Abstract
Bakgrunn
benmetastaser er svært hyppige komplikasjoner av brystkreft. Nåværende bein metastase behandlinger med kraftige anti-resorbtive agenter er bare palliativ indikerer at faktorer som er uavhengige av benresorpsjon kontroll bein metastase progresjon. Autotaxin (ATX /NPP2) er et utskilt protein med både onkogene og pro-metastatiske egenskaper. Gjennom sin lysosphospholipase D (lysoPLD) aktivitet, styrer ATX nivået av lysofosfatidisk syre (LPA) i blodet. Blodplatederivert LPA fremmer utviklingen av osteolytiske benmetastaser av brystkreftceller. Vi spurte om ATX var involvert i beinmetastaseprosessen. Vi preget rolle ATX i osteolytic beinmetastase formasjon ved hjelp av genmodifiserte brystkreftceller utnyttes på ulike osteolytic bein metastasemusemodeller.
metodikk /hovedfunnene
Intravenøs injeksjon av menneskelig brystkreft MDA -B02 celler med tvungen uttrykk for ATX (MDA-B02 /ATX) til inmmunodeficiency BALB /C
naken
mus forbedret osteolytic beinmetastasedannelse, som bedømmes av økt bentap, tumor byrde, og et høyere antall aktive osteoklaster på metastatisk stedet. Mus brystkreft 4T1-celler indusert dannelse av osteolytiske benmetastaser etter intrakardial injeksjon hos immunkompetente BALB /C-mus. Disse cellene uttrykte aktiv ATX og stanse ATX uttrykk hemmet omfanget av osteolytiske lesjoner og redusert antall aktive osteoklaster i bein metastatisk nettstedet.
In vitro
, osteoclast differensiering ble forbedret i nærvær av MDA-B02 /ATX celle klimaanlegg media eller rekombinant autotaxin som ble blokkert av autotaxin inhibitor vpc8a202.
In vitro
, tilsetning av LPA til aktivkull-behandlet serum gjenopprettet kapasiteten av serum for å støtte RANK-L /MCSF-indusert osteoclastogenesis.
Konklusjon /Betydningen
uttrykk for autotaxin av kreftceller styrer osteolytic bein metastasedannelse. Dette arbeidet viser en ny rolle for LPA som en faktor som stimulerer direkte kreft vekst og metastasering, og osteoclast differensiering. Derfor rettet mot autotaxin /LPA spor fremstår som en potensiell ny terapeutisk tilnærming for å forbedre utfallet av pasienter med benmetastaser
Citation. David M, Wannecq E, Descotes F, Jansen S, Deux B, Ribeiro J , et al. (2010) Cancer Cell Expression of Autotaxin Controls Bone Metastase Dannelse i Mouse gjennom lysofosfatidisk Acid-Dependent Aktivering av osteoklaster. PLoS ONE 5 (3): e9741. doi: 10,1371 /journal.pone.0009741
Redaktør: Erik Danen, Leiden /Amsterdam Center for Drug Research, Leiden University, Nederland
mottatt: 14 januar 2010; Godkjent: 26 februar 2010; Publisert: 17 mars 2010
Copyright: © 2010 David et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra INSERM (OP og PC), Comité départemental de la Loire de la Ligue Nationale contre le Cancer (OP), den franske National Institute of Cancer, INCA (OP, kontrakt 0610-3D1616-102 /PL 2006 ) og den franske Association pour la Recherche sur le Cancer, ARC (OP). M.D. var en mottaker av fellesskap fra Ligue Nationale contre le Cancer. J.S. har en postdoktorstilling av Research Foundation – Flandern (FWO). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bone er en felles metastatisk område for mange kreftformer [1]. Benmetastaser er forbundet med hypokalsemi på grunn av beindestruksjon, umedgjørlig bensmerter og patologiske frakturer. Tumorceller som er tilstede på ben metastatisk området stimulere osteoklastmediert benresorpsjon, og ben-avledede vekstfaktorer frigjort fra resorberes ben fremme tumorvekst, som fører til utvikling av en ond sirkel. [2]. Dessverre, nåværende behandlinger med kraftige anti-resorptive agenter (bisfosfonater) unnlater å gi livsforlengende fordel for pasienter med skjelettmetastaser øke behovet for bedre kunnskap om de molekylære mekanismene som er involvert i denne patologi [3]. Vi har nylig funnet at lysofosfatidisk syre (LPA) avledet fra blodplater virker lokalt på tumorceller for å fremme utviklingen av benmetastaser [4]. Blant de celleoverflate spesifikke reseptorer for LPA (LPA
1-6) uttrykt av tumorceller, viste vi at LPA
en aktivitet rådet under beinmetastaser progresjon og at målretting denne reseptoren var en ny terapeutisk strategi mot benmetastaser [ ,,,0],5]. Men hvordan LPA genereres ved tumorstedet, og hvor LPA produsert av tumorcellene selv kan bidra til utviklingen av benmetastaser er fortsatt ukjent.
Autotaxin (ATX, NPP2) hører til nukleotid-pyrofosfat-fosfodiesterase (NPP ) familie [6]. I tillegg til den konserverte fosfodiesterase (PDE) aktivitet blant alle NPPs, har autotaxin en unik lysophospholipase D (lysoPLD) aktivitet, slik at genereringen av LPA fra lysofosfatidylcholin (LPC) [7]. forblir den biologiske betydning av PDE og lysoPLD aktiviteter i autotaxin funksjoner som skal bestemmes. Men den funksjonelle relevansen av den katalytiske aktiviteten til autotaxin
in vivo
ble nylig demonstrert fra knockout mus studier som viser at autotaxin er ansvarlig for nivåene av LPA i blodsirkulasjonen [8], [9]. En sammenheng mellom økt lysoPLD aktivitet og dannelse av LPA ble funnet i forskjellige patologier slik som reumatoid artritt [10], nevropatisk smerte [11], kronisk hepatitt C [12] og adipocyttdifferensiering insulinresistens i fedme [13]. Autotaxin er et glykoprotein først identifisert som en autokrin motilitet faktor utskilt fra humane melanomceller [14], [15]. Øket ekspresjon av autotaxin er vist å korrelere med økt invasivitet av brystkreftceller [16] og ble funnet å forbedre den metastatisk potensial av ras-transformerte 3T3 fibroblaster [17]. Ekspresjon av autotaxin mRNA ble detektert ved en basalnivået i nesten alle humane vev [18]. Intriguingly, oppregulering av autotaxin-genet ble rapportert i en stor rekke kreftformer, slik som glioblastoma [19], aggressiv neuroblastom [20], ikke-småcellet lungekreft [21], uveal melanom assosiert med dårlig prognose [22], thyroid karsinom [23 ], leverkreft med metastaser [24], og brystkreft [16]. MMTV-
ATX
transgene mus med spesielt økt uttrykk av autotaxin i melkekjertlene, viste en økt i forekomst av spontane svulster på melkekjertler over en to-års periode, illustrerer den pro-onkogene funksjon autotaxin [25].
Her gir vi eksperimentelle bevis for at brystcancerceller som uttrykker autotaxin har en selektiv fordel for å indusere dannelsen av osteolytiske benmetastaser som et resultat av en ny pro-osteoklastisk funksjon av autotaxin-avledede produkt LPA. Disse resultatene illustrerer rolle autotaxin i avansert brystkreft, og foreslår at målretting autotaxin /LPA spor kan gi ekstra fordel for pasienter som lider av skjelettmetastaser.
Resultater
De novo
autotaxin uttrykk øker spredning og invasjon av menneskelige MDA-B02 brystkreft celler
in vitro
Vi har vist tidligere at MDA-B02 celler ikke uttrykker autotaxin ved steady state [4]. For å vurdere hvorvidt autotaxin spiller en rolle i metastase spredning av brystkreftceller, introduserte vi cDNA av rotte autotaxin i MDA-B02 celler. Vi brukte Tet-Off-regulert ekspresjon system i hvilket autotaxin uttrykk sammen med luciferase oppnås spesielt i fravær av repressoren, doksycyklin [4]. Som en unik medlem av NPP familien, autotaxin utstillinger både lysoPLD og fosfodiesterase aktiviteter [26], [27]. Derfor, som en kontrollcellelinje transfektert vi MDA-B02-celler med en ekspresjonsvektor som koder for mus NPP1, som virker som en nukleotid-fosfodiesterase, men som mangler for lysoPLD aktivitet.
For hver konstruksjon, valgte vi to stabile kloner: MDA-B02-ATX klone no. 30 og no. 38, og MDA-B02-NPP1 kloner no. 10,5 og no. 42. ekspresjon av autotaxin som et utskilt protein og NPP1 som et membranbundet protein ble bekreftet ved Western-blotting ved anvendelse av spesifikke antistoffer (figur 1A). Clone valg var basert på høy luciferaseekspresjon i fravær av doksycyklin (figur 1B). Som forventet, ble det observert at i fravær av doksycyklin bare MDA-B02-ATX-kloner skaffet seg en lysoPLD aktivitet (figur 1 B), mens begge MDA-B02-ATX og MDA-B02-NPP1 kloner hadde en økt PDE-aktivitet, sammenlignet . foreldre celler (figur 1B)
(A) celler transfektert med toveis ekspresjonsvektorer pBiL-ATX eller pBil-NPP1 ble belagt med (+) eller uten (-) doksycyklin (Dox). Proteiner fra kondisjonert medium (CM) eller lysater av tumorceller (CL) av to stabile kloner (nr. 30 og nr. 38 til ATX, nr. 10.5 og nr. 42 til NPP1) ble electrophorezed deretter immunoblottet med et anti-ATX-antistoffet (venstre panel) eller anti-Myc antistoff (Høyre panel). (B) Kvantifiseringen av luciferase aktivitet (venstre panel), lysoPLD aktivitet (Middle panel) og PDE aktivitet (høyre panel) i hver klon og foreldre MDA-B02 celler. (C) Celleproliferasjon ble stimulert med LPC (10 uM) i fravær eller nærvær Ki16425 (10 uM). Resultatene er uttrykt som% av BrdU-inkorporering i forhold til ustimulerte MDA-B02 parentale celler. Data tilsvarer gjennomsnittet ± SD av 6 replikater og er representative for minst 3 uavhengige eksperimenter. (D) Celle invasjon ble stimulert med 10% FBS anvendt som kjemotiltrekkende. Resultatene er gjennomsnittet ± SD av celler av 3 replikater og er representative for minst 3 uavhengige eksperimenter. Data er uttrykt som antall celler /mm
2. *,
P
0,05. **
P
0,01
Vi har tidligere vist at behandling med LPA øker spredning av MDA-B02 celler [4]. Her, observerte vi at, i fravær av doksycyklin, LPC hadde en mitogen aktivitet av seg selv på både paren MDA-B02 celler og transfekterte kloner (figur 1C). Dette funn kan reflektere uttrykk LPC reseptorer (GPR4, TDAG8) i MDA-B02 celler samt i brystsvulster [28]. Imidlertid LPC-avhengig proliferasjon ble ytterligere øket i MDA-B02-ATX-celler, men ikke i MDA-B02-NPP1 celler eller parentale celler. Dessuten er behandling av cellene med Ki16425, en antagonist av LPA
1 og
3-reseptorer, helt blokkert autotaxin avhengig, men ikke LPC-avhengig celleproliferering (figur 1C). Dette indikerte at rekombinant ATX uttrykt av MDA-B02-ATX celler produseres aktiv LPA som stimulerte celleproliferasjon gjennom en LPA
1-3 reseptor-avhengige veien.
Autotaxin har vært innblandet i invasivitet av ras- transformerte fibroblaster og brystkreftceller [16], [17]. Vi har observert at i fravær av doksycyklin, MDA-B02-ATX-kloner hadde en signifikant høyere evne til å invadere Matrigel ™ som reaksjon på FBS enn i nærvær av doksycyklin (figur 1D). Forsterkningen av invasivitet av MDA-B02-ATX-kloner ble også observert når sammenlignet med parentale celler og MDA-B02-NPP1 kloner som er lagt enten i fravær eller nærvær av doksycyklin. Disse resultatene bekrefter at autotaxin økt invasiv potensialet av brystkreft celler ved en mekanisme som krevde sin lysoPLD aktivitet.
De novo
autotaxin uttrykk forbedrer
in vivo
MDA-B02 benmetastase dannelse
Vi har tidligere vist at LPA avledet fra blodplater støtter utviklingen av benmetastaser mediert av MDA-B02-celler i mus [4]. Vi antok at forhøyet tumorcelle-avledet lysoPLD aktivitet kan også fremme bein metastasering. Tretti to dager etter intravenøs inokulering av tumorceller inn i
nakne mus
, radiografiske analyser viste at dyr som bærer MDA-B02-ATX-kloner oppviste en 40% til 70% økning i omfanget av osteolytiske lesjoner, sammenlignet som sett med MDA-B02-NPP1 kloner og foreldre celler (Figur 2A). Histologiske undersøkelser og histomorphometric analyser bekreftet røntgenobservasjoner og viste at
de novo
uttrykk for autotaxin av brystkreftceller resulterte i en reduksjon av beinvolum (BV /TV) og økt skjeletttumorbelastning (Figur 2A). Vi observerte ingen forskjell på beina av metastatiske dyr som bærer MDA-B02-NPP1 kloner sammenlignet med MDA-B02 foreldreceller ved histologisk nivå (figur 2B). Vi har tidligere vist at LPA stimulerer styrken av tumorceller for å øke rekrutteringen av osteoklaster på ben metastatisk området [4]. Her observerte vi at overflaten av aktive osteoklaster per trabekulært ben område som ligger på bein /svulst celle grensesnitt ble økt i dyr som bærer MDA-B02-ATX kloner, sammenlignet med det som ble observert i mus med foreldrenes eller NPP1-uttrykker tumorceller ( Figur 3).
(A) (venstre panel) Representative røntgenbilder av baklemmene fra metastatisk mus med MDA-B02 celler eller MDA-B02-ATX klone no. 30 eller MDA-B02-NPP1 klone no. 42, 29 dager etter tumorcelle vaksinasjon. Osteolytiske lesjoner er indikert med piler (Målestokk: 0,5 cm). (Høyre panel) Kvantifisering av osteolytiske lesjoner områder på røntgenbildene i metastaserende dyr. Data tilsvarer gjennomsnitt ± SE av to uavhengige eksperimenter med 7 til 10 dyr per gruppe. (B) (venstre panel) Representant benhistologi av Goldner er Trichrome-farget tibial metafyse fra metastaserende dyr. Bone er farget i blått; benmarg og kreftceller er farget i rødt. (Skala bar: 1 mm). (Høyre panel) Histomorphometric analyse av metastatisk bakbena ved hjelp av beinvolum /vev volum rasjon (BV /TV, svarte striper og venstre akse) og svulsten volum /vev volum ratio (TumV /TV, åpne barer og høyre akse) som referansegruppe. Verdier er gjennomsnitt ± SE av 7-10 dyr per gruppe representative for to uavhengige eksperimenter. *,
P
. 0,05
(Øvre venstre panel) Representant immunhistokjemi undersøkelse av proksimale tibia seksjoner fra metastatisk dyr 29 dager etter tumorcelle vaksinasjon, ved hjelp av anti-ATX antistoff 4F1. T viser tumorceller. (Nederst til venstre paneler) Representant histologisk undersøkelse av trap-farget proksimale tibia seksjoner fra metastaserende dyr. T viser tumorceller. Bone er farget i mørk blå og osteoclats er farget i rødt (piler). (Høyre panel) Kvantifisering av aktiv-osteoklastresorpsjonstest overflate per trabekulært ben overflate (Oc.S /BS). Resultatene er middelverdien ± SE av 8-9 dyr per gruppe. *:
P
0,05. Skala barer:.. 200 mikrometer
Til sammen våre resultater indikerte at økt uttrykk av autotaxin av MDA-B02 celler forbedret dannelsen av osteolytiske benmetastaser
nedregulering av autotaxin uttrykk hemmer invasjon men ikke spredning av mus 4T1 brystkreftceller
for å ta rollen som autotaxin i beinmetastase formasjonen i en immunkompetente sammenheng, vi utnyttet den 4T1 cellelinje som er avledet fra et enkelt musebrysttumor og rekapitulerer de forskjellige trinnene av metastaser når podet inn i melkekjertelen av syngene BALB /c-mus [29]. For det første har vi funnet at 4T1 celler uttrykte mRNA av alle former for LPA reseptorer og svart på LPA stimulering (Figur 4A og 4B). I tillegg fant vi at 4T1 celler uttrykte autotaxin transkripsjon og protein (figur 4A og 4C), sto for utskillelsen av en enzymatisk aktiv autotaxin protein (figur 4C). For å analysere funksjonen av endogene ekspresjon av autotaxin av brystkreftceller i beinmetastasedannelse vi brukte RNA interferens Fremgangsmåte for å etablere en serie av tre kloner av 4T1 celler med stabilt nedregulert autotaxin uttrykket (4T1-siATX), sammen med tre styre 4T1 kloner med uendret uttrykk for autotaxin (4T1-sbATX) (figur 4C). Etter individuell karakteristikk av hver klon for nivåene av protein uttrykk og lysoPLD aktiviteter, påfølgende
in vitro Hotell og
in vivo
Forsøkene ble utført ved hjelp av bassenger av de tre kloner for 4T1-siATX og de 4T1-sbATX cellelinjer, henholdsvis.
(A) RT-PCR-amplifiseringsprodukter på LPA-reseptorer, LPA
1 (1), LPA
2 (2), LPA
3 (3), LPA
4 (4), LPA
5 (5), GPR87, P2Y5, og autotaxin (ATX) fra 4T1 celler total RNA ble analysert på en 2% agarosegel. MW, molekylvekt markør. (B) Cell invasjonen ble stimulert med økt LPA konsentrasjoner brukes som kjemotiltrekkende. Resultatene er gjennomsnittet ± SD av celler av 3 replikater og er representative for minst 3 uavhengige eksperimenter. Data er uttrykt som antall celler /mm
2. (C) Autotaxin uttrykk i 3 kloner av 4T1 celler transfektert med en pStrike vektor som koder for enten irrelevant liten hårnål RNAi (sbATX, kloner nr. 14, nr. 16, nr. 20) eller en bestemt liten hårnål RNAi (siATX, kloner nei. 1, nr. 17, nr. 52). (Øvre panel) Immunoblotting hjelp av anti-ATX polyklonale antistoff eller anti-? Tubulin som lasting kontroll. (Nedre panel) lysoPLD aktivitet (pmol LPA /ml) målt i cellekultur klimaanlegg medier. (D) Celleproliferasjon bedømt ved BrdU-inkorporering av 4T1-celler og en pool av tre 4T1-sbATX kloner (nr. 14, nr. 16, nr. 20) eller tre 4T1-siATX kloner (nr. 1, nr. 17, no . 52), i respons til økte konsentrasjoner av LPC. Resultatene er uttrykt i gjennomsnitt ± SD av 6 replikater og er representative for 3 skiller eksperimenter. (E) Invasion assay. Celler ble anbrakt i nærvær eller fravær av LPA (0,1-1 uM) i det øvre kammer og FBS anvendt som kjemoattraktant, ble plassert i det nedre kammer. Resultatene er gjennomsnittet ± SD av 3 replikater og er representative for minst 3 uavhengige eksperimenter. Data er uttrykt som antall celler /mm
2. *,
P
. 0,05
Som tidligere observert for MDA-B02 celler
in vitro plakater (figur 1C), LPC viste en mitogen handling på 4T1 celler (Figur 4D). Imidlertid stanse av autotaxin uttrykk endret ikke proliferasjonen av 4T1-siATX celler sammenlignet med det som ble observert for kontroll og foreldrecellelinjer (figur 4D). Dette resultatet var ganske overraskende og kan bli konsekvensen av den gjenværende lysoPLD aktivitet i 4T1-siATX kloner. En alternativ forklaring er at proliferasjonen av 4T1-celler ble allerede maksimalt stimulert av LPC. I motsetning til ved hjelp av Transwell migrasjon kamre belagt med Matrigel ™, observerte vi at kneble autotaxin uttrykk hemmet FBS-drevet invasjon av 4T1-siATX celler (Figur 4E). Denne inhibering ble overvunnet ved tilsetning av LPA inn i cellen avdeling av migrerings kamre som viser at invasjon av 4T1-celler ble kontrollert ved å autotaxin gjennom lysoPLD aktivitet.
Nedregulering av endogent autotaxin ekspresjon i 4T1-celler inhiberer osteolytisk bein metastasedannelse uavhengig av primær tumorvekst
in vivo
for å finne ut om endogen uttrykk for autotaxin i brystkreftceller var viktig for bein metastasedannelse, 4T1-siATX og kontroll cellelinjer ble injisert inn i venstre ventrikkel i hjertet av kvinnelige syngene BALB /C-mus. Denne strategien gjør det mulig å omgå lungene og å målrette cellene til andre viscerale organer og bein. To uker etter inokulering celle, radiografiske analyser viste at dyr som bærer 4T1-celler siATX hadde en 50% reduksjon i omfanget av osteolytiske lesjoner, sammenlignet med dyr injisert med 4T1-sbATX eller 4T1 parentale celler (Figur 5A). Histologiske analyser viste at overflaten av aktive osteoklaster pr trabeklære ben område som ligger på benet /tumorcelle grensesnitt ble betydelig redusert hos dyr som bærer 4T1-siATX-celler, sammenlignet med det som ble observert i mus som bærer sperre eller 4T1-sbATX tumorceller (figur 5B ). Vi har tidligere vist at LPA produseres i svulsten mikromiljøet av blodplater [4]. For å analysere rollen til endogent autotaxin på brystkreftceller
in vivo
uavhengig av benet mikromiljøet, ble 4T1-siATX og kontrollcellelinjer inokulert i fettpute av kvinnelige syngene BALB /C-mus. Etter to uker, noe som tilsvarte den samme tidsrammen av tumorvekst enn det som brukes for bein metastase eksperimenter, ble primære svulster samlet. Vi har observert at stanse autotaxin uttrykk endret ikke veksten av primære tumorer fordi det ikke var noen signifikant forskjell i størrelsen på 4T1-siATX tumorer, sammenlignet med de av 4T1-sbATX og foreldre tumorer (figur 6A).
In situ
immundeteksjon av Ki-67 atom antigen i tumorsnitt viste ingen forskjell i spredning av 4T1-siATX og kontrollceller (Figur 6b). Til sammen disse resultatene indikerte at endogen uttrykk for autotaxin kontrollert beinmetastasedannelse, men ikke veksten av 4T1 celler
in vivo
.
(A) (venstre panel) Representative røntgenbilder av baklemmene fra BALB /C-mus 14 dager etter intrakardial injeksjon av 4T1 parentale celler eller bassenger av 4T1-sbATX kloner (nr. 14, nr. 16, nr. 20) eller 4T1-siATX kloner (nr. 1, nr. 17, nr. 52) . Osteolytiske lesjoner er indikert med piler. (Høyre panel) Kvantifisering av osteolytiske lesjon områder. Verdier er uttrykt som% av lesjon områder sammenlignet med foreldre 4T1 celler. Data tilsvarer gjennomsnitt ± SE av to uavhengige eksperimenter av 8 til 10 dyr per gruppe. *,
P
0,05. (B) (Venstre øvre panelene) Representant immunhistokjemi undersøkelse av proksimale tibia seksjoner fra metastatisk dyr 14 dager etter tumorcelle vaksinasjon, ved hjelp av anti-ATX antistoff 4F1. T viser tumorceller. (Nederst til venstre paneler) Representant histologisk undersøkelse av trap-farget proksimale tibia seksjoner fra metastaserende dyr. T viser tumorceller. Bone er farget i mørk blå og osteoclats er farget i rødt (piler). (Høyre panel) Kvantifisering av aktiv-osteoklastresorpsjonstest overflate per trabekulært ben overflate (Oc.S /BS). Resultatene er gjennomsnitt ± SE av 8-10 dyr pr gruppe. *:
P
0,05. Skala barer: 200 mikrometer
4T1 foreldreceller, 4T1-sbATX kloner og 4T1-siATX kloner ble injisert i melkekjertlene av normale syngeniske kvinnelige BALB /C mus.. Ved dag 14 ble primærtumorer resekterte, og veiet. (A) Boksplott representerer tumor vekt (i mg). (B) Primære tumorer ble innstøpt i parafin. Tumor vevssnitt ble analysert ved mmunohistochemistry hjelp av et spesifikt antistoff rettet mot den kjernefysiske ki-67-antigenet. Den mitotiske indeksen (tall i hvert panel) ble beregnet som prosentandelen av positive kjerner for ki-67 (resultatene er gjennomsnittet ± SD, Målestokk: 50 um). (C) Dyrene ble avlivet 35 dager etter tumorcelle injeksjon og lungene ble samlet for å kvantifisere spontant metastase dannelsen av 4T1 celler. (øvre panel) representative bilder av lungevev seksjoner farget med eosin. (Nedre panel) Kvantifisering av lungemetastaser foci. Antallet metastaser ble nummerert i henhold mikroskop. P 0,05. T viser metastaser. Skala:. 200 um
For å analysere evnen av endogent autotaxin for å understøtte dannelsen av spontane metastaser av 4T1-celler
in vivo
,-celler ble injisert inn i melkefett pute av BALB /C-mus. Primære tumorer ble dyrket i to uker, ved hvilket tidspunkt de ble resekterte, slik at fremveksten av spontane metastaser. Tre uker etter reseksjon av primære tumorer, ble dyrene avlivet. Lungene ble samlet, med fast og innebygd i parafin. Lunge vevssnitt ble undersøkt under et mikroskop for tilstedeværelse av metastatiske foci. Vi fant ut at mus inokulert med 4T1-siATX cellene hadde et betydelig lavere antall lungemetastaser (80% reduksjon) sammenlignet med mus inokulert med 4T1 foreldre celler (figur 6C).
Til sammen disse dataene indikerte at ekspresjon av endogen autotaxin kontrollert kapasiteten 4T1 brystkreft celler for å metastasere, og for å indusere dannelsen av osteolytiske benmetastaser uavhengig av celleproliferasjon.
ekspresjon av autotaxin mRNA i primære tumorer i pasienter med brystkreft
Vi spurte om virkningene av autotaxin uttrykk observert i mus prekliniske modeller for brystkreft kan korrelere med sykdom hos mennesker. Vi analyserte ekspresjonen av autotaxin uttrykke genet (
ENNP2
) av sanntids-kvantitativ PCR i en serie av 167 brystkreft biopsier fra pasienter uten (n = 145) eller med (n = 22) som er identifisert ved metastaser diagnosetidspunkt. Vi har observert at ekspresjon av
ENPP2
normalisert til genene som koder for ribosomalt protein L32 (L32) eller TATA-boks bindende protein (TBP, data ikke vist), ble ikke signifikant endret i pasienter med ben eller metastaser bløtvev ved tidspunktet for diagnose, sammenlignet med ikke-metastaserende pasienter (figur 7). Vi har også funnet tilsvarende nivåer av
ENPP2
mRNA i primære svulster i ikke-metastaserende pasienter som hadde utviklet bein eller metastaser bløtvev over en femårsperiode (figur 7). Deretter undersøkte vi uttrykket for
ENPP2
i forhold til de kliniske, patologiske og biologiske egenskaper, som definert i tabell 1. Vi har funnet at selv om de absolutte median-verdier for
ENPP2
transkripsjonsnivåer ble konsekvent økt sammen med egenskapene til fattige prognostics, gjorde forskjellene ikke nå statistisk signifikans. Dette indikerte at uttrykket av
ENPP2
i primære svulster i brystkreftpasienter var uavhengig av tumorstørrelsen, klasse, node, østrogen reseptor (ER) og progesteron reseptor (PGR) status (tabell 1).
Total RNA ble ekstrahert fra primær bryst svulst biopsi av pasienter uten eller med metastaser på diagnosetidspunktet. Myk og Bone representerer undergrupper av metastatiske pasienter med bløtvev bare og skjelettmetastaser, henholdsvis. W /O Rec representerer en undergruppe av ikke-metastaserende pasienter uten tilbakefall av metastaser i løpet av en femårsperiode. Myk Rec og Bone Rec representerer undergrupper av pasienter med tilbakefall av metastaser til bare og bein over en fem års periode, henholdsvis mykt vev. n angir antall pasienter i hver gruppe. Uttrykk for Enpp2 /ATX mRNA ble målt ved real-time kvantitativ av real time PCR. Kvantifiseringen ble normalisert til tilsvar L32 RNA verdier. Data er gitt som boksplott med medianen. Boksen omfatter 25
th 75
th persentiler. Den 5
th persentilene vises som feilfelt.
LPA kontrollerer direkte osteoclast differensiering
Vi viste tidligere at LPA øker potens av kreftceller til å indusere differensiering av osteoklaster
in vitro
og deres rekruttering
in vivo
på beinmetastatisk stedet [4].
In vitro
, klimaanlegg media samlet inn fra MDA-B02-ATX kloner betydelig forbedret differensiering av modne osteoklaster fra benmarg celleforløpere, sammenlignet med kondisjonert medium fremstilt fra foreldre celler eller MDA-B02-NPP1 kloner (figur 8A). Videre rekombinant autotaxin økt betydelig M-CSF /RANK-L-indusert osteoclast differensiering
in vitro plakater (8B). For å avgjøre om effekten av autotaxin var på grunn av sin lysoPLD aktivitet, brukte vi en β-substituert analog LPA (vpc8a202) beskrives som en spesifikk hemmer [30]. Vi observerte at vpc8a202 hemmet autotaxin avhengige økt osteoclastogenesis fra benmargceller behandlet med M-CSF og RANK-L (Figur 8B). Vi viste tidligere at LPA kontrollerer indirekte brystkreftcelle-induksjon av osteoclastogenesis gjennom sekresjon av pro-osteoklastisk cytokiner, IL-6 og IL-8, ved tumorceller [4]. Serum er nødvendig for full osteoclast differensiering ved stimulering osteoklast forløpere med M-CSF /RANK-L
in vitro product: [31]. Serum inneholder store mengder av både LPA LPC og [32]. Derfor våre resultater antydet at LPA generert av autotaxin i nærvær av serum kan styre direkte osteoclast differensiering. For å teste denne hypotese, behandlet vi føtalt bovint serum med aktivt kull for å fjerne alle lipidfraksjoner. Vi observerte at lipid-utarmet serum var ikke i stand til å støtte osteoclastogenesis indusert av M-CSF /RANK-L (figur 8C). Denne hemmende virkning på lipid-utarmet serum ble reddet ved tilsetning av renset LPA i kulturmediet (figur 8C). Dette resultat indikerte at LPA var nødvendig for serum /M-CSF /RANK-L indusert osteoclastogenesis.
(A) Benmarg-celler ble dyrket i nærvær av FBS (10%), mus M-CSF, RANK- L og MDA-B02 celle eller MDA-B02-ATX klone # 30 eller MDA-B02-NPP1 klone # 10,5 betinget media. (B) Benmarg-celler ble dyrket i nærvær av FBS (10%), mus M-CSF, RANK-L og rekombinant ATX, i fravær (-) eller nærvær av økende konsentrasjoner av inhibitor ATX, vpc8a202. (C) Benmarg-celler ble dyrket i nærvær av mus M-CSF, RANK-L og FBS (kontroll) eller lipid-utarmet FBS (Dep. FBS) i fravær eller nærvær av 1-oleoyl-LPA (1 uM). (venstre panel) Representative bilder av multinucleated celler farget for TRAP aktivitet. (Høyre panel) Kvantifisering av osteoclast tall var basert på multinucleation av trap-positive celler. Resultatene er gjennomsnittet ± SD av 3 separate eksperimenter. *:
P
0,05. Skala barer: 200 mikrometer
Diskusjoner
I denne studien har vi vist at uttrykk for autotaxin kontrollert progresjon av osteolytiske benmetastaser indusert av brystkreft celler.. Vi viste tidligere at lysofosfatidisk syre (LPA) fremstilt i svulsten mikromiljøet styrer utviklingen av osteolytiske benmetastaser av brystcancerceller og streket den viktige rollen av blodplater i denne prosessen [4]. Imidlertid, de molekylære mekanismene som er involvert i produksjonen av LPA og den direkte rolle LPA på benceller ved benet metastatisk området er fortsatt ukjent. Knockout dyr analyser avslørte at autotaxin regulerer nivåene av LPA i blodsirkulasjonen [8], [9]. Tvunget ekspresjon av autotaxin i humane brystkreft MDA-B02-celler økte dannelsen av osteolytiske benmetastaser hos mus, mens knockdown ekspresjon av endogen autotaxin i musebrysttumor 4T1 celler reduserte omfanget av osteolytiske lesjoner. Det er kjent i to tiår at blodplater er en rik kilde til LPA i serum [33], [34]. Imidlertid Aoki gruppe vist at LPA frigjøres direkte ved blodplater utgjør bare en liten del av serum LPA [32]. Blodplatederivert LPA fremstilles hovedsakelig ved virkningen av plasma lysophospholipase D (f.eks autotaxin) på LPA-forløpere (LPC, lysfosfatidyl-etanolamin, og lysophosphatidylserine) utgitt av aktiverte blodplater [32].
