Abstract
heparin-bindende epidermal vekstfaktor-lignende vekstfaktor (HB-EGF) er et medlem av den epidermale vekstfaktor-familie og har en rekke fysiologiske og patologiske funksjoner. Modulering av HB-EGF-aktivitet kan ha et terapeutisk potensial i onkologi området. Vi utforsket de terapeutiske muligheter ved å karakterisere
in vitro
biologisk aktivitet av anti-HB-EGF monoklonalt antistoff Y-142. EGF reseptor (EGFR) ligand og arter som særpreger Y-142 ble testet. Nøytraliserende aktiviteter Y-142 mot HB-EGF ble evaluert i EGFR og ErbB4 signalering. Biologiske aktiviteter av Y-142 ble undersøkt i kreftcellevekst og angiogenese-analyser og sammenlignet med anti-EGFR-antistoff cetuximab, HB-EGF-inhibitor CRM197, og den anti-vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) antistoff bevacizumab. Den bindende epitopen ble bestemt med alanin-skanning. Y-142 føres HB-EGF, så vel som EGFR-ligand amfiregulin, og bindes spesifikt til humant HB-EGF, men ikke til gnager HB-EGF. I tillegg, Y-142 nøytralisert HB-EGF-indusert fosforylering av EGFR og ErbB4, og blokkerte deres nedstrøms ERK1 /2 og AKT signalering. Vi har også funnet at Y-142 hemmet HB-EGF-indusert kreft celleproliferasjon, endotelial celleproliferasjon, rør formasjon, og VEGF produksjon mer effektivt enn cetuximab og CRM197 og at Y-142 var overlegen overfor bevacizumab ved inhibering av HB-EGF- indusert tube formasjon. Seks aminosyrer i den EGF-lignende domene ble identifisert som den Y-142 bindende epitop. Blant de seks aminosyrer, er kombinasjonen av F115 og Y123 bestemt amfiregulin kryss-reaktivitet, og at F115 utgjorde den art selektivitet. Videre ble det foreslått at den potente nøytraliserende aktivitet av Y-142 ble avledet fra dens gjenkjennelse av R142 og Y123 og dens høye affinitet til HB-EGF. Y-142 har en potent HB-EGF nøytraliserende aktivitet som modulerer flere biologiske aktiviteter av HB-EGF, inkludert cancer celleproliferasjon og angiogene aktiviteter. Y-142 kan ha et potensial til å utvikles til et terapeutisk middel for behandling av HB-EGF-avhengige kreft
Citation. Sato S, Drake AW, Tsuji jeg, Vifte J (2012) en potent anti -HB-EGF monoklonalt antistoff hemmer kreftcelle spredning og flere Angiogene Aktiviteter i HB-EGF. PLoS ONE 7 (12): e51964. doi: 10,1371 /journal.pone.0051964
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 23 august 2012; Godkjent: 09.11.2012; Publisert: 14.12.2012
Copyright: © 2012 Sato et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Ingen strøm eksterne finansieringskilder for denne studien
Konkurrerende interesser:. forfatterne har følgende interesser. Denne studien ble finansiert av Takeda San Francisco, Inc. og Takeda Pharmaceutical Company Limited. Alle forfatterne var ansatte i Takeda San Francisco, Inc. eller Takeda Pharmaceutical Company Limited og ble utbetalt som sådan. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Heparin-bindende epidermal vekstfaktor (EGF ) lignende vekstfaktor (HB-EGF) er et medlem av EGF-familien av vekstfaktorer som binder til EGF-reseptor (EGFR) og ErbB4 [1], [2]. HB-EGF blir syntetisert som et membranbundet form, proHB-EGF, noe som er kjent for å være en juxtacrine vekstfaktor [3], [4]. proHB-EGF gjennomgår ectodomain utstøtingen av proteaser [5], og avgivelse akselereres når proHB-EGF-uttrykkende celler som er eksponert for visse belastningstilstander [6], [7]. Den resulterende løselige formen av HB-EGF (SHB-EGF) er et potent mitogen aktivitet gjennom aktivering av EGFR [1]. Etter spalting, translocates HB-EGF C-terminale fragment i kjernen og induserer genekspresjon av cyclinA og cyclinD2 ved å undertrykke funksjonen av PLZF og Bcl6, henholdsvis [8], [9].
Nyere studier har avdekket en rekke fysiologiske funksjoner av HB-EGF, inkludert vev utvikling [10] – [12], skin sårheling [13], og graviditet [14], [15]. HB-EGF har også blitt funnet å være assosiert med patologiske prosesser, inkludert hjerte-hypertrofi [16], pulmonal hypertensjon [17], aterosklerose [18], [19], og onkogen transformasjon [20]. Mer nylig er økende bevis vist at HB-EGF er overuttrykt i mange typer kreft [21] – [25] og den over-ekspresjon er vist å korrelere med dårlig prognose [24], [26], [27 ]. På grunn av disse funnene, har anti-HB-EGF agenter blitt aktivt fulgt for terapeutiske anvendelser. En HB-EGF inhibitor av difteri-toksin-mutant, CRM197, er i fase I klinisk utvikling for behandling av avansert eggstokk-kreft [28]. Anti-HB-EGF antistoffer U3-1565 og KHK2866 er for tiden i fase I kliniske studier med fast kreft [29]. Et anti-HB-EGF terapeutisk monoklonale antistoff er forventet å ha en lengre halveringstid i forhold til CRM197 [30], [31], men genereringen av potente anti-HB-EGF-antistoffer har vært krevende og noen anti-HB-EGF monoklonale antistoffer med en funksjonell aktivitet er blitt rapportert [29], [32], [33]. Nylig rapporterte vi dannelsen av nøytraliserende anti-HB-EGF-monoklonale antistoffer [34]. I denne studien, rapporterer at det er karakteriseringen av en av de anti-HB-EGF-monoklonale antistoffer, Y-142, ved å analysere dens funksjonelle aktiviteter og bindende epitop. Den potente biologiske aktivitet av Y-142 ble sammenlignet med de av anti-EGFR-antistoff cetuximab, av HB-EGF-inhibitor CRM197, og av anti-VEGF-antistoff bevacizumab.
Materialer og metoder
Material
menneske, mus, rotte og SHB-EGF, og EGFR-HFC ble tidligere fremstilt fra kultursupernatanten fra 293F-celler (Invitrogen) transfektert med hvert ekspresjonsplasmid [34]. EGFR-ligander, anti-amfiregulin (anti-ARG) monoklonalt antistoff, anti-EGFR, anti-ErbB4, anti-HB-EGF, og anti-ARG-polyklonale antistoffer, FITC-merket anti-CD31, anti-VEGF, biotinylert anti-VEGF- ble pepperrotperoksidase-merket (HRP-merket) anti-fosfotyrosin antistoffer kjøpt fra R faktisk vi viste at Y-142 kan nøytralisere SHB-EGF-indusert fosforylering av endogent uttrykt ErbB4 på T47D celler (fig. 3C). Viktigere, den nøytraliserende aktivitet av Y-142 påvirket EGFR nedstrøms signale hendelser. Som vist i fig. 3D og 3E, Y-142 nøytralisert SHB-EGF-indusert fosforylering av ERK1 /2 og AKT, respektivt. Til sammen våre resultater viste at SHB-EGF binder seg til og aktiverer EGFR og ErbB4, og at Y-142 kan nøytralisere SHB-EGF-indusert EGFR og ErbB4 signalering.
(A) hemmende aktivitet av Y-142 til SHB-EGF binding til EGFR. EGFR-HFC ble inkubert i en anti-humant IgG Fc-antistoff-belagte plate. Y-142 ble så inkubert ved en konsentrasjon på 6,7 nM i nærvær av 0,63 nM biotinylert SHB-EGF i 1 time ved 37 ° C. SHB-EGF bundet til EGFR-HFC ble oppdaget av HRP-merket streptavidin. SHB-EGF-binding til EGFR-HFC i nærvær av Y-142 ble beregnet som en prosentandel av «kontroll» SHB-EGF-binding til EGFR som skjedde uten Y-142. Datapunkter representerer gjennomsnittet + SD verdier anskaffet i tre eksemplarer. (B) nøytraliserende aktivitet av Y-142 mot EGFR fosforylering. SK-OV-3-celler ble behandlet med 10 nM SHB-EGF og 67 nM Y-142. Cellelysater ble inkubert i et anti-EGFR-antistoff-belagt plate, etterfulgt av en inkubasjon med HRP-merket anti-phosphorytosine antistoff. EGFR fosforylering i nærvær av Y-142 ble beregnet som en prosentandel av «kontroll» EGFR fosforylering som skjedde uten Y-142. Datapunkter representerer gjennomsnittet + SD verdier anskaffet i tre eksemplarer. (C) Nøytraliserende aktivitet av Y-142 mot ErbB4 fosforylering. Cellelysater av T47D-celler som fremstilt i fig. 3A ble inkubert med et anti-erbB4-antistoff-belagte plate. Fosforyleringen av ErbB4 ble påvist ved en sulfo-merket anti-fosfotyrosin-antistoff. ErbB4 fosforylering i nærvær av Y-142 ble beregnet som en prosentandel av «kontroll» ErbB4 fosforylering som skjedde uten Y-142. Datapunkter representerer gjennomsnittet + SD verdier ervervet i to eksemplarer. (D) og (E) Nøytraliserende aktivitet av Y-142 mot (D) ERK1 /2 fosforylering og (E) AKT-fosforylering. I (D) og (E) SK-OV-3-celler behandlet med 10 nM SHB-EGF og 200 nM Y-142 ble farget med et anti-fosforylert ERK1 /2-antistoff eller et anti-fosforylert AKT-antistoff, henholdsvis, fulgt av en Alexa488-merket anti-kanin-IgG-antistoff. Fosforylert ERK1 /2 og fosforylert AKT var begge detektert med et ImageXpress mikro instrument og beregnet som en prosentandel av «kontroll» fosforylering nivåer som forekommet uten Y-142. Datapunkter representerer gjennomsnittet + SD verdier ervervet i to eksemplarer. (F) nøytraliserende aktivitet av Y-142 til ARG. SK-OV-3-celler ble behandlet med 10 nM ARG pluss diverse konsentrasjoner av Y-142 (2 nM, 6,7 nM, 20 nM, og 67 Nm). Anti-ARG-monoklonalt antistoff (67 nM) ble anvendt som en positiv kontroll. Cellelysater ble inkubert i et anti-EGFR-antistoff-belagt plate, etterfulgt av en inkubering med et HRP-merket anti-phosphorytosine antistoff. EGFR fosforylering ble beregnet som en prosentandel av «kontroll» EGFR fosforylering som skjedde uten Y-142. Datapunkter representerer gjennomsnittet + SD verdier anskaffet i tre eksemplarer.
I en bindende spesifisitet test, Y-142 aner ARG samt SHB-EGF, noe som er både EGFR-ligander (Fig. 1A) . Vi deretter testet om Y-142 kan nøytralisere den biologiske aktivitet av ARG. Vi antok at Y-142 ville være i stand til å nøytralisere funksjonaliteten til ARG på grunn av dens nøytraliserende aktivitet mot SHB-EGF og kryss-reaktivitet til ARG. Men vi var i stand til å vise at fosforylering av EGFR indusert av ARG ble bare delvis nøytralisert av Y-142 (Fig. 3F), mens Y-142 fullstendig blokkert SHB-EGF-indusert EGFR fosforylering (Fig. 3B). Disse resultatene antydet at Y-142 kan nøytralisere både SHB-EGF og ARG funksjonelle aktiviteter, om enn ARG aktivitet på EGFR er bare delvis blokkert av Y-142.
Sammenligning av SHB-EGF nøytraliserende aktivitet av Y-142 med de av cetuximab, CRM197, og Bevacizumab
den nøytraliserende aktivitet av Y-142 mot SHB-EGF ble sammenlignet med to kjente hemmere av EGFR sti: cetuximab og CRM197. Cetuximab, et anti-EGFR-monoklonale antistoff anvendes som et cancer terapeutisk middel, undertrykker EGFR-avhengige kreftcellevekst ved å inhibere EGFR aktivering. CRM197, en mutant difteritoksin, bindes til proHB-EGF og den påfølgende internalisering av CRM197 fører til hemming av proteinsyntesen. Som vist på fig. Som vist på fig.
