokondrielle proteiner ble fremstilt for Western blot-analyse ved anvendelse av anti-cytokrom c antistoff; svingninger i protein lasting mellom prøvene ble overvåket ved GAPDH eller COX-IV-nivåene, respektivt. Den relative tetthetsverdi for hvert bånd vises under Western blot. Dataene er representative for et typisk eksperiment som ble utført tre ganger (middelverdier, P 0,05)
caspaseaktivering ble deretter analysert av en aktivitetsanalyse ved hjelp av substrater av aktiv kløyvet caspase og en western blot. analyse av PARP spalting (fig. 6A, og fig. 7A, B). TSA doseavhengig økt aktiviteten av caspase-3, -9, og -8. Konsentrasjonen avhengig induksjon av PARP cleavage støttet caspase-3-aktivering videre. Den pan-caspase-hemmer, z-VAD-FMK, i stor grad svekket TSA indusert apoptose (Fig. 7C). Til sammen tyder disse resultater på at TSA indusert apoptotisk celledød er kaspase-medierte. I samsvar med andre aspekter testet i vår studie, TSA indusert kollaps av MMP, cytokrom c release, og caspaseaktivering var alle NQO1 og ROS avhengig men p53 uavhengig
A og B, caspase aktivitet test.; A549-celler ble utsatt for TSA av graderte konsentrasjoner (4, 10, og 40 uM) alene eller forbehandlet med DIC, NAC, eller utsettes for NQO1 og p53 stillhet, før behandlingen av 40 uM av TSA i 48 timer. C, TUNEL analysen av TSA indusert apoptose med eller uten forbehandling av pan-caspase inhibitor z-VAD-FMK. Data er vist som gjennomsnitt ± SE av minst tre uavhengige eksperimenter. (## P 0,01, ### P 0,001, DIC, NAC eller z-VAD-FMK forbehandling sammenlignet med TSA behandling alene, NQO1 siRNA forbehandling sammenlignet med kontroll siRNA forbehandlet celler; * P 0,05, ** P 0,01 , *** P 0,001, TSA behandling sammenlignet med tomme kontrollceller)
Antitumoreffekt effekt~~POS=HEADCOMP av TSA in vivo er NQO1 avhengig
for å bekrefte rollen NQO1 den. antitumor effekt av TSA ble videre undersøkt i A549 tumor-xenografter med TSA-behandling alene eller i kombinasjon med DIC (fig. 8A). TSA (20 mg /kg) behandling kunne gi en betydelig undertrykke tumorvekst; etter 20 dagers behandling, volumet av tumorene i TSA behandlede gruppe var fra 279 ± 46 mm
3 (P 0,01, sammenlignet med kontrollgruppen av 552 ± 90 mm
3). DIC behandling alene også svakt hemmet tumorvekst, karakterisert ved tumorvolum på 439 ± 99 mm
3; det motsatte, DIC forbehandling antagoniserte betydelig den tumor suppresjon effekten av TSA, noe som tyder på at den antitumoreffekt av TSA in vivo ble også NQO1 avhengig. Histologiske undersøkelser viste stor tumor nekrose og apoptose dukket opp i TSA behandlet gruppe mus, og i notatet, ble ingen toksisitet i normale organ vev observert på TSA behandling i 20 dager (Fig. 8B).
A, øvre, tumor volum måling (P 0,01, TSA vs. kontroll; P 0,05, TSA vs. TSA + DIC); lavere, tumor vekt (# P 0,05, TSA vs. TSA + DIC, *** P 0,001, TSA vs. kontroll); Dataene er vist som gjennomsnitt ± SE av seks mus. B, histologiske undersøkelser; tumor og vevssnitt ble analysert med hematoxylin og eosin farging av histologiske egenskaper. C, biodistribusjon av TSA i A549 svulst lastet hårløse mus; Dataene er vist som gjennomsnitt ± SE av 6 mus.
Å vurdere svulst opphopning nivåer av TSA, ble vev distribusjon studie utført i mus med A549 tumorxenotransplantater (Fig. 8C). I tråd med vår tidligere studie av TSA fordelinger hos rotter [37], TSA som ble utarbeidet som en solid spredning med PEG6000 fortrinnsvis fordeles i det retikuloendoteliale system. Til tross for denne begrensningen, kan TSA fortsatt effektivt distribuere inn i tumorvev; TSA viste høyere akkumulering nivåer og langvarig eksponering ganger i svulster enn i plasma. DIC forbehandling, til tross for å motvirke svulst undertrykkelse effekten av TSA, betydelig økt eksponeringsnivåer TSA herunder at i tumorvev, ved en mekanisme for å hemme TSA metabolisme via NQO1 /UGTs [31]. Forbedre TSA levering som kan flykte fra retikuloendotelialsystemet opptak kan forventes å ytterligere øke sin svulst opphopning nivåer og dermed bedre anti-tumor effekt.
Diskusjoner
Samler bevis tyder på at NQO1 er et lovende terapeutisk målrette ulike svulster, spesielt for NSCLC, der NQO1 er overuttrykt sammenlignet med normal lungevevet [14]. Likevel er det for tiden ingen konkrete NQO1 mål legemidler som brukes i klinikken og dermed dets terapeutiske verdi forblir uutforsket. Selv om noen anti-tumor medikamenter slik som mitomycin kan bioaktiveres ved NQO1, alle av dem mangler tilstrekkelig selektivitet og spesifisitet overfor NQO1 og deres anti-tumoreffekter blir bedre forklart ved andre mekanismer [38], [39]. Bevis hentet fra studier av Lap indikerer at NQO1 aktivert fåfengt Redox syklusen kan indusere en unik celledød vei, inspirere den nye ideen om å utvikle NQO1 mål anti-svulst narkotika. Denne studien bidrar til å identifisere en bestemt NQO1 substrat TSA, som induserer en unik p53 uavhengig aktivering av mitokondriell apoptotiske sti på NQO1 bioaktive.
Hypotesen om NQO1 som den intracellulære mål av TSA var basert på tidligere funn om at NQO1 er den hastighetskontrollerende enzym for å bestemme TSA metabolismen [31], [32]. For å bekrefte det, studerte vi rollen som NQO1 i å bestemme anti-kreft effekt av TSA mot NSCLC. I alle testede aspekter, TSA utstilt i en NQO1 avhengig måte på å indusere cytotoksisitet, apoptose, ROS produksjon, og DNA-skade; alle disse hendelsene kunne observeres bare i NQO1 positive cellelinjer A549 og H596-NQO1. Konsekvent, kan stillheten NQO1 av spesifikk hemmer DIC og siRNA i stor grad oppheve alle disse hendelsene i A549 celler. Enda viktigere, NQO1 avhengig anti-kreft effekt av TSA ble ytterligere bekreftet i A549 tumorxenografter. TSA (20 mg /kg) behandling betydelig forsinket tumorvekst, mens den samtidig bruk av DIC kunne i stor grad oppheve denne effekten. Det var veldig interessant å merke seg at DIC øker svulst opphopning av TSA betraktelig reduserer sin anti-tumor effekt (Fig. 8). Dette kan forklares med det faktum at TSA ble hovedsakelig metaboliseres av NQO1 og UGTs. Men NQO1 hadde liten innflytelse på cellulært opptak av TSA, som dokumentert fra den observasjon at de cellulære ansamlinger av TSA i A549 og H596 cellelinjer var nesten identisk og siRNA stillhet NQO1 i A549 celler hatt liten effekt på TSA opptak (Fig . S2). Slike en farmakokinetisk og farmakodynamisk paradoks sterkt indikerer at NQO1 mediert bioaktive er avgjørende for fastsettelse TSA anti-NSCLC effekt.
De viktigste egenskapene til NQO1 katalysert bioaktive er å produsere en svært ustabil katekol mellom at auto-oksiderer til forelder kinon danner et fåfengt Redox syklus som gjør cellene til kontinuerlige ROS utfordringer. Det har nylig blitt rapportert at ROS produsert fra NQO1-mediert redoks-syklus spilt avgjørende rolle i Lap apoptose [40]. Det ser ut til at ROS kan også spille en viktig rolle i TSA-indusert celledød, ettersom NAC ko-behandling kunne i stor grad oppheve TSA-induserte DNA-skade, celle apoptose, og cytotoksisitet i NQO1 positive celler (Fig. 1, 2 og 3).
p53 tumor suppressor er en sentral regulerende komponent som registrerer ulike indre og ytre påkjenninger og initierer apoptotisk celledød [41]. Videre er p53-protein degradering negativt reguleres av NQO1 via inhibering av en ubiquitin-uavhengig 20S-proteosom-mediert degradering reaksjonsvei [42]. Derfor er det viktig å bestemme rollen til p53 på apoptotisk celledød indusert av NQO1 substrater. Alle bevis hentet fra denne studien indikerte at TSA indusert apoptotisk celledød er p53 uavhengig. Først forbehandlingen med typiske p53-inhibitor og p53 stillhet ved siRNA hadde ubetydelig virkning på TSA-indusert cytotoksisitet, apoptose, og alle de testede hendelsene i mitokondrie apoptotiske baner i A549-celler (fig. 1F, fig. 2A, B, Fig. 5 , fig. 6, fig. 7). For det andre, TSA kunne indusere relativ og konsentrasjonsavhengig cytotoksisitet og apoptose i H596-NQO1-celler (fig. 1E, 2C) hvor p53 er kjent som skal muteres [43]. Til slutt, TSA behandling i A549 celler indusert en konsentrasjonsavhengig effekt på å redusere p53 protein innhold, og av interesse, kan NQO1 inhibitor DIC synergize med TSA på synkende p53 protein innhold i A549 celler, men reversere nedregulering av NQO1 protein nivåer (Fig. S3 ). Selv om de detaljerte mekanismene bak TSA effekt på ned-regulering p53-proteinnivåer garanterer videre forskning har de foreliggende resultater indikerer at denne effekten kan være forårsaket av NQO1 regulert ubiquitin-uavhengig p53 degraderinger, fordi TSA behandling også ledet til nedregulering av NQO1 i parallelt med endring av p53-proteinnivåer (fig. S3). NQO1 kunne stabilisere p53 ved å hindre en ubiquitin-uavhengig proteasomal degradering [15], [44]. Konsekvent, kunne NQO1 inhibitor som DIC fremme denne nedbrytning sti og dermed forstyrre p53 initiert apoptotiske sti [45]. Våre funn at TSA synergizing med DIC på å redusere p53 protein nivåer gir rimelig forklaring på hvorfor NQO1 underlag indusert apoptotisk celledød er p53 uavhengig. Det kan tyde på at NQO1 underlag, som typisk NQO1 hemmere kan også fremme ubiquitin-uavhengig proteasomal degradering; detaljerte mekanismer er for tiden under etterforskning i vårt laboratorium.
Siden caspase fungerer som en sentral del av apoptose maskiner, vi neste søkt å finne sin rolle på TSA indusert apoptotisk celledød.
