Abstract
Bakgrunn
microRNAs (mirnas), endogene små ikke-kodende RNA, er stabilt påvist i humant plasma. Tidlig diagnose av magekreft (GC) er meget viktig for å forbedre terapien effekt og forlenge overlevelse av pasienter. Vi forsøkte å finne ut om fire mirnas (MIR-223, MIR-21, MIR-218 og MIR-25) tett knyttet til tumordannelse eller metastasering av GC kan tjene som nye potensielle biomarkører for GC deteksjon.
Methodology
Vi først målte plasmanivået av de fire mirnas i 10 GC pasienter og 10 friske kontrollpersoner ved kvantitativ revers transkripsjon polymerase chain reaction (QRT-PCR), og deretter sammenlignet plasma miRNA resultater med uttrykkene i kreftvev fra åtte GC pasienter. Til slutt ble tilstedeværelse av MIR-223, MIR-21 og MIR-218 i plasma validert i 60 GC pasienter og 60 friske kontrollpersoner, og områdene under mottakeren opererer karakteristiske (ROC) kurver av disse mirnas ble analysert.
Resultater
Vi fant at plasmanivået av Mir-223 (
P
0,001) og Mir-21 (
P
0,001) var signifikant høyere i GC pasienter enn hos friske kontroller, mens MIR-218 (
P
0,001) var betydelig lavere. ROC analyser ga AUC-verdier på 0,9089 for MIR-223, 0,7944 for MIR-21 og 0,7432 for MIR-218, og kombinert ROC analyse viste den høyeste AUC verdien av 0,9531 i diskriminerende GC pasienter fra friske kontroller. Videre plasmanivået av Mir-223 (
P
0,001) og Mir-21 (
P
= 0,003) var signifikant høyere i GC pasienter med stadium I enn hos friske kontroller. Videre plasmanivået av MIR-223 var betydelig høyere i GC pasienter med
helicobacter pylori plakater (Hp) infeksjon enn de uten (
P
= 0,014), og betydelig høyere hos friske kontrollpersoner med Hp-infeksjon enn de uten (
P
= 0,016).
Konklusjoner
Plasma MIR-223, MIR-21 og MIR-218 er nye potensielle biomarkører for GC deteksjon .
Citation: Li Bs, Zhao yl, Guo G, Li W, Zhu Ed, Luo X, et al. (2012) Plasma microRNAs, MIR-223, MIR-21 og MIR-218, som Novel Potensielle Biomarkører for Gastric Cancer Detection. PLoS ONE syv (7): e41629. doi: 10,1371 /journal.pone.0041629
Redaktør: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, USA
mottatt: 21 desember 2011; Godkjent: 27 juni 2012; Publisert: 30.07.2012
Copyright: © Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Science Foundation Natural of China (NSFC, nr 81071412). Finansiører hadde rolle i datainnsamling og analyse, men ikke rolle i studiedesign, beslutningen om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den fjerde vanligste kreftformen i verden, og den nest største årsaken til kreftdød i begge kjønn verden over. Høyest dødelighet er beregnet i Øst-Asia [1]. Den 5-års overlevelse for magekreft er mindre enn 20% -25% i USA, Europa og Kina [2]. Foreløpig er fullstendig kirurgisk reseksjon den mest effektive behandlingen, og tilbyr en utmerket (90%) sjanse for en kur for pasienter med tidlig magekreft [3]. For avansert magekreft, til tross for kurativ kirurgi, omtrent 80% av pasientene dør i løpet av kort tid fra lokoregionalt gjentakelse (87%) og /eller fjernmetastaser (30%) [4]. Derfor forbedring i tidlig diagnose kan øke sjansen for en kur i begynnelsen av GC pasienter eller forlenge overlevelsen av pasienter med tidlig stadium GC. Men de fleste tidlig stadium GCer er vanskelige å oppdage [5]. De konvensjonelle serummarkører for GC, som for eksempel karbohydrater antigen 19-9 (CA19-9) og carcinoembryonic antigen (CEA), mangel tilstrekkelig sensitivitet og spesifisitet til rette for tidlig deteksjon.
microRNAs (mirnas) er små, ikke kodende RNA som posttranscriptionally regulerer genekspresjon. Avvikende ekspresjon av mirnas har blitt korrelert med flere sykdommer, inkludert kreft [6]. Tidligere studier har indikert at vevet miRNA ekspresjonsprofiler kan betraktes som diagnostiske biomarkører i kreft [7] – [9]. Imidlertid er denne diagnostiske metoden er begrenset i sin virkning som vevsprøver er ikke praktisk for å få tilgang til, og er invasiv å skaffe. Et økende antall av papirer rapporterer at sirkulerer mirnas er stabilt påvises i ulike kroppsvæsker, inkludert serum og plasma [10], [11]. Sirkulasjons mirnas som nye stabile biomarkører ville være en av de mest lovende hjelp av diagnose, fordi plasma og serum er lett tilgjengelige og ikke-invasiv å skaffe. Nylig har flere lovende serum eller plasma miRNA biomarkører for GC deteksjon blitt identifisert [12], [13].
For å utforske denne romanen plasma miRNA signaturer kan skille pasienter med GC (spesielt tidlig stadium GC) fra sunt kontroller, valgte vi fire mirnas (MIR-223, MIR-218, MIR-25 og MIR-21) som hadde blitt rapportert å være ofte dysregulerte i GC vev og nært korrelert med tumordannelse eller metastasering av GC [14] – [21] . Vi antok at plasmanivået av de tre mirnas (MIR-223, MIR-218 og MIR-25) var avvikende i GC pasienter samt de av MIR-21, som antydet at denne signaturen kan tjene som en biomarkør for GC deteksjon [12]. Imidlertid har plasmanivået av MIR-21 i GC pasienter på ulike TNM stadier ikke blitt identifisert. I denne studien sammenlignet vi plasmanivået av de fire mirnas i GC pasienter til friske kontroller, og vurderes muligheten for de fire mirnas som nye ikke-invasive biomarkører for GC deteksjon.
Materialer og metoder
Pasienter og prøver
Alle prøvene ble samlet inn fra samtykkende personer i henhold til protokoller godkjent av etikk Review Board på Third Military Medical University. Totalt ble 70 pasienter med GC før noen behandlinger og 70 friske kontrollpersoner fra Southwest Hospital (Chongqing, Kina) inkludert i vår studie mellom 2010 og 2011. For de 70 GC pasienter, analyserte vi histologi av GC vev, inkludert 56 adenocarcinoma, 13 mucinous adenokarsinom og en Signet-ring cellekreft, og bestemt kreft steder, inkludert 34 i Gastric kroppen, 24 i Gastric antrum, 8 i Gastric Cardia og fire i andre (øvre del av magen, Gastric vinkel, Gastric stump). GC pasienter ble klassifisert i henhold til de kliniske TNM stadier, inkludert 12 stadium I (median alder 53 år [rekkevidde, 36-70 år]; åtte mannlige, 4 kvinner), 11 trinn II (median alder 61 år [rekkevidde, 36-77 år]; syv mannlige, 4 kvinner), 36 stadium III (median alder 55 år [rekkevidde, 30-71 år]; 26 menn, 10 kvinner) og 11 scene IV (median alder, 53 år [rekkevidde , 46-66 år]; ni mannlige, to kvinnelige) sikret status av Hp-infeksjon ble testet ved hjelp av Anti-HP Antistoffer ELISA Diagnostic Kits (S20010005), (BEIJING Beier BIOENGINEERING CO, LTD), som viser 43 GC pasienter med Hp-infeksjon. og 27 uten. For de 70 friske kontrollpersoner, ble 44 mannlige og 26 kvinnelige inkludert, og median alder var 51 år [rekkevidde, 26-75 år]. Resultatene av Hp infeksjon test viste 31 friske kontrollpersoner med Hp-infeksjon og 39 uten. (Tabell 1).
Cell-fritt plasma ble isolert fra alle blodprøver i løpet av 2 timer for samling ved hjelp av en to-trinns protokoll (1500 rpm i 10 minutter, 12000 rpm i 2 min) for å forhindre forurensning av cellulære nukleinsyrer. Plasma ble overført til et nytt rør, og etterlater en fast høyde på 0,5 cm plasmasupernatant ovenfor pelleten for å unngå å forstyrre pelleten [11]. Det ble lagret ved -80 ° C i 450 ul aliquoter. Åtte par vevsprøver ble samlet fra åtte GC pasienter med høyere nivåer av plasma MIR-223 og MIR-21, og lavere nivåer av plasma MIR-218 enn friske kontroller etter kirurgisk reseksjon, og omtrent kuttet til 1 mm firkanter og umiddelbart frosset i flytende nitrogen.
RNA Utvinning
Totalt RNA ble ekstrahert fra 400 mL av plasma ved hjelp av Mirvana PARIS Kit (Ambion) i henhold til produsentens protokoll, og eluert med 105 ul forvarmet ( 95 ° C) elueringsoppløsning. For å tillate normalisering av sample-til-sample variasjon i RNA isolasjonstrinnet, 10 ul 0,05 pM syntetisk
C. elegans
MIR-39 (syntetisk RNA-oligo-nukleotider syntetisert ved GenePharma) ble tilsatt til hver denaturert prøve etter kombinasjon av plasmaprøven med denaturerende løsnings [11]. For de frosne vev, ble total RNA ekstrahert ved hjelp av TRIzol reagens (Invitrogen) i følge produsentens protokoll, og endelig resuspendert i 60 pl av forvarmet (95 ° C) nuklease-fritt vann.
kvantitative reverse transkriptase Polymerase Chain Reaction (QRT-PCR)
revers transkripsjon reaksjonen ble utført ved hjelp av en Taqman mikroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). cDNA ble syntetisert i 5 ul volumer som inneholder 1,67 mL av RNA-ekstrakt, 0,5 ul av 10 × revers transkripsjon buffer, 0,05 mL 100 mM dNTP, 0,063 mL av RNase Inhibitor (20 U mL
-1), 0,33 mL av Mutiscribe revers transkriptase (50 U ul
-1), 0,5 mL av gen-spesifikke primer og 1.887 mL av nukleasefritt vann. Reaksjonene ble inkubert ved 16 ° C i 30 minutter, etterfulgt av 42 ° C i 30 min, deretter 85 ° C i 5 minutter før de ble holdt ved 4 ° C. Den syntetiserte cDNA ble fortynnet to ganger ved atom-fritt vann. Kvantitativ PCR-reaksjoner ble utført ved anvendelse av 2 ul cDNA-løsning, 5 mL av TaqMan 2 x Perfekt Master Mix (Takara), 0,25 mL av genspesifikke primere /probe (TaqMan® mikroRNA Assays, Applied Biosystems. Tabell S1) og 2,75 ul av nuklease-fritt vann i et sluttvolum på 10 ul, og løpe på en Bio-Rad IQ5 (Bio-Rad Laboratories, Inc) termosykler. Reaksjonsblandingene ble inkubert ved 95 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 30 sek. Syklusen terskel (
C
t) verdier ble beregnet med Bio-Rad iQ5 2.1 Standard Edition Optical System Software 2.1.94.0617.
Plasma miRNA konsentrasjonene ble beregnet ved hjelp av en standard kurve konstruert ved hjelp av syntetiske mirnas [22]. De standard referanse mirnas ble amplifisert for hver reaksjon. Imidlertid var uttrykk for miRNAs fra vevsprøver normalisert ved hjelp av to
-ΔΔ
C
t metode fra
C
t verdier av miRNAs av interesse i forhold til RNU6B.
Normalisering av Experimental QRT-PCR data fra plasma ved bruk av syntetisk C. elegans MIR-39
C. elegans
MIR-39, som mangler sekvenshomologi menneskelige mirnas, ble valgt ut til å normalisere eksperimentelle QRT-PCR data. Kjente mengder av syntetisk
C. elegans
MIR-39 ble fortynnet til å produsere
C
t-verdier innenfor
C
t verdiområder av miRNA standardkurver. Vi empirisk lagt 10 mL av 0,05 mikrometer syntetisk
C. elegans
MIR-39 til 400 mL av plasma etter å kombinere plasmaprøven med denaturering Solution.
C. elegans
MIR-39 ble forsterket samt andre miRNAs. Følgende formel ble brukt for å justere
C
t verdier av mirnas (MIR-223, MIR-21, MIR-218 og MIR-25) i alle plasmaprøver: Normalized_
C
t verdi for miRNA i prøven = Raw_
C
t verdi – [(SpikeIn_ Average_
C
t verdien av den gitte prøve) – (Median_ SpikeIn_
C
t)] [11]. Den normalized_
C
t-verdien ble så brukt til å beregne konsentrasjonen av hver miRNA.
Statistical Analysis
Mann-Whitney test ble brukt for å sammenligne forskjellene plasma miRNA konsentrasjoner og miRNA forhold mellom kreft gruppen og sunn gruppen. En to-sidig χ
2 test ble brukt for å sammenligne forskjeller i kjønn, alder eller Hp smittestatus mellom GC pasienter og friske kontroller. ANOVA-test ble anvendt for å analysere forholdet mellom nivåene av MIR-223, MIR-21, MIR-218 og TNM etapper. Mottaker-drift karakteristiske (ROC) kurver og arealet under ROC-kurven (AUC) ble brukt for å vurdere muligheten for å bruke plasmanivået av mirnas som diagnostiske verktøy for å oppdage GC. Den Youden indeksen ble brukt til å velge de optimale cutoff-verdier. Et
P
-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 13.0 programvare og grafer ble generert ved hjelp GraphPad Prism 5.0 (Graphpad Software Inc, Caligornia).
Resultater
Karakteriserer av fag
Ett hundre og førti fag, inkludert 70 GC pasienter og 70 friske kontrollpersoner, ble rekruttert til studien. Ingen signifikante forskjeller i kjønn eller alder ble funnet mellom GC pasienter og friske kontroller (
P
= 0,371,
P
= 0,398, χ
2 test, henholdsvis). Hp smittestatus var signifikant forskjellig mellom GC pasienter og friske kontroller (
P
= 0,042) (tabell 1).
Evaluering av kvantitativ RT-PCR for å måle mirnas i Plasma
Hvis du vil definere dynamisk rekkevidde og følsomhet miRNA kvantifisering av real-time PCR, de syntetiske enkelttråds mirnas ble serielt fortynnet 10 ganger fra konsentrasjoner av 0,1-0,000001 fmol for MIR-223, MIR-218, speil 25, og MIR-21 på anbefaling av GenePharma miRNA Reference Panel. Linearitet av kvantitativ RT-PCR mellom de logaritmiske verdiene for inngangs mirnas og
C
t-verdier ble bekreftet for hver syntetisk miRNA, MIR-223, MIR-218, MIR-25 og MIR -21 (R
2 = 0,997, R
2 = 0,998, R
2 = 0,993 og R
2 = 0,999, henholdsvis) (figur 1).
ti- fold seriefortynning av syntetisk miRNA ble anvendt for å generere standardkurver. Linearitet ble bekreftet i løpet av disse konsentrasjonene for MIR-21, MIR-223, MIR-218 og MIR-25 som strekker seg 0,1 til 0,000001 fmol. (
MIR-21
: y = -3.337x + 14,77 (R
2 = 0,999);
MIR-223
: y = -3.121x + 17,37 (R
2 = 0,997);
MIR-218
: y = -3.071x + 17,79 (R
2 = 0,998);
MIR-25
: y = -3.114x + 17,47 ( R
2 = 0,993)).
Foreløpig Screening av Plasma mirnas som kan overvåke GC
Fire mirnas, MIR-223, MIR-218, MIR-25 og MIR -21, ble abnormt uttrykt i GC vev. For å undersøke om nivåene av fire mirnas stede feilregulering i plasma fra pasienter med GC, vi først målte plasmanivået av de fire mirnas i 10 GC pasienter og 10 friske kontroller. Som forventet plasmanivået av MIR-223 og MIR-21 var signifikant høyere i GC pasienter enn hos friske kontroller (
P
0,001), mens MIR-218 var vesentlig lavere (
P
0,001). Men plasmanivået av MIR-25 var ikke signifikant forskjellig mellom GC pasienter og friske kontroller (
P
= 0,970) (Figur 2 (A-D)). Det har blitt rapportert at nivåene av MIR-21 i GC plasma kunne reflektere de i primær GC vev [12]. For å undersøke hvorvidt nivåene av tre mirnas (MIR-223, MIR-218 og MIR-21) i GC plasma kan reflektere de i primær GC vev, testet vi nivåene av de tre mirnas i åtte par GC vev og tilstøtende normalt vev prøver fra åtte GC pasienter som plasma nivåer av MIR-223, MIR-21 var betydelig høyere, og MIR-218 var betydelig lavere. Som vist i figur 2E, er ekspresjonsnivåene av MIR-223 var høyere i primær GC vev enn i kontrollgruppen i syv av de åtte pasienter som ble analysert (87,5%) og MIR-21 i åtte pasienter (100%), mens MIR-218 var lavere på sju pasienter (87,5%), noe som tyder på at nivåene av disse tre mirnas i GC plasma reflekterte de i primær GC vev.
Scatter prikkplotter av plasmanivået av fire mirnas i mage kreftpasienter (GC, n = 10) og friske kontrollpersoner (NC, n = 10). Scatter dot tomter viser plasmanivået av
MIR-223 plakater (A),
MIR-21 plakater (B),
MIR-218 plakater (C) og
MIR-25 product: (D). Linjene i scatter dot tomter betegne medianverdier. (E) barer uttrykket nivåer av MIR-223, MIR-21 og MIR-218 i primær GC vev og sammenkoblede normalt vev. Uttrykket nivåer av MIR-223 var høyere i primære GC vev i sju av de åtte pasientene analysert (87,5%) og Mir-21 i åtte pasienter (100%), mens MIR-218 var lavere på sju pasienter (87,5%) enn i sammenkoblede normalt vev. Alle analyser ble gjentatt tre ganger i duplikater.
plasmanivået av MIR-223, MIR-21, MIR-218 og MIR-25 ble validert i Large Scale
For å evaluere plasmanivået av ovennevnte fire mirnas som diagnostiske markører for GC deteksjon, en annen 60 GC pasienter og 60 friske kontrollpersoner ble lagt i denne valideringen analysen. Som vist i figur 3, nivåene av MIR-223 og MIR-21 var signifikant høyere i GC plasma enn i kontroll (
P
0,001), mens MIR-218 var betydelig lavere (
P
0,001). Men plasmanivået av MIR-25 var ikke signifikant forskjellig mellom GC pasienter og friske kontroller (
P
= 0,082) (Figur S1). Konsentrasjonsverdiene for de fire mirnas målt i plasma hos individer ble vist i Tabell S2. ROC kurve analyser ble utført for å evaluere diagnostisk verdi for de tre plasma mirnas og avslørte at de tre plasma mirnas var verdifulle biomarkører for å skille GC fra normale kontroller med AUC (arealet under ROC-kurven) på 0,9089 (95% KI: 0,8598 til 0,9580 ) for MIR-223, 0,7944 (95% KI: 0,7211 til 0,8677) for MIR-21 og 0,7432 (95% KI: 0,6628 til 0,8236) for MIR-218. På den optimale grenseverdi på 0,7286 med verdien av følsomhet + spesifisiteten-1 anses for å være maksimal for MIR-223, sensitivitet og spesifisitet var 84,29% og 88,57%; ved grenseverdi på 0,5000 for MIR-21, sensitivitet og spesifisitet var 74,29% og 75,71%, og på cutoff av 0,3858 for MIR-218, sensitivitet og spesifisitet var 94,29% og 44,29%. For å heve diagnosen verdi, analyser kombinasjonen ROC kurven ble utført ved (MIR-223 multiplisert med MIR-21) delt på MIR-218. Forholdet mellom (MIR-223 × MIR-21) /MIR-218 ga den høyeste AUC verdien av 0,9531 (95% KI: 0,9222 til 0,9839) og den optimale verdien av 0,7715 cutoff, sensitivitet og spesifisitet var 84,29% og 92,86% , som indikerte at kombinasjonen signatur har et stort potensial diagnose verdi for GC deteksjon.
Boksplott plott~~POS=HEADCOMP viser plasmakonsentrasjoner av MIR-223 (A), MIR-21 (B), MIR-218 (C) og (MIR-223 × MIR-21) /MIR-218 (D) i GC pasienter (GC, n = 70) og friske kontroller (NC, n = 70). Linjene inne i boksene betegne medianverdier. Værhårene av boksplott: Min til Max. Grafer av mottaker operasjonelle egenskaper (ROC) kurve viser arealet under kurvene (AUC) av MIR-223 (E), MIR-21 (F), MIR-218 (G) og (MIR-223 × MIR-21) /MIR-218 (H) for å skille GC pasienter fra friske kontroller. Intervallet mellom 5
th og 95
th prosentiler betegner sikkerhetsnivå og rapporten viser resultatene som brøk. Alle analyser ble gjentatt tre ganger i duplikater.
plasmanivået av MIR-223, MIR-218 og MIR-21 i GC Pasienter med ulike kliniske Status
plasmanivået av disse tre mirnas i GC pasienter ved ulike TNM stadier (12 med jeg, 11 med II, 36 med III eller 11 med IV) ble analysert for å fastslå om de tre plasma mirnas kan oppdage tidlig stadium GC. Som vist i figur 4A, plasmanivået av de tre mirnas var ikke signifikant forskjellig på tvers av fire stadier (MIR-223,
P
= 0,244; MIR-218,
P
= 0,664; MIR -21,
P
= 0,596), men hver av de fire stadier inkludert stadium i pasientene hadde betydelig forhøyet plasma MIR-223 og MIR-21 sammenlignet med friske kontroller (P 0,01), og MIR -218 ble betydelig redusert i fase II, III og IV (
P
0,01), mens MIR-218 var ikke signifikant forskjellig mellom scene i pasienter og friske kontroller (
P
= 0,071). Videre har vi sammenlignet med nivåene av de tre mirnas i plasma fra GC pasienter med metastasering til de uten. Som vist i figur 4B, plasmanivået av de tre mirnas hadde ingen signifikante forskjeller mellom GC pasienter med metastaser og de uten (MIR-223,
P
= 0,320; MIR-218,
P
= 0,979;. MIR-21,
P
= 0,310)
(A) Box plott av plasmakonsentrasjonen av MIR-223 (venstre panel), MIR-21 (midtre panelet ) og MIR-218 (høyre panel) i friske kontroller (NC, n = 70) og magekreft (GC, n = 70) pasienter på ulike TNM stadier (12 med i, 11 med II, 36 med III og 11 med IV ). (B) Boksplott av plasmakonsentrasjonen av MIR-223 (venstre panel), MIR-21 (i midten panel) og Mir-218 (høyre panel) i GC pasienter med eller uten metastaser. Linjene inne i boksene betegne medianverdier. Værhårene av boksplott: Min Max
Forholdet mellom plasmanivået av MIR-223, MIR-21, MIR-218 og Hp Infeksjon Status Emner
I tillegg. , testet vi status for Hp-infeksjon i de 140 fagene som beskrevet ovenfor, og analysert plasmanivåene av de tre mirnas på 70 GC pasienter (43 med Hp-infeksjon og 27 uten) og 70 friske kontrollpersoner (31 med Hp-infeksjon og 39 uten) for å vurdere forholdet mellom plasmanivået av de tre mirnas og Hp smittestatus av fagene. Som vist i figur 5, plasmanivået av MIR-21 (
P
= 0,875,
P
= 0,527) og Mir-218 (
P
= 0,097,
P
= 0,539) var ikke signifikant forskjellig mellom GC pasienter med Hp-infeksjon og de uten, og mellom de friske kontroller med Hp-infeksjon og de uten, henholdsvis. Men MIR-223 var betydelig høyere i GC pasienter med Hp-infeksjon enn de uten (
P
= 0,014), og betydelig høyere i de friske kontroller med Hp-infeksjon enn de uten (
P
= 0,016). Plasmanivået av Mir-223 (
P
0,001) og Mir-21 (
P
0,001) ble signifikant forhøyet i GC pasienter med Hp-infeksjon eller som uten sammenlignet med friske kontroller med Hp-infeksjon eller som uten, mens MIR-218 var betydelig lavere (
P
0,05). Disse dataene gir sterke bevis på at de tre miRNA signaturer kan skille GC pasienter med eller uten Hp smitte fra friske kontroller.
Skap plott av plasmakonsentrasjonen av MIR-223, MIR-21 og MIR-218 i GC pasienter med
H. pylori
infeksjon (With, n = 43) og de uten (Uten, n = 27), og i friske kontrollpersoner med
H. pylori-infeksjon
(I, n = 31) og de uten (Uten, n = 39). Merk: *,
P
0,05; **
P
0,01. Boksplott viser plasmanivået av MIR-223 (A), MIR-21 (B) og Mir-218 (C). Linjene inne i boksene betegne medianverdier. Værhårene av boksplott. Min til Max
Diskusjoner
I denne studien nivåene av fire mirnas (MIR-223, MIR-218, MIR-21 og speil 25) i plasma fra 70 GC-pasienter og 70 friske kontroller ble analysert. I samsvar med tidligere studier av Tsujiura et al [12], vår analyse viste også at betydelig høyere plasmanivåer av MIR-21 i GC pasienter. Vi har funnet at nivåene av MIR-223 var signifikant høyere i GC plasma enn i kontrollen, mens MIR-218 var betydelig lavere. Den kombinerte ROC analyser avslørte en høyeste AUC 0,9531 med 84,29% sensitivitet og 92,86% spesifisitet for forholdet (MIR-223 × MIR-21) /MIR-218 i diskriminerende GC fra kontroller. Vi har også analysert plasmanivået av MIR-223, MIR-21, MIR-218 i GC pasienter med ulike kliniske status (TNM stadium eller metastase) og forholdet mellom plasmanivået av de tre mirnas og Hp smittestatus av fagene.
Selv om MIR-223 har blitt rapportert å være nesten utelukkende uttrykt i benmargen [23], dens overekspresjon har blitt observert i mange typer av kreft, slik som spiserørskreft [16], hepatocellulært karsinom [24], og GC [14], [15]. Nylig Xiaohua Li rapporterte at MIR-223 ble bare overuttrykt i magekreft med spredning celler og stimulert ikke-metastatisk adenokarsinom kreftceller migrasjon og invasjon [25]. Hvorfor plasmanivået av MIR-223 var signifikant høyere hos pasienter med tidlig stadium GC? I GC mikromiljøet, mange tumor-assosierte celler, slik som makrofager, myeloide celler, dendrittiske celler og T-celler, har evnen til å frigi exosomes, som transporten både mRNA og mikroRNA til andre celler eller sirkulasjonen [26]. For tidlig stadium GC, kanskje MIR-223 være oppregulert i enkelte tumorassosierte celler og levert inn i perifert blod via exosmes. Nyere bevis indikerer at MIR-223 frigjøres av makrofager ble transportert inn i brystcancerceller og regulert til invasivitet av brystkreftceller [27]. Det har vist seg at restaureringen av MIR-218 undertrykker Robo1 uttrykk og hemmer magekreft celle invasjon og metastase
in vitro Hotell og
in vivo product: [17]. Overekspresjon av MIR-218 resulterte i en betydelig redusert cellevekst aktivitet og celle invasjon av AGS-celler sammenlignet med den til kontrollgruppen [20]. Gao C et al [21] rapporterte at uttrykket nivåer av MIR-218 ble betydelig redusert i GC vev, i H. pylori-infisert mageslimhinnen, og i H. pylori-infisert AGS celler. I vår studie, plasmanivået av MIR-218 var ikke signifikant forskjellig mellom GC pasienter med Hp-infeksjon og de uten, eller mellom friske kontrollpersoner med Hp-infeksjon og de uten. Nivåene av mirnas kan være forskjellig mellom GC plasma og mageslimhinnen. Mir 21 er overuttrykt i en rekke kreftformer, herunder brystkreft [28], lungecancer [29], tykktarmskreft [30], og GC [18], [19]. Selv Tsujiura et al [12] rapporterte at plasmanivået av MIR-21 ble signifikant forhøyet i GC pasienter, har sine nivåer i plasma fra GC pasienter på ulike TNM hjorter ikke blitt identifisert.
Økende antall papirer rapporterte som sirkulerer mirnas kan tjene som ikke-invasive biomarkører for GC deteksjon. Nylig Hanshao Liu rapportert at serum MIR-378 ble signifikant forhøyet i GC pasienter med TNM stadium I, noe som tyder på at dette miRNA signatur kan tjene som en roman invasiv biomarkør for tidlig deteksjon av GC [31]. Men Hp smittestatus i GC pasienter og friske kontroller ble ikke nevnt. Det er velkjent at Hp-infeksjon er en av de viktigste årsakene til GC, inkludert adenokarsinom i ventrikkel, mage MALT lymfom. Hvis plasma /serumnivå av de spesifikke sirkulerende mirnas ble bare dysregulerte i GC pasienter med Hp-infeksjon, men ikke i de uten, kan det hende at mirnas tjene som biomarkører for påvisning av pasienter med Hp-infeksjon i stedet for påvisning av pasienter med GC.
i denne studien, selv om vi analysert plasmanivået av MIR-223, MIR-21 og MIR-218 i GC pasienter på ulike TNM stadier, antall tidlig stadium GC prøvene var beskjeden. Antallet plasma mirnas testet i trening sett var begrenset. I fremtiden etterforskningen, kan vi få tilgang til flere antall tidlig stadium GC prøver å vurdere rollen til plasma MIR-223, MIR-21, MIR-218 eller andre plasma mirnas forbundet med GC i tidlig deteksjon av GC.
for det formål å lete effektive blodbaserte biomarkører for GC deteksjon for å forlenge overlevelsen av pasienter med tidlig GC, har mange forskere fokusert på sirkulerende mirnas, som nylig har blitt rapportert å tjene som et effektivt og ikke-invasiv biomarkør for deteksjon ulike typer cancer eller andre sykdommer [32] – [35]. Selv om sensitivitet og spesifisitet av sirkulerende miRNA biomarkører for GC deteksjon er mye høyere enn for serum biomarkører (CA19-9 og CEA) i dag brukes, er det en lang vei å gå før sirkulerende mirnas som en klinisk diagnose brukes til å oppdage GC , fordi nivåene av et sirkulerende miRNA kan være vesentlig høyere eller lavere i forskjellige sykdommer. Fremtidige studier av sirkulerende miRNA biomarkører kan fokusere på å kombinere uttrykk profiler av sirkulerende mirnas fra alle vanlige sykdommer for å få de spesifikke biomarkører for unik sykdom deteksjon. Selv om Jianning Song [36] anbefales MIR-16 og MIR-93 som er egnet referanse gener for serum miRNA analyse for GC pasienter og friske kontroller, er utvalgsstørrelsen beskjeden. Normalisering metoder som brukes for å bestemme nivåer av sirkulerende mirnas bør være enhetlig.
I konklusjonen, identifiserte vi at tre plasma mirnas (MIR-223, MIR-21 og MIR-218) kan potensielt tjene som nye ikke-invasive biomarkører for GC deteksjon. Enten MIR-223 og MIR-21 har en evne til å oppdage tidlig stadium GC vil bli identifisert i fremtidige studier.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Validering av plasmanivået av MIR-25 i GC pasienter og friske kontroller. Box plott av plasmakonsentrasjoner av MIR-25 i pasienter (GC GC, n = 70) og friske kontroller (NC, n = 70). Linjene inne i boksene betegne medianverdier. Værhårene av boksplott: Min til Max. ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom GC pasienter og friske kontrollpersoner
doi:. 10,1371 /journal.pone.0041629.s001 plakater (TIF)
Tabell S1.
Den modne microRNAs og deres matchet primer /sonde AB analysen ID.
doi: 10,1371 /journal.pone.0041629.s002 plakater (docx)
Tabell S2.
Den konsentrasjonsverdier for de fire mirnas målt i plasma hos individer.
doi:. 10,1371 /journal.pone.0041629.s003 plakater (XLSX)
Takk
Vi takker Yun Zhao for teknisk support
