Abstract
Nikotin utøver sin onkogene effekter gjennom binding til nikotin acetylkolin (nAChR? ) og aktivering av nedstrøms reaksjonsveier som blokkerer apoptose og fremmer neo-angiogenese. De nAChR-er av den α7 undertype er tilstede på en rekke forskjellige kreftceller og deres hemming av Cobra venom nevrotoksiner er blitt foreslått i en rekke artikler og vurderinger som en potensiell innovativ lungecancerterapi. Men siden en del av de publiserte resultatene ble nylig tilbaketrukne, tror vi at den antitumor aktivitet av cobra gift neurotoxins må være uavhengig revurdert.
Vi bestemte aktiviteten av a-neurotoxins fra
Naja atra product: (kortkjedede neurotoxin, α-cobrotoxin) og
Naja kaouthia plakater (langkjedede neurotoxin, α-cobratoxin)
in vitro
av cytotoksiske målinger i fem lunge kreft cellelinjer, av kolonidannelse analysen med α7nAChRs uttrykker og ikke-uttrykker cellelinjer og
in vivo
ved å vurdere tumorvekst i en orthotopic ikke-overvektige diabetikere /alvorlig kombinert immunsvikt (
NOD /SCID
) musemodell system som anvender forskjellige behandlingsskjemaer og doseringer.
ble ikke observert noen statistisk signifikant reduksjon av tumorvekst i behandlingsarmene i forhold til kontroll for begge giftstoffer. Paradoksalt α-cobrotoxin fra
Naja atra
viste en tendens til å øke tumorvekst, men selv i dette tilfelle ble den statistiske signifikans ikke nådd.
I konklusjonen våre resultater viser at, i motsetning andre rapporter, nAChR hemmere α-cobratoxin fra
N. kaouthia Hotell og α-cobrotoxin fra
N. atra
verken undertrykte tumorvekst eller forlenget overlevelse av de behandlede dyrene
Citation. Alama A, Bruzzo C, Cavalieri Z, Forlani A, Utkin Y, Casciano jeg, et al. (2011) Hemming av Nikotin Acetylkolin reseptorer av Cobra Venom α-neurotoxins: Er det et perspektiv i Lung Cancer Treatment? PLoS ONE seks (6): e20695. doi: 10,1371 /journal.pone.0020695
Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong
mottatt: 10 desember 2010; Godkjent: 07.05.2011; Publisert: 13 juni 2011
Copyright: © 2011 Alama et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding var gitt av det italienske helsedepartementet (www.salute.gov.it/) og Fondazione Compagnia di San Paolo, Torino (www.compagniadisanpaolo.it/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
de eksperimentelle bevis som tyder på at stimulerende eller hemmende nevrotransmisjonen er involvert i kreftutvikling, progresjon og i respons på behandling har stadig akkumulert [1]. Faktisk, tobakk komponenter regulere cellulære funksjoner relatert til celle transformasjon og er involvert med røyking avhengighet og lungekreft predisposisjon og utvikling av direkte interaksjon med nevronale og ikke-nevronale nikotin acetylkolin (nAChR) [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]. Nikotin i seg selv har begrenset lungekreft initiere evner, men kan opprettholde tumorvekst og fremme metastatisk spredning gjennom sine antiapoptotic og neoangiogenic egenskaper [2], [7], [12].
uttrykk for nAChR i ikke-nevrale celler i lungene, og spesielt i luftveienes epitel, gjenspeiler de flere vesentlige funksjoner som utøves av det kolinerge system i normal lunge utvikling og funksjon [13], [14]. I dette henseende er det blitt foreslått at rollen av nAChR-er i lungekreft kan være lik den til østrogen reseptorer i brystkreft siden i begge tilfeller upassende stimulering av reseptorer bidrar til utvikling av kreft [15]. I betraktning av det høye nivået av ekspresjon av bestemte undertyper av nAChR-er i lungekreftceller i forhold til det omgivende upåvirket vev [16], [17] og av støtte eksperimentelle bevis [18], [19], [20], [21] , ble det antatt at antagonister av nAChR-er, og spesielt cobra a-nervegifter, kan utnyttes som potensielle terapeutiske midler [22], [23], [24]. Men den begrensede kunnskap om funksjonalitet og av de langsiktige effektene av stimulering av disse reseptorene i kreftceller [2], [25], [26] og, viktigst, den nylige tilbaketrekkingen av en rapport som støtter antitumoreffekter cobra α-neurotoxins
in vitro Hotell og
in vivo product: [27] gjengir tvilsom målretting av nAChR med disse giftstoffene for lungekreft behandling.
Cobra gift utgjøres av mange polypeptider med flere giftige aktiviteter. Blant disse, de tre-fingret toksiner (TFTer) er de viktigste komponentene og er representert ved a-nervegifter og cytotoxins. A-nevrotoksiner binde til nAChR med forskjellig spesifisitet og affinitet: kortkjedede toksiner (60-62 aminosyrerester, 4-disulfid-broer) blokk muskel-type nAChR-er, mens langkjedede toksiner (66-75 aminosyrerester, 5 disulfidbindinger den femte bindingen er til stede i den sentrale polypeptidet loop) i tillegg til muskel-type nAChR-blokkere også de neuronale reseptorer [28], [29]. Som et eksempel på kortkjedede giftstoffer, α-neurotoxin kalles α-cobr * o * toksin fra
Naja atra
cobra venom kan nevnes. Rektor α-neurotoxin fra
Naja kaouthia
cobra venom kalt α-cobr * en * toksin er et eksempel på langkjedede giftstoffer. De kortkjedede toksiner er strukturelt relatert til cytotoxins at ikke-selektivt drepe celler [30].
Under gjennomgangen av litteraturen på anti-tumor effekter av α-cobratoxin [18], [19], [20], [21], [22], [27] innså at de rapporter gav store forskjeller i doseringen av toksinet anvendes for
in vivo
forsøk på antall injiserte celler og på mus overlevelse. Også tilstedeværelsen av α7 nAChR på cellelinjen som anvendes for in vivo-studiene var usikker ettersom motstridende resultater er til stede i litteraturen [22], [31]. Videre, ettersom en del av dataene ble trukket tilbake uten noen bestemt motivasjon [27], følte vi behov for å revurdere de anti-kreft egenskaper cobra neurotoxins
in vitro Hotell og
in vivo
i en klinisk relevant dyremodell for lungekreft [18] for å avklare om disse toksiner kan anses som prototype av en ny klasse av naturlige produkter med antitumoregenskaper som foreslått [15], [22], [24].
Resultater og diskusjon
Expression of α7 nAChR i A549 og A549-luc celler
samspillet mellom α-cobratoxin og α7 nikotinreseptoren [32] var en av de eksperimentelle bevis bak begrunnelsen å utnytte cobra gift giftstoffer som legemidler mot kreft [22]. Selv om denne reseptoren uttrykt på et bredt spekter av vev og cellelinjer, en nylig undersøkelse av litteraturen [22], [31] rapporterte motstridende data på ekspresjon av denne reseptoren i A549, cellelinjen som benyttes for de
i vivo
og det meste av
in vitro
kreft analyser på α-cobratoxin. Derfor, som et første skritt for å kontrollere aktiviteten til α-cobratoxin i NSCLC, utførte vi en semikvantitativ RT-PCR og qPCR undersøkelse for å demonstrere uttrykk for α7 nAChR i fem lunge kreft cellelinjer. Tre av cellelinjene anvendt i denne studien (A549, H1650 og 1 SK-MES) var den samme for den opprinnelige sett av eksperimenter [18], [19], [20], [27]. Som vist i Figur 1, Panel A, α7 nikotinreseptoren var lett detekterbar i A549, H1650 og SK-MES-1, men ikke i H1975 og Calu 1. Den qPCR-analyse bekreftet tilstedeværelsen av forskjellig mengde av den α7 nAChR mRNA i A549, H1650 og SK-MES 1 (Figur 1, Panel B). I overensstemmelse med RT-PCR-resultater, i H1975 og Calu 1 den α7 nAChR transkripsjon ved å bruke den samme mengde av cDNA benyttes for alle cellelinjer, først etter syklus 40, et resultat som kunne tilskrives enten til et ekstremt lavt nivå av uttrykk eller for bakgrunnsstøy
A) semikvantitativ alpha7 RT-PCR-analyse on human NSCLC adenokarsinom e plateepitelkarsinom cellelinjer. GAPDH uttrykket ble brukt som intern kontroll for mRNA integritet og cDNA kvantifisering. NCI-H1975 og Calu1 er negative. C: Ingen mal kontroll. B) qPCR a-7 uttrykk i de samme cellelinjer. På y-aksen naturlig logaritm (ln) av ganger endring. NCI-H1650 ble brukt som kalibrator, GAPDH som referanse genet. Ett av UGR Totalt RNA ble retrotrascibed og den samme mengde av cDNA per prøve (2 ul) ble anvendt (Ct GAPDH svis mellom 15,65 og 17,65). NCI-H1975 og Calu1 resulterte negativ eller med ekstremt lav uttrykk på grunn av Ct 40. C) Western blot-analyse for alfa 7. PC12 ble applisert som positiv kontroll. Actin uttrykket ble brukt som intern kontroll.
uttrykk for α7 nAChR på proteinnivå ble bekreftet av western blot analyse i A549 og A549-luc celler (Figur 1, Panel C).
det er blitt rapportert at stimulering av α7 nAChR i humane lungekreftceller fører til oppregulering av denne reseptor [33]. Vi har testet påvirkning av a-neurotoxins fra
N. atra Hotell og
N.kaouthia
på nivået av α7 nAChR fokus på A549 og A549-Luc.
qPCR analyse viste at behandling med enten α-cobrotoxin eller α-cobratoxin ved en konsentrasjon på 0,003 uM, det rapportert IC
50 for α-cobratoxin i A549 [20], sammen med konsentrasjoner tre ganger lavere (0,001 uM) og tre ganger høyere (0,009 uM), ikke vesentlig endre nivået av uttrykk av reseptoren i disse cellelinjer (mindre enn to ganger endring, figur S1).
in vitro effekter av kort og lang kjede a-nervegifter på NSCLC cellelinjer
Tidlig
in vitro
eksperimenter antyder at effekten av α-cobratoxin er doseavhengig og at den høye selektivitet og spesifisitet av dette molekylet avhenger av tettheten av α7 nAChR [20], [21]. I denne henseende ikke-tumorale pulmonære celler, så vel som andre primære upåvirket celler som uttrykker lave nivåer av α7 reseptorer var bemerkelsesverdig motstandsdyktig overfor a-cobratoxin behandling [20].
For å evaluere den cytotoksiske aktivitet av α-cobratoxin, som binder effektivt til α7 nAChR (se Materialer og metoder) og spesifisitet og selektivitet av sin handling, vi utført MTT analyser med kort og lang kjede a-nervegifter på antagelig sensitiv α7 nAChR-positive og antagelig motstandsdyktig α7 nAChR-negative cellelinjer. Dose-responskurver ble trukket for å vurdere medikamentkonsentrasjon reduserende overlevelse. De første cytotoksiske Forsøkene ble utført anvendelse av giftstoffer konsentrasjoner som i andre publikasjoner, ble rapportert å være effektiv i α7 nAChR-positive NSCLC cellelinjer, men ikke toksisk i normale celler (IC50: 0,003 uM til A549, 0,04 uM for SK-MES-1, og 1 uM for H1650) [18], [20], [21], [22]. Men ved disse konsentrasjonene vi ikke kunne oppdage vesentlig cytotoksisk aktivitet og IC50 kan ikke nås med en hvilken som helst av de to toksiner (data ikke vist).
Ved høyere konsentrasjoner (opp til 30 uM) i α-cobrotoxin viste en begrenset doseavhengige toksisitet non som forble i det vesentlige konstant i et bredt område av konsentrasjoner i alle fem cellelinjer (figur 2, felt A).
NSCLC cellelinjer A549, NCI-H1975, H1650, Calu 1 og SK-MES-1 ble inkubert i 72 timer med α-cobrotoxin (0,6 til 30 pM), øvre panel, eller α-cobratoxin (0,75 til 50 pM), nedre panel, og toksisiteten ble målt ved kolorimetrisk MTT-test. IC50 ble bare kommet med α-cobratoxin.
Ved høye konsentrasjoner av α-cobratoxin viste en doseavhengig toksisitet (figur 2, Panel B) klar. Men IC50-konsentrasjon observert i vårt studium for A549 og SK-MES-1 var 2466 og 105 ganger høyere enn det som er rapportert i en tidligere publikasjon [20]. Forskjellen var mye lavere for H1650 (2,9 ganger) et resultat er kompatibel med anvendelse av et annet toksin preparat.
begrensede toksiske virkningen av den kortkjedet α-cobrotoxin kunne forklares ved dens manglende evne til å binde seg til α7 reseptoren. Overraskende imidlertid α-cobratoxin var effektiv også på α7 nAChR-negative celler som tyder på at den giftige aktiviteten ikke er mediert av binding av toksinet til α7 reseptoren.
For å bekrefte og utvide denne observasjonen vi har gjennomført en kolonidannelse analysen med den α7 nAChR + A549, og med de α7 nAChR-NCI-H1975 cellelinjer. Siden IC50 ikke ble nådd med α-cobrotoxin, benyttet vi de to høyeste konsentrasjonene testet av MTT (15 og 30 mm). For α-cobratoxin benyttet vi konsentrasjoner svarende til IC50 for A549 og NCI-H1975 (henholdsvis 7. 5 og 3 uM) og konsentrasjoner svarende til halvparten og det dobbelte av IC50. Som vist i figur 3, ble den klonogene aktiviteten av de to cellelinjene ikke påvirket av behandling, og ved tilstedeværelsen av α7 nach reseptoren.
A549 cellelinjer (α7 AChR +) og NCI-H1975 ( α7 AChR -) ble sådd i 35 mm petriskåler eller i 24 brønner plater med en tetthet på 150 (A549) og 300 (NCI-H1975) celler /parabol og utsatt for enten langkjedede α-neurotoxin fra
Naja Kaouthia
, ved konsentrasjoner på 15 uM, 7,5 uM, 3,8 uM (A549) og 6 uM, 3 uM, 1,5 uM (NCI-H1975), eller kortkjedede fra
Naja Atra
, ved konsentrasjoner på 30 uM og 15 uM (begge cellelinjer). Behandlede celler ble deretter inkubert i 7-10 dager, inntil synlige kolonier dannet.
Aktiveringen av den apoptotiske kaskade ble betraktet som de viktigste effekten av bindingen av de α-cobratoxin til α7 nAChR [18 ], [20], [21], [22]. I betraktning av de store forskjeller mellom våre resultater og de som tidligere er publisert med hensyn til dosering ved hvilken IC50 kunne oppnås og fravær av selektive virkning av α-cobratoxin på α7 nAChR-positive celler, prøvde vi å forstå hvis aktivering av apoptose faktisk opptrer ved behandling med α-cobratoxin av Annexin V-PI flowcytometri farging. Det ble rapportert at den maksimale induksjon av apoptose i A549-celler kan oppnås ved behandling med 1 mM toksin i 24 timer [18]. Vi har gjentatt den samme eksperiment anvendelse av samme metode, men med giftkonsentrasjoner (1, 10 og 50 uM) som induserte vekst inibition i området fra 5 til 87% i MTT-analyser.
Som vist i Figur 4, selv ved den høyeste konsentrasjonen meget få celler (1-3%) presenterte tegn på apoptose med nekrotiske celler blir utbredt.
celler ble inkubert i 24 timer med 1, 10 og 50 uM α-cobratoxin og apoptose ble evaluert ved Annexin V-PI farging og FACS separasjon. Apoptose i ubehandlede celler var 0,63% og i behandlede celler var i størrelsesorden 0,98 til 2,32%.
Samlet antyder disse resultatene at celledød observert in vitro er sannsynligvis et resultat av nekrose i stedet for aktivering av den apoptotiske reaksjonsvei etter den spesifikke binding av α-cobratoxin til sin ligand.
In vivo
toksisitet av a-nevrotoksiner
den akutte toksisitet av økende doser av giftstoffer etter iv administrering (som i M M) ble undersøkt i CD1 mus på grunnlag av kliniske og atferdsmessige tegn. Akutte symptomer utviklet i løpet av 15 minutter etter injeksjonen, og ble stort sett preget av generelt ubehag og åndenød at restaurert til normale forhold i 60-180 minutter. Basert på antallet døde CD1 mus, etter administrering av enten α-cobrotoxin eller α-cobratoxin og i løpet av en observasjonsperiode på 14 dager, ble LD-verdier bestemt og MTD identifisert som 0,1 mg /kg for α-cobrotoxin og 0,2 mg /kg for α-cobratoxin som vist i tabell 1.
viktigere, LD50 for α-cobrotoxin bestemt i vår studie (0,128 mg /kg) var i meget god overensstemmelse med litteraturdata (0,1 mg /kg: https://www.uniprot.org/uniprot/P60770). Den observerte LD50 for α-cobratoxin var 0,35 mg /kg, en verdi i samme størrelsesorden av litteraturdata (0,1 mg /kg; https://www.uniprot.org/uniprot/P01391).
rapporter om in vivo toksisitet av α-cobratoxin er forvirrende og i den senere litteratur har vi observert at LD50 konsentrasjonen rapportert i tre forskjellige publikasjoner fra den samme gruppe er forskjellig på 1000 ganger (0,15 mg /kg eller 0,15 ug /kg ) [18], [21], [22]. Resultatene oppnådd i denne studien resultatene er i hovedsak i samsvar med de av to av de tidligere rapportene [18], [21], og enda viktigere, viser den biologiske aktiviteten
in vivo
av våre giftpreparater.
Halvparten av MTD for hvert toksin (0,05 og 0,1 mg /kg, henholdsvis) ble deretter anvendt i en av de to behandlingsprotokoller konstruert for å vurdere antitumoraktivitet in vivo av disse giftstoffene.
Antitumoraktivitet aktivitet~~POS=HEADCOMP av a-neurotoxins
for å vurdere antitumor aktivitet av både toksiner,
NOD /SCID
mus ble orthotopically transplantert med 0,5 × 10
6 menneskelige A549-Luc celler /i et volum på 10 mL PBS inn i høyre lunge. Som surrogatmarkør av tumorvekst vi målte lyset utslipp av luciferase-merket A549 celler; dette systemet gjorde oss i stand til lengderetningen følge hvert dyr og for å overvåke effekten av behandlingen.
Etter vurdering av tumor implantater, ved IVIS deteksjon, musene ble randomisert til en av de studiegrupper og behandling startet 7 dager etter ortotopisk transplantasjon i henhold til de to forskjellige protokoller som er skissert i Figur 5.
Mus ble injisert med 0,5 x 10
6 humane A549-luc-celler. På dag 7, etter den IVIS bestemmelse, ble dyrene randomisert og underkastes behandling. For plan 1 ble musene behandlet med 1/1000 av LD10 som er angitt i [20] tre ganger /uke i tre uker. For timeplan to musene ble behandlet en gang i uken med en dose som tilsvarer ½ MTD (bestemt i denne studien)
Protocol. 1: 8 dyr ble tildelt motta i.v. 0,12 ug /kg av toksin (1/1000 av den LD
10 angitt i [20]), tre ganger i uken i tre uker i henhold til en tidligere rapportert plan [20] og 8 dyr mottok bærer alene.
protokoll 2: 8 dyr ble behandlet iv en gang i uken i tre uker med fra 0,05 mg /kg av α-cobrotoxin eller 0,1 mg /kg av α-cobratoxin (svarende til halv-MTD). For α-cobratoxin halv MTD svarer til 12,8 uM, en konsentrasjon som
in vitro
skal drepe mellom 50 og 63% av A549-celler. Åtte kontrolldyr mottok bærer alene.
I en annen publikasjon [18] hvor tidsskjema av fremgangsmåte 1 ble anvendt, den rapporterte α-cobratoxin dose var 0,12 mg /kg. På grunnlag av vår
in vivo
toksisitet besluttsomhet vi vurderte denne dosen er for høy til å bli administrert i tre dager til mus med nedsatt lungefunksjon.
Etter en innledende vurdering av tumorvekst i dag 7, antitumoraktivitet indusert av giftstoffer ble evaluert i behandlede og ubehandlede mus på dag 14, 21 og 28 etter administrering i begge protokollene. Vi har observert at ved de innledende stadier av vekst, bioluminiscence av dyrene tett representerer graden av tumorvekst. Omvendt, ved senere trinn, tumor nekrose og redusert perfusjon, sannsynligvis redusert lysutskillelse hos mus, selv når svulsten hadde helt invadert brysthule, og i de fleste tilfeller hadde utvidet utenfor thorax.
pre- behandling IVIS evaluering av de 56 mus inkludert i studien på dag 7 viste vellykket tumorvekst i alle dyr på tross av en 300-fold individuell variasjon (gjennomsnittlig foton emisjon: 5,5 × 10
7 /mus, range 6,68 × 10
5 til 2,06 × 10
8). Derfor, for dataanalyse, vurderte vi fold-endring av utslipp mellom behandlede og ikke-behandlede dyr i hver behandlingstiden punkt (14, 21 og 28 dager) i stedet for de absolutte fotonemisjonsverdier [18].
i figur 6, rapporterer vi rå IVIS besluttsomhet i hver mus behandlet med α-cobrotoxin etter planen en og i tilsvarende kontrollgruppe. Som vist, blir denne behandlingen ikke ut til å ha en merkbar virkning på tumorvekst i denne dyremodell systemet. Den eneste tilsynelatende slående forskjell var antallet døde dyr ved slutten av observasjonsperioden (fire i kontrollgruppen og 2 i behandlingsgruppen). Det må imidlertid bemerkes at på dette tidspunkt alle dyrene måtte ofres av etiske grunner, og at obduksjon viste at tumoren hadde utvidet utenfor brysthulen i alle behandlede og ubehandlede mus. Som vist i figur 7 også ved de høyere doser anvendes i tidsplanen to behandlingsplan, effekten av α-cobrotoxin som antitumormiddel var ubetydelig, om noen. Som for tidsplanen en behandlingsplan, også disse dyrene ble avlivet på dag 28 på grunn av tumorvekst-relaterte symptomer. Faktisk, ved obduksjon alle dyr presentert en helt invadert brysthulen med svulster som strekker seg utenfor brystet uavhengig av behandlingsopplegg.
X betegner de døde dyrene.
X betegner de døde dyrene.
i figur 8 er rapportert i gjennomsnitt fold-endring av utslipps i behandlings- og kontrollarmer for program 1 (panel A) og program 2 (Panel B). Selv om forskjellen, evaluert ved hjelp av Mann-Withney testen, ikke nådde statistisk signifikans (unntatt for en timeplan, dag 14, p = 0,04), ble det observert en slående høyere utslipp i toksinet behandlingsgruppe i forhold til styrearmen. Denne effekten var dramatisk tydelig i program 2 på dag 28, selv om forskjellen i foton emisjon ikke nådde statistisk signifikans, sannsynligvis på grunn av det begrensede antall dyr,
Panel A: mus behandlet med α- cobrotoxin etter planen 1. Panel B: mus behandlet med α-cobrotoxin etter planen 2. Panel C: mus behandlet med α-cobratoxin henhold til planene 1 og 2.
samme behandlingsplaner var også anvendes med den α-cobratoxin. Resultatene av dette settet av eksperimenter viste at dette toksinet mangler tydelig antitumor-aktivitet i tillegg. I figur 9, rapporterer vi rå IVIS besluttsomhet for hver mus behandlet med α-cobratoxin henhold til planene 1 og 2 mens i figur 8, Panel C viser vi gjennomsnittlig fold-endring av utslipps i kontroll og behandlede mus. Som det kan ses, blir behandlingen ikke har vesentlig innflytelse på tumorvekst som foton emisjon i behandlede mus var sammenlignbar med den til kontrollene ved hvert tids punkt. Antallet dyr som måtte ofres for humanitære grunner før slutten av observasjonsperioden var høyere i kontroll i forhold til behandlede mus. Det må imidlertid påpekes at også i dette tilfellet alle dyr, på dag 28, present massive tumorvekst som utvidet utenfor brysthulen uavhengig av behandlingsplanen.
X betegner de døde dyrene.
in vivo
eksperimenter ble utført bare med A549-luc cellelinjen ettersom gjenvinning av ikke-luc merkede celler ville ha krevd et stort antall mus for å vurdere antitumoraktivitet av giftstoffer. I lys av resultatene oppnådd
in vitro
på 5 cellelinjer og
in vivo
med A549-Luc vi betraktet uetisk å gå foran med flere dyrestudier
Den molekylære grunnlaget for lungekreft har blitt grundig studert og samspillet mellom nikotin og nAChR har blitt anerkjent som en av de viktigste hendelser som førte til utviklingen av denne svulsten [2], [4], [5], [6], [7], [ ,,,0],8], [9], [10], [11], [16], [26]. Det er derfor ikke overraskende at nAChR ble ansett som god kandidat mål for innovative «biologisk» behandlingsmetoder [15], [22], [23], [24]. I denne sammenheng kan eksistensen av potente giftstoffer som hemmer Nach reseptorer åpne muligheten for å tilpasse Paul Ehrlich er «magic bullet» -konseptet til lungekreft behandling [34].
cobra slangegift er en kilde til ulike giftstoffer innehar cytolytisk og nAChR-hemmende aktiviteter [32], [35]. På grunn av dette sistnevnte aktivitet, α-cobratoxin fra
N. kaouthia
har vært foreslått som en innovativ naturlig terapeutisk middel for lungecancer [18], [19], [20], [22], [24] som kan dramatisk inhibere tumorceller vekst lunge og for å forbedre overlevelsen av lunge tumor-bærende mus. Vi har re-evaluert antitumor aktivitetene til to forskjellige cobra neurotoxins
in vitro Hotell og
in vivo
benytte to tidsplaner av administrasjonen og de samme eksperimentelle forhold til tidligere rapporter. Resultatene fra våre forsøk viser klart at disse to biologisk aktive giftstoffer har i hovedsak ingen effekt på tumorcellevekst i
in vitro
analyser på konsentrasjonen rapportert i andre publikasjoner. En betydelig tumorcellevekst inhibering ble oppnådd ved α-cobratoxin-konsentrasjonen er for høy til å bli utnyttet
in vivo
. Viktigere a-nervegifter, ved konsentrasjoner bruk
in vivo
, ikke hemme tumorvekst og heller ikke var i stand til å signifikant øke overlevelsen i mus med en orthotopically-podet NSCLC. Faktisk
in vivo
forsøk måtte avbrytes på dag 28, eller tidligere, i behandlede og ubehandlede forsøksdyr for etiske grunner siden i alle tilfeller podet svulsten hadde utvidet utenfor thorax. Disse resultatene er i slående kontrast med andre studier som viste en økt levetid på 93% i α-cobratoxin behandlede versus ubehandlede mus [20] og tyder på at Cobra α-nevrotoksiner har ingen potensielle terapeutiske effekt i lungekreft.
det gjenstår å bli forklart hvorfor i en publisert rapport fra den samme gruppen alle dyr måtte avlives av humanitære grunner på dag 29 [18], mens i en annen studie dyrene, behandlet på samme måte, kan følges opp til dag 170 [20 ], (oversikt i [22]).
Overraskende har vi observert at
in vivo
tumorvekst i mus behandlet med α-cobrotoxin var høyere enn for kontrollgruppene. Dette uventede funn kan tyde på at selv om dette toksinet ikke binder seg til den α7 reseptoren, den rapporterte dominerende undertype er tilstede på A549-celler, det kan aktivere nikotinavhengige tumorigen vei gjennom dets binding til forskjellige nAChR (mest sannsynlig til muskel-type reseptor) . Dermed kan dette toksinet være et utmerket verktøy for fint dissekere de biologiske veier der nAChR er involvert
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
alle detaljer om:. Tillatelser , forskrifter og dyrevelferd er rapportert i «Animals» sub-delen av denne Metoder delen
Tumor cellelinjer og α-neurotoxin forberedelser
rotte feokromocytom cellelinjen PC12, benyttes som positiv kontroll for α7 nAChR ekspresjon, ble de humane NSCLC-adenocarcinoma cellelinjer H1650 og H1975 oppnådd fra ATCC; den NSCLC adenokarsinom A549 og squamous carcinoma cellelinjer SK-MES en og Calu 1, ble hentet fra vår Institutional Cell Repository (ICLC, www.iclc.it). Cellelinjen A549-Luc, modifisert til å stabilt uttrykke luciferase, og benyttes for
in vivo
studier ble vennlig levert av Dr. J. W. Shay (H. Simmons Comprehensive Cancer Center, University of Texas, Dallas). Den A549, A549-luc, SK-MES-1, og H1650 anvendt i denne studien hadde den samme opprinnelsen til de som anvendes i andre publiserte arbeider [18], [19], [20], [27]. Celler ble dyrket i RPMI 1640 med 10% bovint serum. (Invitrogen, San Giuliano Milanese, Italia).
kortkjedede α-cobrotoxin fra
N. atra product: (MW 6949 kDa) ble oppnådd fra Sigma (Milano, Italia). LD50 hos mus i batch benyttes i dette arbeidet, bestemmes av selskapet, var 0,09 mg /kg.
langkjedede α-cobratoxin (MW 7821 kDa) ble renset fra
N. kaouthia
gift som beskrevet [36]. Fremgangsmåten omfatter: gel-filtrering, høy ytelse ione-utveksling og reversfase-kromatografi og blir brukt til å fremstille store mengder av toksinet for reseptor-studiene [37]. Den α-cobratoxin fremstilt ved denne fremgangsmåten er fullt aktiv og hemmet acetylkolin-induserte strømmer i
Xenopus oocytter som uttrykker human
α7 nikotin-acetylcholin reseptoren med IC
50 av 4,1 nM [38]. Den biologiske aktiviteten av satsen av toksin anvendt i denne studien ble testet for evne til å inhibere radioaktiv α-bungarotoxin binding til human α7 nikotin acetylcholin reseptor, heterologt uttrykt i GH4C1-celler. Ved 20 nM α-cobratoxin inhiberte α-bungarotoxin binding med mer enn 50%.
De frysetørrede giftstoffer ble oppløst ved lager-konsentrasjon på 10
-3 M i fosfatbuffret saltoppløsning (PBS) og holdt ved -20 ° C.
Western blot-analyse
Cellesuspensjoner suspen~~POS=TRUNC ble oppnådd etter trypsinering av A549 eller A549-luc og PC12-kulturer (brukt som positiv kontroll). Celler ble løst i lyseringsbuffer og behandlet som tidligere beskrevet [39]. Proteinkonsentrasjonen av cellelysatene ble bestemt ved Bio-Rad proteinanalyse (Bio-Rad Laboratories, Segrate, Italia) i henhold til produsentens instruksjoner.
Femti mikrogram av det totale proteinene ble separert på NuPAGE 4-12% bis-Tris gel (Invitrogen, San Giuliano Milanese, Italia) og deretter overført til en nitrocellulosemembran ved iBlot ™ gel overfør Stacks (Invitrogen).
Blot ble undersøkt med anti α7 AChR polyklonale antistoff (Santa Cruz, Heidelberg, Tyskland) og deretter med anti-ßActin monoklonalt antistoff (Sigma, Milano, Italia) for å konstatere at en lik mengde protein ble applisert i hver kolonne.
immundeteksjon ble utført ved anvendelse av det forbedrede kjemiluminescens (ECL) sett (GE Healthcare, Milano, Italia) etter leverandørens anbefalte prosedyrer.
RT og qPCR analyse
Total RNA fra A549-luc (ubehandlet og behandlet med 1, 3 og 9 nM av α- cobratoxin eller α-cobrotoxin i 72 timer), A549 (ubehandlet og behandlet med 1, 3 og 9 nm α-cobratoxin), H1650, H1975, SK-MES-1, Calu 1 og PC12-cellelinjer ble isolert ved hjelp av RNAeasy Mini Kit (Qiagen) etter produsentens instruksjoner. RNA ble behandlet med RNAse-fri DNAse i løpet av on-kolonnerensing. RNA integritet ble bestemt ved gel-elektroforese: forholdet mellom 28S til 18S var ca. 2:01. RNA ble kvantifisert ved hjelp av spektrofotometri. Forholdet mellom avlesninger ved 260 nm og 280 nm ble svis mellom 1,9 og 2,1.
Ett mikrogram av total RNA ble benyttet for å fremstille cDNA med Superscript ™ II RNase H-revers Trascriptase (Invitrogen) ifølge produsentens instruksjoner.
for å bestemme tilstedeværelsen av α7 nAChR på cellelinjer, cDNA ble brukt i en semikvantitativ reaksjon som ellers beskrevet [40], [41], [42].
PCR-forhold var.: 95 ° C i 10 minutter, 45 sykluser 95 ° C i 15 sekunder, 55 ° C i 15 sekunder og 72 ° C i 30 sek)
qPCR-reaksjoner ble utført ved anvendelse av Maxima SYBR grønn qPCR Master Mix .
