Abstract
Anticancer egenskaper og mekanismer for mimulone (MML),
C
-geranylflavonoid isolert fra
Paulownia tomentosa
frukt, ble først belyst i denne studien. MML hindret celleproliferasjon i en dose- og tidsavhengig måte og utløses apoptose gjennom den ytre vei i A549 humane lunge adenokarsinomceller. Videre viste MML-behandlede celler autophagic funksjoner, for eksempel dannelse av autophagic vakuoler, en primær morfologiske trekk av autophagy, og akkumulering av mikrotubuli-assosiert protein en lettkjede 3 (LC3) puncta, en annen typisk skapt autophagy, som bestemmes av FITC-konjugert farging og monodansylcadaverine (MDC) farging, henholdsvis. Uttrykket nivåer av LC3-I og LC3-II, spesifikke markører for autofagi, ble også forsterket av MML behandling. Autophagy hemming av 3-metyladenin (3-MA), farmakologiske autofagi inhibitor, og shRNA knockdown av Beclin-en redusert apoptotisk celledød indusert av MML. Autophagic flux ble ikke signifikant påvirket av MML behandling og lysosomal inhibitor, klorokin (CQ) trykt MML-indusert autofagi og apoptose. MML-indusert autofagi ble fremmet av nedgang i p53 og p-mTOR nivåer og økning av p-AMPK. Videre inhibering av p53 transaktivering av pifithrin-α (PFT-α) og knockdown av p53 forbedret induksjon av autophagy og endelig fremmet apoptotisk celledød. Alt i alt viser resultatene viser at autofagi bidrar til cytotoksisiteten av MML i kreftceller som bærer villtype p53. Denne studien antyder sterkt at MML er en potensiell kandidat for et anticancermiddel rettet mot både autofagi og apoptotisk celledød i menneskelig lungekreft. Videre vil samtidig behandling av MML og p53-inhibitor være mer effektiv i human lunge-cancerterapi
relasjon:. En H-K, Kim K-S, Lee J-W, Park M-H, Moon H-I, Park S-J, et al. (2014) Mimulone-Induced Autophagy gjennom p53-mediert AMPK /mTOR Pathway Øker caspase-mediert celledød ved apoptose i A549 humane lungekreftceller. PLoS ONE 9 (12): e114607. doi: 10,1371 /journal.pone.0114607
Redaktør: Ilya Ulasov, Swedish Medical Center, USA
mottatt: 02.07.2014; Godkjent: 10 november 2014; Publisert: 09.12.2014
Copyright: © 2014 An et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den authors bekrefte at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Dong-A Universitetet forskningsfond. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lungekreft er den mest utbredte ondartet svulst som representerer en av de viktigste årsakene til global kreft-assosiert død og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) fanger opp nesten 85% av alle lungekrefttilfellene [1], [ ,,,0],2]. Til tross for betydelige fremskritt innen kreftbehandling lunge inkludert kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi, er prognosen for pasienter med lungekreft fortsatt dårlig, med mindre enn 15% av samlet 5-års overlevelse [1]. Spesielt, ved bruk av kjemoterapi platinaforbindelser eller platinabaserte kombinasjoner er den mest brukte cancerterapi lunge og er ansett for å være den optimale behandling hos pasienter med fremskreden fase NSCLC [2], [3]. Imidlertid er effektiviteten av kjemoterapi hos pasienter med fremskreden lungekreft svært begrenset, på grunn av resistens og toksiske bivirkninger av legemidler [2], [3]. Således er det viktig å utvikle mindre toksiske og mer effektive kjemoterapeutiske midler for behandling av avansert lungekreftpasienter.
I de senere år har plante-avledet av naturlige produkter fått omfattende oppmerksomhet som hovedkilder for nye legemidler for å redusere chemotherapy- tilhørende bivirkninger, og de utøver sine anticancer effekter ved å utløse apoptose og autofagi [4] – [7]. Nylige studier har vist at flere plante-avledet naturlige produkter, inkludert plumbagin [8], glossogin [9], curcumin [10], celastrol [11], isolinderalactone [12], glycyrrhizin [13], polydatin [14], 6- shogaol [15], glycyrrhetinsyre [16] og embelin [17], indusere apoptose gjennom den indre og /eller ytre vei og aktivering av p38 /JNK-reaksjonsveien i humane lungekreftceller. I tillegg, 6-shogaol forårsaket celledød gjennom autofagi induksjon ved hemming av AKT /mTOR-reaksjonsveien i humane NSCLC A549-celler [18] og paclitaxel og feroniellin A som utøves deres cytotoksiske virkninger ved å indusere både autophagy og apoptose i humane lungekreft A549 cellene [19], [20].
Paulownia tomentosa
Steud. (Scrophulariaceae) er løvtrær fordelt over hele Kina, Korea og Japan [21] og utdrag fra
P
.
tomentosa
har blitt brukt til å lindre bronkitt, astmaanfall og slim i tradisjonell kinesisk medisin [22]. Tidligere studier har vist at
C
-geranylated flavonoider, de viktigste bioaktive bestanddeler av
P. tomentosa
, har nervecellene effekter, antiradical og antibakterielle aktiviteter [23] – [26]. I tillegg
C
-geranylated flavanones fra
Paulownia tomentosa
frukt utstilt sterk cytotoksisk aktivitet i ulike humane kreftcellelinjer [27], [28]. Det har også nylig blitt rapportert at geranylated flavanon tomentodiplacone B direkte inhiberer celleproliferasjon ved nedregulering av cyclin-avhengige kinase 2-aktivitet, som fører til G1 fase akkumulering i THP-1 humane monocyttiske leukemiceller [29]. Men den underliggende mekanismen ansvarlig for antitumor aktivitet av geranylated flavonoider ikke godt belyst.
Vi har nylig isolert en forbindelse som hører til
C
-geranylated flavonoider, mimulone (MML), fra
Paulownia tomentosa
frukter. I denne studien, vi først undersøkte kreft effekter av MML på humane lungekreftceller og også avklares virkningsmekanismen. Vi viser her at MML utløser autofagi foregående apoptose i humane NSCLC-A549 celler, og autofagi hemming reduserer apoptose i MML-behandlede celler.
Materialer og metoder
Material
Monodansylcadaverine ( MDC), 4 «, 3-metyladenin (3-MA), klorokin (CQ), forbindelse C (forbindelse C) og 6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI) ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO , USA). Z-VAD-FMK (pan-kaspase-inhibitor), Z-DEVD-FMK (kaspase-3 inhibitor), Z-IETD-FMK (caspase-8-inhibitor) og Z-LEHD-FMK (caspase-9-inhibitor) ble oppnådd fra Calbiochem (EMD Biosciences, San Diego, CA, USA). 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), DAPI, puromycin-dihydroklorid og klorokin (CQ) ble oppløst i dH
2O. 3-MA (100 mM), poly-L-lysin (0,1%) og polybren (20 mg /ml) oppløst i fosfatbufret saltvann (PBS). Pifithrin-α (PFT-α), forbindelse C (forbindelse C) og MDC ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO). Antistoffer for ATG7, Beclin-en, LC3, caspase-3, caspase-8, caspase-9, Bud, p-p38, p38, p-AMPK-α, AMPK-α, p-ACC, ACC, p-mTOR, mTOR ble hentet fra Cell Signaling Technology (dansere, Mass, USA); antistoffer for PARP-1/2, p53 (DO-1), p-ERK og ERK ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA); antistoff for p62 /SQSTM1 ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA); antistoff for glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble oppnådd fra Millipore (Milford, MA, USA); Pepperrot (HRP) konjugert sekundære antistoffer ble kjøpt fra Cellesignalering Technology (dansere, Mass, USA) og Enzo Life Science (Farmingdale, NY, USA), henholdsvis; Fluoresceinisotiocyanat (FITC) -konjugert sekundært antistoff ble oppnådd fra Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA). Annexin V-FITC apoptose deteksjon kit og BCA protein assay kit ble kjøpt fra BD Biosciences (San Jose, CA, USA) og Thermo (Rockford, IL, USA), henholdsvis. MML (Fig. 1A) isolert fra
P. tomentosa
frukt ble fremstilt som beskrevet i tidligere rapport [25], oppløst i DMSO ved 40 mM for lager-konsentrasjon, og lagret ved -20 ° C.
(A) molekylstrukturen i mimulone. Forskjellige humane kreftceller, ikke-småcellet lungecancer A549 (B), brystcancer MCF7 (C), tykktarmskreft HCT116 (D) og osteosarkom U2OS (E) celler ble behandlet med MML som indikerte konsentrasjoner (0-80 uM) i 12 timer eller 24 timer, og deretter cellenes levedyktighet ble målt ved MTT-analyse. Stolpediagrammer som angir prosentandelen av levedyktighet. (F) A549-celler ble behandlet med MML ved forskjellige konsentrasjoner (0-80 uM) i 24 timer og levedyktige celler ble telt ved trypanblått-farving. Levende celler (ikke-fargede celler) ble beregnet ved hjelp av hemocytometer og søylediagram som viser prosentdelen av levedyktige celler. Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 og ** p. 0,01 sammenlignet med kontroll
Cellekulturer
Menneskelig ikke-småcellet lungekreft A549, menneskelig bryst adenokarsinom MCF-7, human kolorektal kreft HCT116 og humane osteosarkom U2OS cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; WelGENE Co., Daegu, Korea) inneholdende 10% (volum /volum) varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS) og 1% PSA (WelGENE Co., Daegu, Korea) hos 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 i luft.
celleviabilitet
for analyse av cellenes levedyktighet, MTT-analysen ble utført ved en fremgangsmåte lik den som er beskrevet tidligere [30]. I korthet ble cellene sådd ut i 24-brønns plate (5 x 10
4 celler /brønn) og dyrket i 24 timer. Cellene ble deretter behandlet med MML ved forskjellige konsentrasjoner (0-80 uM) i 24 timer eller behandlet med 60 pM av MML for forskjellige tidsforløp (0-24 h). Etter MML behandling, ble celler inkubert med medium /MTT (0,5 mg /ml) blanding i 3 timer. DMSO ble tilsatt for å oppløse formazanet redusert krystall fra MTT og absorbansen ble avlest ved 540 nm ved anvendelse av ELISA-plateleser (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). For å bekrefte virkningen av MML på celleproliferasjon, ble levende celler tellet ved trypanblått-farving i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk, ble A549-celler sådd ut i 12-brønners plate og behandlet med MML som indikerte konsentrasjoner i 24 timer. Etter behandling ble cellene høstet ved hjelp av trypsin-EDTA (WelGENE Co, Daegu, Sør-Korea) og farget med 0,4% trypan blå løsning (Gibco, Carlsbad, California). Levende celler ble tellet ved hemocytometer. Celleviabilitet ble vist i forhold til kontrollgruppen.
Protein utvinning og western blot analyse
Hel-celle protein ekstrakter fra A549 celler ble utarbeidet med en RIPA buffer (Pierce, Rockford, IL, USA) inneholder proteasehemmer mix (GE Healthcare, Piscataway, USA) og fosfatase inhibitor cocktail (Thermo, Rockford, IL, USA). Proteiner fra hel-cellelysater ble kvantifisert ved anvendelse av BCA proteinanalysesett i henhold til produsentens instruksjoner. Western blot-analyse ble utført som beskrevet tidligere [30]. Forbedret kjemiluminescens (ECL) deteksjonssystem (Amersham Bioscience, NJ, USA) ble anvendt for å detektere signalet og signalstyrken for detekterte proteinbånd ble målt ved bruk av Mitsubishi bilde Instrument (smart Co., Frederick, MD, USA). Lik lasting ble vurdert ved GAPDH som interne kontroller for Western blotting.
Immunocytochemistry
immunfluorescens farging ble utført av en lignende fremgangsmåte som tidligere beskrevet [30]. I korte trekk, A549-celler ble dyrket på sterile dekkglass og behandlet med MML i 24 timer og deretter fiksert med 3% paraformaldehyd (PFA) i 15 min ved 37 ° C. Deretter ble permeabiliseringen trinnet utført med avkjølt metanol (100%) i 10 minutter ved -20 ° C og deretter celler ble deretter inkubert i en blokkerende oppløsning inneholdende 5% bovint serumalbumin (BSA) og 1% Triton-X-100 i 1 h ved 37 ° C. Celler ble deretter inkubert med LC3 antistoff i 12 timer ved 4 ° C etterfulgt av FITC-konjugert sekundært antistoff i 1 time ved 37 ° C. Kjerner ble farget med DAPI (1 pg /ml) i 10 minutter ved 37 ° C. Fluorescens bilder ble tatt av LSM 700 konfokalt laser scanning mikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland).
MDC farving
MDC farging ble også utført ved en fremgangsmåte lik den som er beskrevet tidligere [30 ]. Celler ble fiksert med 3% PFA i 10 minutter ved 37 ° C, og deretter inkubert med 50 pM monodansylcadaverine (MDC), en autofluorescent forbindelse som etiketter autophagic vakuoler ved 37 ° C i 10 min. Fluorescent bilder ble tatt til fange av Olympus BX51 fluorescens mikroskop (Center Valley, PA, USA).
Annexin V og PI farging
Celler ble behandlet med så angitte konsentrasjoner av MML og /eller hemmere (caspase inhibitorer, 3-MA, PFT-α) i 24 timer og høstet ved hjelp av trypsin-EDTA. Etter farging med FITC-konjugert Annexin V og propidiumjodid (PI), ble apoptotiske celler målt ved hjelp av Beckman-Coulter Cytomics FC500 flowcytometer (Beckman-Coulter, Miami, FL, USA).
RNA interferens
pLKO.1 lentiviral ekspresjonsplasmid inneholdende shRNA mot Beclin-1 (TRCN0000033552) og p53 (TRCN0000003753), (Beclin-1, 5′-CCGGCTCAAGTTCATGCTGACGAATCTCGAGATTCGTCAGCATGAACTTGAGTTTTTG-3 «, p53, 5′-CCGGCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGTTTTT-3») ble anskaffet fra Sigma-Aldrich (Mission shRNA). Viruspartikler ble generert i 294T i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk ble celler transfektert med pLKO.1 shBeclin-1, VSVG og Gag vektorer. Viral suppe ble deretter injisert til A549-celle og inkubert i 12 timer. Virus-infiserte A549-celler ble selektert ved puromycin-dihydroklorid behandling og utvalgte celler ble anvendt for forsøkene. pLKO.1 shRNA kontroll vektor (Mission shRNA, SHC002) brukes som kontroll.
Statistisk analyse
Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige forsøk i hver gruppe. Forskjellene mellom hver grupper ble evaluert med Student
t
-test og * p 0,05 ble ansett for å vise statistisk signifikans
Resultater
Effekt av MML på celle levedyktighet. forskjellige humane kreftcellelinjer
for å vurdere virkningene av MML på cellevekst av forskjellige humane kreftcellelinjer, humane lungekreft A549 (fig. 1B), human brystcancer MCF-7 (fig. 1C), humane tykktarmskreft HCT116 (fig. 1D) og humant osteosarkom U2OS (fig. 1E) celler ble behandlet med MML ved forskjellige konsentrasjoner i 12 timer eller 24 timer, og deretter etterfulgt av MTT-analyser. MTT analyseresultatene viste at MML behandling signifikant hemmet celleproliferasjon i en dose- og tidsavhengig måte i disse kreftcellelinjer. For å undersøke effekten av MML på celleproliferasjon av A549-celler lenger, ble cellene behandlet med MML ved forskjellige konsentrasjoner i 24 timer og deretter underkastet trypanblått-farving. Resultatet viste en signifikant hemming av celleproliferasjon ved MML behandling på en doseavhengig måte (Fig. 1F).
MML utløser caspase-avhengig apoptose i A549 celler
For å avgjøre om MML- indusert cytotoksisitet i A549-celler skyldes apoptose etter behandling MML ved forskjellige konsentrasjoner i 24 timer eller 60 uM av MML behandling for forskjellige tidsperioder, apoptotisk populasjonen ble analysert ved hjelp av Annexin V /PI dobbel farging. Annexin V /pi-positive celler ble markert økt i en dose- og tidsavhengig måte (fig. 2A-C) som angir den apoptotiske virkning av MML på A549-celler. Flowcytometrisk analyse avslørte også at MML behandling økt akkumulering av celler ved den apoptotiske sub-G1 fase på en doseavhengig måte. Antall celler i G2 /M fase økes også på en doseavhengig måte (figur S1). For ytterligere å bekrefte virkningen av MML på induksjon av apoptose i A549-celler, ble caspase-3-aktivering og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) spalting undersøkt ved immunoblotting med deres antistoffer. Caspase-3, en nøkkel bøddel i den apoptotiske maskineri, spalter mange proteiner er uunnværlige for celleoverlevelse og aktiveres ved spalting i to fragmenter (17 kDa og 19 kDa) av caspase-8 og /eller caspase-9 i løpet av apoptose [31], [32]. Aktivert kaspase-3 deretter spalter cellulære proteiner, inkludert PARP, noe som fører til celledød ved apoptose. PARP spiller en viktig rolle i å opprettholde genomisk integritet og er den viktigste protein som skal proteolyserte av caspase-3 under apoptose [32]. Som vist på fig. 2D, caspase-3 og PARP-spaltinger ble utpreget økt etter 60 uM av MML behandling i 24 timer, noe som indikerer at MML indusert apoptose ved kaspase-3 aktivering og PARP-spaltning i A549-celler. Caspase-8 og caspase-9 spiller en avgjørende rolle i induksjon av apoptose via død reseptor-mediert (ytre) og mitokondrielle (iboende) veier, henholdsvis [31], [32]. Spalting av Bud er nødvendig for crosstalk mellom ytre og indre trasé [31], [32]. For å løse sti der MML induserer apoptose i A549 celler, ble proteininnholdet av caspase-8 og caspase-9 analysert av immunoblot analyse. Som vist på fig. 2D, MML behandling økte spaltede former (18 kDa og 43 kDa) av caspase-8, men det gjorde ikke utløse caspase-9 og Bud skillelinjer, noe som indikerer at MML indusert aktivering av caspase-8 i A549 celler. For ytterligere å bekrefte hvorvidt den MML-indusert apoptose var kaspase-avhengig, ble andelen av apoptotiske celler undersøkt ved Annexin V-PI dobbeltfarging etter en 24-timers behandling med forskjellige kaspase-inhibitorer så som Z-VAD-FMK (pan-kaspaseinhibitor ), Z-DEVD-FMK (caspase-3-hemmer), Z-IETD-FMK (caspase-8-hemmer) og Z-LEHD-FMK (caspase-9-hemmer). Som vist på fig. 2E, flowcytometrisk analyse viste at MML-indusert apoptose ble reddet av pan-kaspase-inhibitor, caspase-3 og kaspase-8 inhibitorer sammenlignet med MML behandling alene, men ikke av caspase-9-inhibitor. Et lignende resultat ble også oppnådd fra MTT-assay (fig. 2F). Tatt sammen tyder disse resultater på at MML-indusert apoptose drives primært av ytre vei heller enn indre vei.
(A) A549-celler ble behandlet med den MML som indikerte konsentrasjoner (0-60 uM) i 24 timer og deretter farget med FITC- konjugert Annexin V og PI. Apoptotiske celler ble målt ved flow-cytometer. (B) A549-celler ble behandlet med 60 pM av MML for en tidsavhengig måte. Apoptotiske celler ble deretter farget med Annexin V og PI og detektert ved hjelp av flow cytometer. (C) Bar diagram viser prosentandelen av apoptotiske celler (dose-avhengig måte, topp, tidsavhengig måte; bunn). Apoptotisk befolkningen ble evaluert av Annexin V positive, PI negative (AV + /PI-, hvit bar) og Annexin V og PI dobbel positiv (AV + /PI +, svart strek) apoptotiske celler. (D) Cellene ble behandlet med den MML som indikerte konsentrasjoner (0-60 uM) i 24 timer og Western blot-analyse ble utført for å kontrollere apoptose markør, caspase-3, -8, -9, By og PARP-1/2, henholdsvis. GAPDH ble brukt som lasting kontroll av Western blot analyse. (E) Celler ble forbehandlet med eller uten hver kaspase-inhibitor, Z-VAD-FMK (30 uM), Z-DEVD-FMK (30 uM), Z-IETD-FMK (30 uM) og Z-LEHD-FMK (30 pM) i 1 time og deretter behandlet med MML (60 uM) i 24 timer. Apoptotiske celler ble farget med Annexin V og PI og deretter populasjoner ble påvist ved strømningscytometer. (F) Celler ble behandlet med kaspaseinhibitorer og MML under de samme betingelser som flowcytometrisk analyse, og deretter cellenes levedyktighet ble målt ved MTT-analyse. Stolpediagrammer som angir prosentandelen av cellenes levedyktighet (øverst) og andelen av apoptotiske celler (nederste), respektivt. Apoptotisk befolkningen ble evaluert av Annexin V positive, PI negative (AV + /PI-, hvit bar) og Annexin V og PI dobbel positiv (AV + /PI +, svart strek) apoptotiske celler. Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 og ** p 0,01 sammenlignet med kontroll;
# p. 0,05 sammenlignet med MML-behandlede gruppen
MML utløser autofagi i A549 celler
Plant-avledet naturlige forbindelser er kjent for å utøve sin kreft effekter ved å fremkalle autofagi i humane kreftceller [7]. Autophagy er en katabolsk prosess danner dobbel-membran vesikler, betegnes autophagosomes [33]. For å undersøke om MML utløser autofagi i A549 cellene ble morfologiske endringer etter MML behandling sjekket. Som vist på fig. 3A, omfattende cytoplasma vacuolization og formasjoner av autophagosome liknende vakuoler i MML-behandlede A549 celler ble observert under fasekontrastmikroskop. For å bekrefte autofagi induksjon av MML, MDC farging og mikrotubulus-assosiert protein en lettkjede 3 (LC3) immunfarging ved hjelp av fluorescerende antistoffer mot LC3 ble utført. MDC og LC3 er kjent som spesifikke markører for autophagic vakuoler og autophagosomes, henholdsvis, og puncta dannelse av LC3 inn i autophagosome kan observeres ved konfokal mikroskopi, som er brukt mye som pålitelig metode er i stand til å detektere autophagy [33]. Som vist på fig. 3A, MML-ubehandlede kontrollceller viste diffust MDC-flekker, mens MML-behandlede A549 celler resulterte i en økning av fluorescens intensitet som indikerer omfattende MDC-positive autophagic vakuoler. Videre er økt subcellulære lokalisering av punktformet LC3 ble også påvist i MML-behandlede A549-celler sammenlignet med ubehandlede kontrollceller og LC3 puncta dannelse ble økt i en tidsavhengig måte (fig. 3B). For ytterligere å klarlegge autophagosome formasjonen i MML-behandlede celler, endringene i de tre store Autophagy messige markører, LC3-II, Beclin-1 og ATG7, ble analysert ved immunblotting. ATG7 og LC3-II-proteinnivåer ble merkbart øket på en doseavhengig måte ved MML behandling, men Beclin-1-nivå er litt utvidet (fig. 3C). Sammen utgjør disse dataene viser definitivt at MML induserer autophagosome dannelse i A549-celler.
(A) A549-celler ble behandlet med 60 pM av MML i 24 timer og deretter morfologiske bilder ble tatt av fasekontrastmikroskop (400 x, PC). Pilene viser de endogene autophagosome liknende vakuoler (til venstre) og søylediagrammet viser antall vakuoler per celle. Celler ble behandlet med MML (60 pM, 24 h) og deretter ble cellene farget med henholdsvis MDC og LC3 antistoff,. MDC (lyse farger, midten) Bildene ble tatt av fluorescens mikroskop og LC3 (grønn, høyre) fluorescerende bildene ble oppdaget av konfokal mikroskop (bar; 10 mikrometer). Stolpediagrammet viser fluorescens intensiteten av LC3 FITC. (B) Celler ble behandlet med MML (60 uM) for forskjellige tidsperioder (0-24 h) og LC3 immunofluorescens farging ble utført for å påvise autophagosomes. Kjerner ble farget med DAPI. Bilder ble tatt med konfokal mikroskop (bar; 10 mikrometer). (C) A549-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av MML (0-60 uM) i 24 timer. Western blot-analyser ble deretter utført med antistoffer mot ATG7, Beclin-1 og LC3, respektivt. GAPDH ble brukt som lasting kontroll. Søylediagram indikerer densitometry analyse av LC3-II /GAPDH forholdet. A549-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av MML (0-60 uM) i 24 timer (D) eller 60 pM av MML for de forskjellige tidsforløpet (E) og deretter immunoblot analyse ble utført ved anvendelse av antistoffer mot p62 og LC3, respektivt. GAPDH ble brukt som lasting kontroll. (F) A549 celler ble preinkubert med eller uten klorokin (CQ, 25 pM) i 1 time, deretter behandlet med MML (60 uM) i 24 timer. Western blot-analyse ble utført ved anvendelse av antistoffer som angitt ovenfor. GAPDH ble brukt som lasting kontroll av Western blotting. Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 og ** p. 0,01 sammenlignet med kontroll
Det er kjent at autophagosomes også akkumuleres når autophagic flux indikerer hele prosessen med autofagi er ineffektiv [35], [46]. For å evaluere hvorvidt MML påvirker autophagic fluksen i A549-celler, ble nivået av p62-proteinet som er brukt til å overvåke autophagic fluks [35], [46] undersøkt ved immunoblotting med sin antistoff. Som vist på fig. 3D og 3E, den p62 nivået ble markert redusert med MML behandling i en dose- og tidsavhengig måte. Dessuten, for å vurdere effektene av MML på autophagic vesikkel omsetning, ble protein nivåene av p62 og LC3 II kontrolleres ved immunoblotting etter en 24-timers behandling med klorokin (CQ), kjent som lysosomal degradering inhibitor. Som vist på fig. 3F, forbehandling med CK betydelig økte nivåer av p62 og LC3 II sammenlignet med MML behandling alene. Disse resultatene tyder klart på at MML behandling ikke forstyrre autophagic vesikkel omsetning. Sammen er disse resultatene sikkert indikerer at MML indusert autofagi uten svekkelse av autophagic forandring i A549 celler.
Hemming av autofagi av autofagi hemmer eller knockdown av Beclin-en undertrykker MML-mediert apoptotisk celledød
det har nylig blitt dokumentert at autophagy hemming av en spesifikk autophagy inhibitor, for eksempel 3-metyladenin (3-MA), kan fremme apoptose i humane kreftceller [35] – [38]. Således undersøkte vi effekten av 3-MA på dannelsen av LC3 puncta og autophagic vakuoler i MML-behandlede A549-celler. Den punktformet LC3 fordeling og dannelse av MDC-positive autophagosomes i MML-induserte celler ble merkbart undertrykket ved 3-MA behandling (Fig. 4A). I tillegg er det samtidig behandling med MML og 3-MA signifikant hemmet ikke bare LC3-II akkumulering men også caspase-3 og PARP-spaltinger (Fig. 4B). Deretter sjekket vi effekten av 3-MA på den apoptose-induksjon ved hjelp av Annexin V /PI dobbel farging. Annexin V /pi-positive celler ble markert redusert i celler ko-behandlet med MML og 3-MA, sammenlignet med de som ble behandlet med MML alene (Fig. 4C). Lignende resultater ble oppnådd ved ko-behandling av MML med CQ (fig. 4D). Disse resultatene viser at tydeligvis autofagi inhibering av 3-MA og CQ kunne undertrykke MML-indusert apoptose i A549-celler.
(A), A549-celler ble preinkubert med eller uten 3-MA (10 mM) for tre h og deretter inkubert med MML (60 uM) i 24 timer. Cellene ble farget med MDC (lys farge) eller LC3 (grønn) antistoff, henholdsvis. Kjerner ble farget med DAPI (blå). Fluorescent bilder ble oppnådd ved bruk av konfokal mikroskop (bar; 10 mikrometer). (B) Celler ble forbehandlet med eller uten 3-MA i 3 timer før behandling av MML (60 uM) i 24 timer. Western blot-analyse ble utført med antistoffer mot LC3, henholdsvis PARP-1/2 og caspase-3,. GAPDH ble brukt som lasting kontroll. Stolpediagrammer som viser forholdet mellom spaltede caspase-3 /GAPDH og LC3-II /GAPDH, respektivt. (C) A549-celler ble forbehandlet i 3 timer med eller uten 3-MA og behandlet med MML (60 uM) i 24 timer og cellene ble farget med FITC-konjugert Annexin V /PI og deretter målt ved FACS. Stolpediagrammet viser prosentandelen av apoptotiske celler. Andel apoptotiske celler ble evaluert av Annexin V positive og PI negative (AV + /PI-, hvit bar) og Annexin V og PI dobbel positiv (AV + /PI +, svart strek) apoptotiske celler. (D) Celler ble forbehandlet med eller uten CQ i 1 time og deretter inkubert med MML i 24 timer. Immunoblotting analyse ble utført ved anvendelse av antistoffer som er angitt tidligere. Celler ble behandlet med CK og MML under de samme betingelser som nevnt før, og deretter ble cellelevedyktigheten evaluert ved MTT-assay (nederst). Stolpediagrammet viser prosentandelen av cellenes levedyktighet. Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 og ** p 0,01 sammenlignet med kontroll;
# p. 0,05 sammenlignet med MML-behandlede gruppen
Mer spesifikk hemming av autofagi veien kan oppnås ved knockout eller knockdown av autofagi relaterte (
ATG
) gener og
Beclin-en
genet. For ytterligere å bekrefte om autofagi kan regulere apoptose, Beclin-en, en kritisk regulator av autofagi, ble slått ned ved hjelp av små hårnål RNA (shRNA) og deretter endringer av endogene autophagosomes ble sjekket av LC3 farging. Som vist på fig. 5A blir endogent LC3 distribusjon markant redusert i MML-behandlede Beclin-en knockdown celler (shBeclin-1) sammenlignet med MML-behandlede shControl celler. Dessuten, som vist i fig. 5B, knockdown av
Beclin-en
genet markert trykt Beclin-1 protein uttrykk og akkumulering av LC3-II i forhold til shControl. I samsvar med resultatene ved anvendelse av 3-MA og CQ, caspase-3 og PARP-spaltinger ble også hemmet signifikant ved undertrykkelse av autophagy gjennom knockdown av
Beclin-1
genet. MTT-assay-resultatet viser også at den cytotoksiske effekt av MML ble signifikant redusert ved knockdown av
Beclin-1
-genet (fig. 5C). Samlet utgjør disse resultatene viser tydelig at autofagi hemming av 3-MA og CQ eller Beclin-en knockdown forhindret MML-indusert apoptose i A549 celler.
(A) Kontroll og Beclin-1 knockdown celler ble behandlet med MML (60 uM) i 24 timer og deretter LC3 immunofluorescens-farging ble gjennomført for å detektere autophagosomes. Kjerner ble farget med DAPI. Bilder ble tatt til fange av konfokal mikroskop (bar; 10 mikrometer). (B) knockdown-celler (shControl, shBeclin-1) ble behandlet med MML (60 uM) i 24 timer. Western blot-analyse ble utført med antistoffer mot Beclin-1, LC3, henholdsvis PARP-1/2 og caspase-3,. GAPDH ble brukt som lasting kontroll. Stolpediagrammer som viser forholdet mellom LC3-II /GAPDH og spaltet caspase-3 /GAPDH, respektivt. (C) Kontroll og Beclin-1 knockdown-celler ble behandlet med MML (60 uM) i 24 timer og deretter cellenes levedyktighet ble målt ved MTT-analyse. Søylediagram som viser prosent cellelevedyktighet. Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 og ** p 0,01 sammenlignet med kontroll;
# p. 0,05 sammenlignet med MML-behandlede gruppen
MML induserer autofagi gjennom reduksjon i p53 nivåer
Det har nylig blitt rapportert at p53 spiller en avgjørende rolle i regulering av autophagy [39] – [41]. For å undersøke hvorvidt p53 er involvert i MML-mediert autophagy, og dermed nivåene av p53 og LC3-II-proteinet ble undersøkt ved immunblotting. Som vist på fig. 6A, MML behandling bemerkelsesverdig redusert p53-nivåer sammenlignet med ubehandlede kontrollceller, men øket LC3-II. I tillegg ble kaspase-3 og PARP-spaltinger også økt med MML behandling. Videre LC3-II og spaltet kaspase-3 og PARP-nivåene var signifikant øket i celler ko-behandlet med MML og pifithrin-α (PFT-α), et farmakologisk p53 inhibitor, sammenlignet med de som ble behandlet med MML eller PFT-α alene . Disse resultatene indikerer klart at reduksjon i p53-nivåer ved MML kunne øke induksjon av apoptose i autophagy og A549-celler som villtype p53. For å bekrefte rollen p53 i MML-indusert autofagi videre, ble autophagosomes undersøkt av LC3 farging. Som vist på fig. 6B, en signifikant akkumulering av LC3 puncta ble observert i celler ko-behandlet med MML og PFT-α, noe som indikerer augmentasjonen av autophagy induksjon av p53 tap. I tillegg er den prosentandel av Annexin V /pi-positive celler var omtrent 10% høyere i celler ko-behandlet med MML og PFT-α enn de som ble behandlet med MML alene (Fig. 6C). Som vist på fig. Som vist på fig. Som vist på fig.
