Abstract
humant papillomavirus (HPV) er den etiologiske agent for livmorhalskreft. Likevel, er infeksjon med HPV ikke tilstrekkelig til å forårsake livmorhalskreft, fordi de fleste smittede kvinner utvikler forbigående epiteliale dysplasier som spontant regress. Progresjon til invasiv kreft har blitt tilskrevet ulike vertsfaktorer som immun eller hormonell status, som ingen tilbakevendende genetiske forandringer har blitt identifisert i livmorhalskreft. Dermed har presserende spørsmålet om det biologiske grunnlaget for livmorhalskreft progresjon forble uløst, hindrer utvikling av nye behandlingsformer og prognostiske tester. Her viser vi at minst 20% av livmorhalskreft havn somatisk-ervervede mutasjoner i
LKB1
tumor suppressor. Omtrent halvparten av svulster med mutasjoner næret enkelt nukleotid erstatninger eller microdeletions identifiserbare av ekson sekvensering, mens den andre halvparten næret større monoallelic eller biallelic strykninger detekterbare ved multiplex ligation probe forsterkning (MLPA). Biallelic mutasjoner ble identifisert i de fleste livmorhalskreftcellelinjer; HeLa, den første human cellelinje, havner en homozygot 25 kb sletting som skjedde
in vivo
.
LKB1
inaktivering i primære svulster var forbundet med akselerert utvikling av sykdommen. Median overlevelse var bare 13 måneder for pasienter med
LKB1
-deficient svulster, men 100 måneder for pasienter med
LKB1
-wild typen svulster (
P
= 0,015, log rank test, hazard ratio = 0,25, 95% KI = 0,083 til 0,77).
er LKB1
således en stor cervical tumor suppressor, viser at ervervet genetiske endringer drive utviklingen av HPV-indusert dysplasier til invasive, dødelige kreftformer. Videre
LKB1
status kan utnyttes klinisk å forutsi tilbakefall av sykdommen
Citation. Wingo SN, Gallardo TD, Akbay EA, Liang M-C, Contreras CM, Boren T, et al. (2009) Somatisk
LKB1
Mutasjoner Fremme livmorhalskreft progresjon. PLoS ONE 4 (4): e5137. doi: 10,1371 /journal.pone.0005137
Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada
mottatt: 20 februar 2009; Godkjent: 10 mars 2009; Publisert: 02.04.2009
Copyright: © 2009 Wingo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert gjennom Sidney Kimmel Translasjonsforskerne Science Awards til DHC, KKW, NB, og NES, en NIH NRSA F31 fellesskap til CMC, en Young Investigator Award fra American Cancer Society /UT Southwestern Simmons Comprehensive Cancer Center til DHC, og Nasjonalt Senter for Forskning Resources (K26RR024196) (DHC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er blant de vanligste kreftformene over hele verden, med over 500 000 nye tilfeller og 250.000 dødsfall hvert år. I utviklingsland er livmorhalskreft den ledende årsak til kreft dødsfall hos kvinner [1]. Infeksjon av livmorhals epitelceller med et overførbart agens-Human Papilloma Virus (HPV) -er nødvendig for utvikling av livmorhalskreft, som HPV DNA-sekvenser kan påvises i 99% av livmorhals svulster [2], [3]. Infeksjon med «høy risiko» HPV subtyper initierer tumorprogresjon ved oppheve cellesyklus kontroll og apoptose sjekkpunkter gjennom viral teinene E6 og E7, som inaktiverer p53 og RB tumor suppressor veier henholdsvis [2]. Dette fører til dannelsen av ikke-invasiv (
in situ
) cervical dysplasier kjent som High-grade squamous intraepitelial lesjoner, eller HSILs) [3], [4], [5]. Men disse HPV-induserte dysplasier er asymptomatiske og mest regress, viser at HPV er ikke tilstrekkelig til å resultere i livmorhalskreft [2]. Progresjonen av livmorhals dysplasiene til invasive, dødelige livmorhalskreft har blitt tilskrevet ulike faktorer som immun, hormonelle, og ernæringsstatus, eller co-infeksjon med andre seksuelt overførbare midler, men støtter data har vært tvetydig [2]. Insertional mutagenese av HPV er et annet forslag til tumor-fremme mekanisme, men nyere studier har ikke støttet denne hypotesen [6]. Ingen felles, tilbakevendende genetiske endringer som samarbeider med HPV for å fremme livmorhalskreft progresjon er blitt identifisert siden Harald zur Hausen først identifisert HPV som årsaksoverførbart agens av livmorhalskreft over tretti år siden [7]. Dermed har du trykker spørsmålet om det biologiske grunnlaget for livmorhalskreft progresjon forble uløst.
germline mutasjoner i
LKB1
tumorsuppressorgenet (aka
STK11
) resultat i Peutz-Jeghers syndrom (PJS), en arvelig tilstand karakterisert ved godartede gastrointestinale polypper og en forhøyet ( 15 x) risikoen for maligne epiteliale kreftformer ved forskjellige anatomiske steder [8].
LKB1
genet ble nylig vist å gjennomgå somatisk mutasjon i 30% av ikke-småcellet lungekreft [9], [10], noe som tyder på at
LKB1
kan spille en bred svulst lyddemper rolle. Dette, kombinert med våre nylige funn som
LKB1
inaktivering i mus livmoren eller epidermis fremmer aggressiv livmor og plateepitelkarsinom [11], [12] bedt oss om å undersøke hvilken rolle
LKB1
i livmorhalskreft progresjon.
Resultater
somatisk-ervervet
LKB1
Mutasjoner er vanlig i livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP Across Histologiske Subtyper
Sekvensering av
LKB1
genet i primærlivmorsvulster identifisert somatisk-ervervet (ikke-germline) mutasjoner i 8/86 (9%) prøver (Tabell 1, Tabell S1, Figur 1a). I tillegg til andre funnene som presenteres nedenfor, flere observasjoner hevder at disse mutasjonene er som en gruppe inaktive,
bona fide
kreftfremkallende mutasjoner. Først 4/8 svulster næret nonsense mutasjoner, slettinger eller innsett resulterer i rammeskifte og tidlig avslutning. De resterende fire svulster næret kinase domene mutasjoner i rester konservert i virveldyrarter, og to av disse svulstene næret en kjent PJS mutasjon (p.Arg304Trp) som opphever LKB1 kinase-aktivitet [13], [14], [15]. Til slutt, bare 1/9 kodende varianter var av germline opprinnelse, sammenlignet med ikke-kodende 7/7 varianter, en forskjell som er statistisk signifikant (p = 0,0014, Fisher Exact Test) spesielt ettersom den eneste kimlinje-kodende variant
c.2077C G product: (p.Phe354Leu) er en kjent ikke-patologisk nøytral variant stede i normale individer [16]. Sekvense også identifisert en homozygot
LKB1
kinase domene mutasjon i livmorhalskreft cellelinje C4I (figur 1B, Tabell S1).
(A) Representative kromatogrammene av primære svulster. (B) C4I cellelinje. Lavere paneler, prøver fra hver pasient kontroll DNA (for C4I, humant perifert leukocytter DNA). Vill-type sekvenser er vist nedenfor. Kromatogrammene representerer frem tråd med unntak tilfellet # 41 hvor revers komplement er vist til mer tydelig illustrere slettingen. Mutasjoner er heterozygot mindre annet er angitt. (C)
LKB1
slettinger i grunnskolen i livmorsvulster hos MLPA. Barer = relativ signalintensitet per sonde. Seksten prober (svarte) tilsvarer
LKB1
locus på kromosom 19. probe identifikatorer vist nedenfor. Sonder 0.9M5 «og 0.6M5» er ~900 og 600 kb 5 «av locus (telomeric), mens 10M3» er ~10000 kb 3 «(centromeric); resterende 13 prober tilsvare
LKB1
kodende /koding eksoner. Hvite striper tilsvarer tilfeldig valgt sonder fra andre kromosomer.
Selv om en liten (26 bp)
LKB1
sletting representerer et fullstendig tap-av-funksjon ble identifisert ved sekvensering (Tabell S1, figur 1A), større slettinger ville ha vært savnet. Å systematisk screene for sletting, ble multiplex ligation avhengig probe forsterkning (MLPA) for alle 10
LKB1
eksoner og tre flankerer sonder ansatt. Mens normal menneskelig DNA kontrollprøver (n = 3) konsekvent viste tilsvarende signalstyrker for alle sonder, MLPA identifisert tydelig
LKB1
slettinger i 10/86 tumorer (Tabell S1, figur 1C). I fem tumorer, delesjoner som syntes å være homozygot fordi signalene fra tilstøtende prober ble redusert ved 50% (figur 1C, tilfeller 60 og 22); restsignal i disse tilfellene skyldes sannsynligvis stromal forurensning. Av svulster med tilsynelatende heterozygote slettinger, inneholdt en også en betydelig mutasjon identifisert ved sekvensering (sak 41, som huser en 26 bp sletting, Tabell S1). Disse funnene er i samsvar med menneske og mus studier som viser at selv om tapet av andre allelet kan akselerere tumorprogresjon, mutasjon av en enkelt
LKB1
allele er i seg selv tumorigent (dvs.
LKB1
kan være haploinsufficient ) [9], [17]. Men det er også mulig at noen mutasjoner gikk ubemerket, eller at stromal forurensning førte til en undervurdering av homozygosity. I sammendraget, biologisk signifikant
LKB1
mutasjoner inkludert slettinger preger minst 20% (17/86) av invasiv livmorhalskreft. Kun ett tilfelle i vår studie (sak 20, som næret en somatisk ervervet
LKB1
mutasjon) ble diagnostisert som en minimal-avvik adenokarsinom (MDA), en sjelden, svært godt differensiert variant av livmorhals adenokarsinom forbundet med Peutz-Jeghers syndrom [18]. Dermed
LKB1
mutasjoner i livmorhalskreft var ikke begrenset til denne sjeldne histologisk subtype, men var til stede på tvers av de viktigste histologiske subtyper av livmorhalskreft-adenokarsinom, plateepitelkarsinom, og adenosquamous karsinom (figur 2, Tabell S1) [ ,,,0],4]
(A) Histologi av representative saker med
LKB1
mutasjoner (SCC = plateepitelkarsinom, Adeno = adenokarsinom; AdenoSq = adenosquamous karsinom, MDA = minimalt avvik adenokarsinom).. Scale bar = 20 mikrometer. (B) Relativ fordeling av de tre viktigste histologiske undergrupper blant
LKB1
-mutant (rød) vs.
LKB1
-wild typen saker (svart) (total = 100%) viser at histologisk spekteret er nesten identisk i
LKB1
null kontra vill type svulster.
slettinger av
LKB1
karakteristisk for de fleste livmorhalskreft cellelinjer
primære svulster er clonally mangfoldig og inneholder variable antall celler som fibroblaster og lymfocytter som kan skjule disse og andre analyser. For å overvinne denne begrensningen og få ytterligere innsikt i rollen som
LKB1
i livmorhalskreft, et panel av syv livmorhalskreft cellelinjer (HeLa, HT3, Siha, MS751, CaSki, C33a, og C4I) ble analysert. Påfallende, fem av disse syv cellelinjer næret
LKB1
strykninger, som gjorde HeLa derivatet HeLaS3 (figur 3A). Bare den CaSki (figur 3A) og C33a (ikke vist) cellelinjer som ikke utviste
LKB1
delesjoner. De fleste (4/7) hadde homozygot slettinger, mens en cellelinje med en heterozygot delesjon (C4I) også næret en punktmutasjon (figur 1B, Tabell S1) rasjonalisere tap av heterozygositet for denne mutasjonen i C4I. Southern analyse bekreftet tap av
LKB1
sekvenser (figur 3B) og som forventet, LKB1 protein var umulig å oppdage i cellelinjene husing homozygot slettinger (Figur 3C). Dette hyppig homozygosity av
LKB1
mutasjoner i cellelinjer understreker ytterligere den patogenetisk betydning
LKB1
tap i livmorhalskreft. Selv om antall tilgjengelige linjer og dermed analysert var liten, er det bemerkelsesverdig at flertallet av livmorhalskreft cellelinjer næret definitive bialleleic
LKB1
mutasjoner. Det er også mulig at etableringen av primære livmorhalskreft kulturer er forutinntatt mot
LKB1
-deficient svulster
(A) MLPA.; se figur 1 for sonde detaljer. HeLa, MS751, Siha, og HT3 (og HeLa kloning HeLaS3) inneholder særegne homozygot slettinger. C4I havner en monoallelic sletting, noe som gjenspeiles av sammenhengende sonder med halv intensitet signaler. (B) Southern analyse av kontroll DNA, over cellelinjer, C33 (ingen sletting av MLPA) og HPV16 /E6E7-udødelig endocervikale celler fra en normal pasient (Endo = End1 /E6E7; ATCC # CRL-2615). (C) Western-analyse. LKB1 protein er umulig å oppdage i linjene skjuler homozygote slettinger og redusert med -50% i C4I, i samsvar med monoallelic tap.
Fraværet av LKB1 protein i HeLa og HeLaS3 tidligere er notert [19].
LKB1
genet er assosiert med en fremtredende CpG øy, og mangelen på LKB1 protein og mRNA i HeLa-celler som tidligere var blitt tilskrevet promoter hypermethylation [20]. Men vi fant ingen bevis for
LKB1
hypermethylation ved metylering spesifikke PCR i en cellelinje eller primærtumorprøver. Tvert imot våre data viser at HeLa og andre livmorhalskreftcellelinjer ikke uttrykker
LKB1
grunn av homozygot slettinger, snarere enn som et resultat av epigenetisk lyddemping. I samsvar med tidligere studier utført i HeLa [19] og andre cellelinjer [9], håndhevet uttrykk for villtype LKB1 førte til cellesyklus arrest og veksthemming, viser at
LKB1
tap i disse cellelinjene er funksjonelt signifikant (data ikke vist).
for å definere sletting stoppunkter, PCR reaksjoner som produserer små amplikonene (100-200 bp) ble utviklet for å span locus (Figur 4A, B). Scoring (+/-) forsterkning av hvert produkt, etterfulgt av ytterligere PCR reaksjoner for gradvis smalere intervaller basert på resultatene av den første skanningen tillatt oss å kartlegge stoppunkter til innen noen få kb (figur 4C). Hver av de fire cellelinjer næret en tydelig sletting (~20-110 kb) fjerne deler av
LKB1 Hotell og maksimalt en andre flankerer locus (
SBNO
2).
(A)
LKB1
locus (kromosom 19p13.3). (B) 140 kb region (Ensembl50; 1050000-1190000) spenner
LKB1 Kjøpe og umiddelbart flankerer loci; intervaller = 10 kb. (C) Sletting brytningspunkter for cellelinjer som bærer homozygot slettinger. I MS751, slettede sekvenser er diskontinuerlig som vist, i samsvar med en mer kompleks omleiring. Piler = PCR primere for HeLa spesifikk PCR (400 bp). (D) HeLa spesifikk PCR (400 bp) bekrefter tilstedeværelsen av sletting i HeLaS3. (E) HeLa intragenic
LKB1
sletting skjedde
in vivo
. Archival blokker ble rørtråd for DNA forberedelse. Banene er som følger: (-) kontroll = ingen templat kontroll; tumor = metastatisk adrenal innskudd; ikke-tumor = normal binyrefunksjon (samme vevsblokk); (+) Kontroll = HeLa cellelinje DNA.
Molecular Cloning av HeLa
LKB1
Sletting Junction og
In Vivo
Opprinnelsen til sletting
for å klone på tvers av HeLa krysset, primere flankerer de 5 «og 3» stoppunkter kartlagt ved den ovenfor angitte PCR søkestrategi ble konstruert for å amplifisere et bestemt brytningspunkt produkt. Et 2,8 kb grensefragment ble klonet og sekvensert, noe som bekrefter nærværet av en delesjon (24662 bp, fig S1, Figur 4C). Begge stoppunkter ligger innenfor Alu repetisjoner (Figur S1), noe som tyder på at inter-Alu homolog rekombinasjon produsert slettingen. For å skape en effektiv PCR-analyse for sletting, ble primere umiddelbart flankerer repetitive Alu-sekvenser ved hvert knekkpunkt utformet (400 bp) (figur S1).
HeLaS3, en klonal derivat av HeLa først rapportert i 1955 [21 ], næret identisk
LKB1
sletting (figur 4D), om opprettelse 1955 som en
terminus ante quem
for opprinnelsen til slettingen. Imidlertid forble det formelt mulig at
LKB1
sletting oppsto
in vitro
etter etableringen av HeLa fra en primær cervikal adenokarsinom i 1951 [22]. For å løse dette spørsmål, ble HeLa svulst-DNA isolert fra en arkiv parafin-innleiret vev blokk fremstilt i løpet av pasientens obduksjon ved Johns Hopkins Hospital i 1951. En 400 bp HeLa-spesifikk PCR-produktet ble amplifisert fra svulsten (figur 4E ), om opprettelse at
LKB1
sletting skjedde
in vivo
.
forekomsten av
LKB1
HeLa sletting mens pasienten var i live antydet at
LKB1
inaktivering kan ha bidratt til den notorisk aggressiv vekst av hennes svulst både
in vivo Hotell og
in vitro plakater (se nedenfor og diskusjon). For å utforske muligheten for at
LKB1
mutasjoner påvirker sykdomsforløpet, ble progresjonsfrie overlevelseskurver generert for pasienter med tumorer næret
LKB1
identifiserte mutasjoner ved sekvensering eller MLPA (heterozygot eller homozygot) og pasienter med svulster var villtype for
LKB1
. Påfallende, median overlevelse var bare 13 måneder for pasienter med
LKB1
-deficient svulster, men 100 måneder for pasienter med
LKB1
-wild typen tumorer (figur 5) (P = 0,015 , log-rank test, hazard ratio = 0,25, 95% KI = 0,083 til 0,77).
LKB1
-deficient svulster var ikke mer avansert på tidspunktet for oppsetningen, for eksempel 28% av
LKB1
-wild typen svulster ble opprinnelig stadium I (begrenset til livmoren), vs. 43 % for
LKB1
-deficient svulster, eller av høyere grad (dvs. mer dårlig differensiert). Dermed
LKB1
mutasjoner i livmorsvulster gi en scene-for-scene økt risiko for tilbakefall, noe som tyder på at analyser av
LKB1
status vil være av klinisk nytte i å identifisere pasienter med økt risiko for sykdom progresjon.
Kaplan-Meier-kurver viser prosentandelen av pasienter med sykdomsutvikling over tid. Kurvene sammenligne pasienter med tumorer var heterozygote eller homozygot for mutasjoner /slettinger (
LKB1
) vs. pasienter uten mutasjoner /slettinger (vekt). Pasienter med en oppfølging besøk var inkludert i analysen. P-verdi per log-rank test.
Diskusjoner
Vår studie er den første til å vise at tilbakevendende genetiske mutasjoner forekommer i livmorhalskreft. En tidligere studie som undersøkte dette spørsmålet ikke identifisere
LKB1
mutasjoner i sporadiske tilfeller av livmorhalskreft, men bare minimalt avvik adenokarsinomer ble analysert, så målet med studien var å fastslå
LKB1
mutasjon frekvenser i gynekologiske kreftformer som er forbundet med PJS. Men dette tidligere studie, utført før advent av MLPA, identifisert LOH av
LKB1
19p13.3 region i 3/8 tilfeller, noe som tyder på at
LKB1
slettinger kan ha vært til stede [ ,,,0],23]. En annen studie der 26 livmorsvulster ble analysert ved single-strand conformational polymorfisme analyse identifisert
LKB1
mutasjoner i bare ett tilfelle [24]. Men denne studien også sterkt undervurdert hyppigheten av
LKB1
mutasjoner i lungekreft, nå kjent å forekomme i 20% av tilfellene. Ankomsten av MLPA letter nå den definitive identifisering av
LKB1
slettinger, som står for ~ 50% av mutasjoner i lunge og livmorhalskreft (dette og andre studier) [9]. En annen faktor potensielt skjule før sekvensen analyser er uvanlig høyt GC innholdet i
LKB1
exonic regioner. I vår erfaring, automatisert basen samtale programvare oversett en høy andel av mutasjoner, nødvendig direkte inspeksjon av kromatogrammene.
Oppdagelsen av en homozygot
LKB1
sletting i HeLa er bemerkelsesverdig på grunn av den historiske betydningen av denne cellelinjen til biomedisinsk forskning. HeLa ble hentet i 1951 fra en cervical adenokarsinom. Som den første udødeliggjort human cellelinje isolert og hell foreviget
in vitro
, HeLa sterkt akselerert utviklingen av biomedisinsk forskning i andre halvdel av 20
århundre [25]. HeLa-celler var uvanlig i vokser så raskt i kultur, men den primære svulsten var også aggressiv. Den primære tumor var begrenset til livmorhalsen på diagnosetidspunktet, men det metastasert tidlig og vidt til tross for aggressiv behandling inklusive strålebehandling, som fører til at pasienten dør bare seks måneder etter den innledende diagnose [26], [27], [28] . Våre resultater tyder på at homozygot delesjon vi har dokumentert i
LKB1
bidratt til denne aggressive vekst fenotype, rasjonalisere noen av de uvanlige funksjonene i HeLa primærtumor og cellelinje. I samsvar med denne ideen, håndheves uttrykk for
LKB1
cDNA i HeLa og andre HeLa-mangelcellelinjer induserer vekst arrest (upubliserte data, se også [9], [19]).
Dette er også den første rapporten som
LKB1
mutasjoner gi en dårligere prognose for en bestemt menneskelig kreft. Men dette er observasjoner i tråd med genetisk modifiserte musemodeller av
LKB1
mangel som konsekvent har funnet ut at LKB1 tap fremmer invasiv /metastatisk vekst. I
K-ras
drevet musemodeller av lungekreft,
LKB1
inaktive gitt den sterkeste samarbeid i form av svulst ventetid og hyppigheten av metastaser (i forhold til klassiske tumor dempere som
p53 Hotell og
Ink4a /Arf
). Det er også bemerkelsesverdig at
LKB1
tap i lungen ble assosiert med et bredt histologisk spektrum (plateepitelkarsinom til adenokarsinomer), minner om at
LKB1
inaktive karakteriserer livmorhals karsinom varierte histologiske subtyper [9 ]. Tilsvarende mus med målrettet inaktivering av
LKB1
i livmor epitel utvikle svært invasive (ennå paradoksalt ekstremt godt differensierte) endometrial adenokarsinomer [11]. Tatt sammen, disse og andre resultater [12], [29] hevder at LKB1 undertrykker invasjon og metastaser, og indikerer at analysene basert på LKB1 kan vise seg nyttige for forutsigelse i en rekke krefttyper. Det vil være av interesse å finne ut om
LKB1
mutasjoner er også nyttig prognostisk i andre kreftformer [9].
Det faktum at 99% av livmorhalskreft HPV DNA [2] som er tilfelle for de fleste av livmorhalskreft cellelinjer hvor vi demonstrert homozygot
LKB1
slettinger (f.eks HeLa havner integrert HPV-18-sekvenser) [30] tyder på at
LKB1 Hotell og HPV samarbeide på en eller annen måte . HPV-infeksjon fremmer dannelsen av
in situ
lesjoner, fører oss til å foreslå at flere mutasjoner i genene inkludert
LKB1
er pålagt å konvertere
in situ
dysplasier til invasive karsinomer, en idé i overensstemmelse med de forskjellige dyremodeller som er diskutert ovenfor. Videre studier dvs. med genetisk modifiserte dyremodeller vil være nødvendig for å forstå det biologiske grunnlaget for samspillet mellom HPV og LKB1. Den biologiske og biokjemiske grunnlag av LKB1-mediert karsinogenese fremdeles ikke helt klarlagt. Misregulation av AMPK-mTOR vei bidrar trolig LKB1 rolle som en tumor suppressor, men sannsynligvis ikke helt gjøre rede for sin rolle som formidler invasjonen [31]. Likevel kan misregulation av mTOR i LKB1-mangel svulster presentere muligheter for målrettet terapi (for eksempel ved bruk av metformin eller rapamycin analoger) hos kvinner som har livmorsvulster har bekreftet
LKB1
mutasjoner /slettinger, en idé som fortjener ytterligere etterforskning i fremtiden.
den biologiske grunnlaget for utviklingen av HPV-indusert precancers er udefinert. Denne studien presenterer den første definitive bevis på at tilbakevendende mutasjoner i diskrete vert gener oppstå i invasiv livmorhalskreft. Selv om andre faktorer sannsynlig innflytelse progresjon, denne studien viser at en prosess sannsynlig å være stokastisk, nemlig kjøpet av diskrete genetiske mutasjoner-stasjoner progresjon av livmorhals dysplasiene til invasive dødelige karsinomer og at disse mutasjonene har potensial til å tjene som nyttige prognosticators.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Studien ble godkjent av Institutional Review Board av UT Southwestern og Johns Hopkins sykehus.
pasientprøver og cellelinjer
Pasientene ble en undergruppe av pasienter diagnostisert med primær livmorhalskreft ved UT Southwestern universitetssykehus mellom 2000-2007 og som forutsatt informert samtykke. Histopatologiske diagnoser ble gjort per standardkriterier [4]. Tilstrekkelige mengder av vev fra den primære tumor måtte være tilgjengelige for å tillate isolering av DNA for sekvensering og MLPA; ellers var det ingen eksklusjonskriteriene. For de fleste pasienter, kontrollere DNA ble fremstilt av blod; for et lite antall pasienter som blod var utilgjengelig, ble DNA preparert fra parafin-embedded kontroll vev. Tumor stadium ble bestemt per Figo kriterier. Data for sykdomsprogresjon analyse per RECIST kriterier ble innhentet fra oppfølgingsbesøk. Vi anbefaler at pasienter har oppfølgingsbesøk hver 3. måned i 2 år, deretter hver 6. måned i 3 år, og deretter årlig. For progresjonsfri overlevelse, tid fra ferdigstillelse av primærbehandling til tilbakefall eller død ble registrert. Data for pasienter uten tumor tilbakefall ble sensurert ved tidspunktet for den siste oppfølgingsbesøk. For HeLa svulst studien ble en parafin blokk hentet fra arkivene til Johns Hopkins Hospital. Cellelinjer ble kjøpt fra ATCC.
DNA Sekvense
DNA ble fremstilt ved bruk Qiagen genomisk DNA kolonner. En to skritt «boost /reir» PCR-strategi ble ansatt der boost reaksjonen generert et større fragment brukt som mal for reiret reaksjon. De Nest produkter ble toveis sekvensert på ABI 3730 XL sequencere med ABI Big Dye Terminator 3,1 kjemi. Base kall ble utført med agenten systemet (Paracel). Sekvens tracings ble visuelt inspisert for å bekrefte nøyaktig variant deteksjon av base-ringer programvare. PCR-primer sekvenser /betingelser er tilgjengelig på forespørsel. Kode varianter ble bekreftet ved gjentatte PCR reaksjoner for å utelukke PCR gjenstander. Genbank NM_000455 ble brukt som referanse cDNA for nukleotid posisjoner.
Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification (MLPA) og Sør /Vest Analyse
MLPA ble utført som beskrevet [9]. For Southern-analyse, 10 ug genomisk DNA var
Xbal
-digested før gelelektroforese, overført til en membran og hybridisert med radiomerkede-prober (1-2 kb) ble generert ved PCR og bekreftet av ende-sekvensering. Membranen ble hybridisert til probe A, underkastet autoradiografi, inndampet i kokende 0,1% SDS, og rehybridized å sondere B. For Western-analyse, ble proteinekstrakter fremstilt fra adherente celler ved homogenisering i lyseringsbuffer + proteaseinhibitorer på is, underkastet SDS siders og immunoblottet med en LKB1 antistoff (# 3047, Cell Signal Technology) per produsentens anbefalinger.
Tissue Farging og Immunohistochemistry
Parafin blokk 5 mikrometer seksjoner ble deparaffinized /hydrert i en etanol-serien . Lysbilder ble farget med H E og mucicarmine per standardprotokoller. For immunhistokjemi, ble lysbilder utsatt for antigen gjenfinning i kokende i 10 mM NaCitrat; p63 antistoff (# MS1081, LabVision) ble brukt ved 1:400 med Immpress deteksjonssystem (Vector).
PCR Skanning Definere slettinger og HeLa-spesifikke PCR
PCR primere (produsere 100 -200 bp amplikonene) spenner over
LKB1
regionen ble utformet ved hjelp Primer3. Primerpar som produserer produkter av riktig størrelse når normal menneskelig DNA ble brukt som mal ble brukt til å kartlegge slettinger etter scoring nærvær /fravær av forsterkning med cellelinje DNA som mal. Ytterligere reaksjoner for å gi produkter som tilsvarer progressivt mindre intervaller ble utformet etter behov. Primer sekvenser og PCR betingelser er tilgjengelig på forespørsel. Person vev blokk-DNA ble fremstilt som beskrevet [32]. Primersekvenser for HeLa-spesifikk PCR (400 bp) ble For (5′-GGTTGCGATCAAGGCCCCGA-3 «) og Rev (5′-GCCTGTGGATGCCACACATG-3»). PCR-betingelsene var 95C × 10 «; 94C × 30 «, 58C × 30», 72C × 30 «(38 sykluser); 72C × 7 «.
Statistical Analysis
For sammenligning av muterte frekvenser, Fisher (tosidige) uparede eksakte test ble brukt. Overlevelseskurver ble generert i GraphPad Prism5, med sammenligning av kurvene utført med Log-rank (Mantel-Cox) test. Hazard ratio og dens konfidensintervall ble beregnet ved hjelp av Mantel-Haenszel metoden. P-verdier mindre enn 0,05 ble ansett for å indikere statistisk signifikans.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Kloning og karakterisering av
LKB1
intragenic sletting svake punktene i HeLa /HeLaS3. Et 2,8 kb-fragment som strekker seg over knekkpunktet sjonen ble klonet fra HeLa-DNA ved hjelp av PCR som beskrevet i teksten; 974 bp av denne sekvens er vist. Sekvens i fet røde bokstaver tilsvarer Alu gjenta hvor presumptive homolog rekombinasjon hendelse som resulterer i HeLa slettingen skjedde. Nukleotid polymorfismer i de to innfødte Alu-sekvenser (ikke vist) var i samsvar med en rekombinasjon hendelse som finner sted innenfor 5 bp eske sekvens (dvs. flankerer G basene var polymorfe og informativ). Sekvens i blått tilsvarer en unik sekvens i det menneskelige genom (Ensembl 50 19: 1145482-1145865). Denne sekvensen er ~11 kb fra 5 «enden av
LKB1
genet (transcriptional start). Sequence i grønt (Ensembl 50 19: 1170845-1171115) ligger innenfor
LKB1
intron 3-4. Pilene viser plasseringen av primere utformet for HeLa-spesifikk PCR (400 bp fragment). Den genomisk plasseringen av disse primere på genomisk kartet er vist i Figur 4C
doi:. 10,1371 /journal.pone.0005137.s001 plakater (0,01 MB PDF)
Tabell S1.
oversikt over LKB1 mutasjoner påvises ved sekvensering eller MLPA
doi:. 10,1371 /journal.pone.0005137.s002 plakater (0,01 MB PDF)
Takk
står i gjeld til Grover Hutchins (Johns Hopkins University School of Medicine) og Juanita Valenciana (UT Southwestern) for å få hjelp med prøven innkjøp og teknisk rådgivning. Vi takker også Jennifer Sayne og UT Southwestern Tissue Ledelse Resource av Simmons Comprehensive Cancer Center for å få hjelp med prøven innkjøp og klinisk informasjonshåndtering.
