Abstract
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) svulst DNA er preget av kromosomskade betegnes kromosom ustabilitet (CIN) og overdrevent kortere telomerer. Opp til 80% av CRC er mikro stabil (MSS) og er historisk ansett for å være ustabil kromosomalt (CIN +). Men viser tumor fenotyping noen MSS CRC med liten eller ingen genetiske endringer, og dermed blir kromosomer stabil (CIN-). MSS CIN- svulster er ikke vurdert for telomere avgang.
Experimental Design
MSS endetarms kreft fra pasienter ≤50 år med Stage II (B2 eller høyere) eller Stage III sykdom ble vurdert for CIN, telomerlengde og telomere vedlikehold mekanisme (telomerase aktivering [ ,,,0],TA]; alternativ forlengelse av telomerer [ALT]). Relativ telomerlengde ble målt ved qPCR i somatiske og epitelial cancer DNA. TA ble målt med trapes-analysen, og tumorer ble vurdert med hensyn til nærvær av C-kretsene som indikerer ALT. p53 mutasjon status ble vurdert i alle tilgjengelige prøver. DNA kopiantall endringer ble evaluert med Spectral Genomics aCGH.
Resultater
Svulster ble klassifisert som kromosomer stabil (CIN-) og kromosomer ustabil (CIN +) etter grad av DNA kopinummerendringer. CIN- tumorer (35%, n = 6) hadde færre kopitall forandringer ( 17% av deres kloner med DNA-kopi antall forandrer) enn CIN + tumorer (65%; n = 13) som hadde høye nivåer av kopiantall endringer i 20% til 49% av klonene. Telomere lengder var lengre i CIN- sammenlignet med CIN + tumorer (p = 0,0066), og i de hvori telomerase ble ikke aktivert (p = 0,004). Svulster stiller aktivering av telomerase hadde kortere kreft telomerer (p = 0,0040); og tendens til å være CIN + (p = 0,0949).
Konklusjoner
MSS kreft i endetarmen synes å representere en heterogen gruppe av tumorer som kan kategoriseres både på basis av CIN status og telomere vedlikehold mekanisme . MSS CIN- endetarms kreft synes å ha lengre telomerer enn de av MSS CIN + endetarms kreft og for å utnytte ALT stedet for aktivering av telomerase.
Citation: Boardman LA, Johnson RA, Viker KB, Hafner KA, Jenkins RB, Riegert-Johnson DL, et al. (2013) Korrelasjonen av kromosom Ustabilitet, telomerlengde og telomere vedlikehold i mikro Stabil Rektal kreft: En Molecular underklasse av endetarms kreft. PLoS ONE 8 (11): e80015. doi: 10,1371 /journal.pone.0080015
Redaktør: Michel M Ouellette, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: May 30, 2013; Godkjent: 27 september 2013; Publisert: 21.11.2013
Copyright: © 2013 Boardman et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av National Cancer Institute (R01 CA132718 og P50 CA102701 Mayo Clinic SPORE i bukspyttkjertelen); National Institute of Diabetes og Digestive og nyre sykdommer (P30 DK084567 Mayo Clinic Senter for Cell Signaling i Gastroenterology); den Lustgarten Foundation for kreft i bukspyttkjertelen; og ved Mayo Clinic Senter for Individualisert Medicine. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) kan deles inn i svulster stiller kromosom ustabilitet (CIN +) kontra de med intakt karyotype og kromosom stabilitet (CIN). Konvensjonelt, bare svulster med mangelfull DNA mismatch reparasjon (dMMR), ellers kjent som mikro ustabile svulster, (MSI (H)), ble antatt å være CIN-, og CIN + tumorer ble antatt å ha intakt dMMR og være mikro stabil (MSS) . Imidlertid har flere studier vist at opptil 50% av MSS svulster er CIN-, og en betydelig, men mindre del av MSI (H) kolorektal tumorer er CIN + [1,2]. Selv om MSI (H) kolorektal kreft er forbundet med en bedre prognose enn MSS tumorer, har nyere studier indikerer at nivået av kromosomal ustabilitet, snarere enn mikro status, er det nyttig prognostisk markør [3]. Spesifikke fenotyper knyttet til MSS CIN- subtype omfatter dårlig tumor differensiering, mucinous histologi og en lavere rate av p53 mutasjoner [1,4]. Videre CRC som oppstår i yngre alder ( 50 år) er mer sannsynlig å være MSS diploid, med diploidy være en surrogat mål på kromosom stabilitet. Kromosomer stabil (CIN-) mikro stabil (MSS) CRC er en relativt ny klassifisering av CRC som gir en annen forståelsesramme trasé bak denne kreft.
Kortere telomerer har vært knyttet til kromosom ustabilitet (CIN) i innstillingen av aldersrelaterte sykdommer forbundet med genetisk forstyrrelse og kreftutvikling [5]. Telomerer består av gjentatte TTAGGG sekvenser som beskytter endene av lineære kromosomer fra å bli forlatt sårbare for skader, og dysfunksjonelle forkorting av telomerer har vært innblandet som forløperen til kromosom ustabilitet. Kritisk korte telomerer avsløre kromosomendene, engasjere DNA skade respons, og fremskynde ende-til-ende fusjoner og rekombinasjon. Primære mammary epitelceller med kortere telomerer er oftere involvert i mis-segregering hendelser og viser ikke bare kromosom rearrangements men også numeriske kromosomforandringer [6], som indikerer at kortere telomerlengde kan muliggjøre utvikling av CIN. Telomer-lengden på DNA fra MSS CIN- svulster er ikke vurdert.
Telomerer kan forlenges ved aktivering av ribonucleoprotein revers transkriptase heter telomerase [7] .. Telomerase aktivering er til stede i mange kreftformer. Kritisk forkortede telomerer normalt starte celle senescence og apoptose og stoppe spredning av celler som inneholder betydelig skadet DNA. Telomerase-aktivering kan effektivt å udødeliggjøre kreftceller ved å gjenopprette nok telomerlengde for å beskytte den numerisk /og strukturelt endret DNA fra å bli nøytralisert av DNA-skade respons og gjennomgår cellebegynnende alderdom. En annen vei av telomer-vedlikehold ved hjelp av hvilken telomerer kan omdirigeres fra begynnende alderdom er via alternativ forlengelse av telomerer (ALT), som er en homolog rekombinasjon basert mekanisme som bruker et DNA-templat for å bevare telomerlengde [8].
søkt å finne ut om tydelig telomere vedlikehold bane (r) vil korrelere med nærværet eller fraværet av CIN i MSS endetarmskreft. For ytterligere å klargjøre fenomenet MSS CIN- forhold til CIN + endetarmskreft, benyttet vi rekke CGH (aCGH) for å vurdere svulster for strukturelle kromosom og sub-kromosomale genetiske endringer.
Som vår tidligere studie fant at nesten 50% av unge utbruddet MSS CRC saker som oppsto i proksimale colon eller i endetarmen var diploid ved flowcytometri [9], studerte vi bare unge alder utbruddet saker og fokusert på endetarms kreft lignende scene. Vi målte telomerlengde i tilsvarende perifert blod leukocytter, normal tilstøtende tykktarm og endetarmskreft DNA og vurdert endetarmskreft DNA for telomerase aktivering og ALT for å finne ut om noen av de to viktigste mekanismene for telomere vedlikehold ville korrelerer med graden av CIN i ung utbruddet MSS endetarmskreft.
Metoder
Prøve utvelgelse og foredling
Denne studien ble godkjent av Mayo Clinic Institutional Review Board. Vi inkluderte endetarmskreftpasienter fra tre kilder: (1) Biobank for Gastrointestinal Health Research, et prospektivt register består av kommenterte biospecimens fra personer med CRC som hadde evaluering ved Mayo Clinic i Rochester, MN fra april 2000 til august 2005, og som samtykket til å være i depotet; (2) endetarmskreft fra et prospektivt samlet serie CRC pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon ved Mayo Clinic (Rochester, Minnesota) fra desember 1995 til april 1997 [10] og (3) en prospektiv serie CRC pasienter som gjennomgikk kirurgi fra 1987 ved 1988 [11]. Vi valgte 19 deltakere med MSS endetarms kreft med debut i en alder ≤50 år gammel og som var enten stadium II (B2 eller høyere) eller trinn III. Kun de med blod og /eller normale kolonepitelet og tumorprøver samlet før enhver kjemoterapi eller radioterapi ble utvalgt for denne undersøkelsen. DNA ble ekstrahert fra perifere blod leukocytter ved hjelp av Gentra AutoPure utsal kjemi (Gentra, Minneapolis, MN, USA) og kvantifisert ved UV-absorbans. DNA-kvalitet ble vurdert ved 260/280-forholdet optisk tetthet. MSI status ble målt ved hjelp av en kombinasjon av immunhistokjemi og PCR basert analyse av MSI. Immunhistokjemisk farging for MLH1, MSH2, MSH6 og PMS2, og mikro ustabilitet testing ble utført som tidligere beskrevet [12]. Mikro markører BAT26, D17S250; D5S346; ACTC, BAT40, BAT 25, BAT 34C4, D10S197, MYCL, og D18S55 ble benyttet for å vurdere MSI status, og en svulst ble kalt MSS hvis ingen av markørene viste MSI og alle immunostains viste intakt uttrykk for MMR proteiner [13].
svulstvev behandling og DNA-ekstraksjon for utvalg CGH
Frosne vevsprøver ble brukt til CGH matrisestudier. Full tykkelse tumor og normale colonic epithelial vev ble skåret ut fra kirurgiske prøver, hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -70 ° C. Tissue snitte ble utført i en kryostat ved -20 ° C. Tumorvev var makro dissekert for å anrike for tumortetthet (mer enn 70% tumor kjerner). I korthet ble et 6 mikron tykt frosset tumor seksjon farget med hematoksylin og eosin og merket som en guide lysbilde av vår patolog (TCS) for å identifisere områder som inneholder ≥ 70% tumorcellekjerner. Dette lysbildet ble deretter brukt til å identifisere den delen av den tilsvarende frosne tumor blokk med bare området øremerket med 70% tumor tetthet blir snitt som skal benyttes som tumorvevet kilde for DNA. Medfølgende normal kolon mukosa, minst 8 cm fra svulsten margin, ble microdissected for epitelvev. Snittene ble plassert i ekstraksjonsbuffer og genomisk DNA ble ekstrahert fra tumor eller normal tykktarm epitel DNA ved hjelp av fenol /kloroform-ekstraksjon og kvantifisert ved UV-absorbans, og DNA-kvalitet ble bestemt ved 260/280-forholdet optisk tetthet. I alle tilfellene ble DNA ekstrahert fra kjemoradioterapi naive endetarmskreft.
Array CGH
aCGH ble utført ved hjelp av Spectral Chip ™ 2600 (Spectral Genomics, Houston, Texas) som inneholder 2600 BAC kloner flekket i duplikat. Både forover og bakover merking eksperimenter ble gjort for hver tumorprøver. Merking og hybridisering ble utført i henhold til produsentens protokoll for Spectral Chip ™ 2600. Ultrarent avionisert H
2O ble anvendt for fremstilling av alle reagenser; Promega Mann Genomisk DNA (Madison, WI) ble anvendt som referanse-DNA; fargestoff-reversering forsøk hvor 2 mikromatriser ble utført for hver prøve med gjensidig merking av test- og referanse-DNA. Test- og referanse DNA ble tilfeldig primet merket ved å kombinere 2 ug genomisk DNA og DDH
2o til et totalvolum på 50 ul og sonikering i en omvendt kopp horn sonikator for å oppnå fragmenter 600 bp og 10 kb i størrelse. DNA opprydding ble utført med Zymo Clean-up Kit (Orange, CA) i henhold til protokollen. Den elutant ble delt likt mellom 2 rør og, for hver, 20 ul 2,5 x tilfeldige primere fra Invitrogen s (Carlsbad, CA) BioPrime DNA Labeling Kit ble tilsatt, blandet godt, kokt i 5 minutter, og umiddelbart plassert på is i 5 minutter. Til hver ble det tilsatt 0,5 mL Spectral Merking Buffer (Spectral Genomics), 1,5 mL Cy3-dCTP eller 1,5 mL Cy5-dCTP respektive til hver dye-reversering eksperiment (PA53021, PA55021, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey), og en ul Klenow fragment (BioPrime DNA Merking Kit, Invitrogen). Innholdet ble inkubert i 1 time ved 37 ° C. Rørene ble deretter gjenoppvarmet til koking i 5 minutter og vendte tilbake til is i 5 minutter. En annen 5 ul delmengde av merkingsbuffer ble tilsatt til blandingen, og rørene ble inkubert ved 37 ° C i en time. Ved slutten av den annen time, å tilsette 5 ul 0,5 M EDTA pH 8,0 og inkubering av rørene i et tørt bad i 10 minutter ved 72 ° C stoppet merkingsreaksjonen. Prøve og kontroll DNA-blandingene ble så kombinert i prøverøret, 45 ul av Hyb I (blokkering av DNA og laksesperma bærer-DNA) ble tilsatt til hvert rør og 5 M NaCl, og 100% isopropanol ble tilsatt til rørene for å utfelle DNA. DNA-pelleter ble vasket med 70% etanol X1 og deretter tørket i mørke. Etter re-fuktighetsgivende pellets med vann, ble HYBII (hybrisol) tilsatt til blandingen, og DNA ble denaturert i ti minutter ved 72 ° C og deretter pre-hybridisert i 30 minutter før de ble plassert på rekken og dekket med en 24X60mm dekkglass . Platene ble inkubert over natten i en 37 ° C ovn.
Post-hybridiserings-vaskinger ble utført med hvert lysbilde i enkelte dype Petriskåler i en gynge inkubator. Etter fjerning av dekkglass, ble objektglassene kort dyppet i 0,5% SDS ved romtemperatur. Hvert snitt ble deretter overført til 2xSSC, 50% deionisert formamid, pH 7,5 i 20 minutter; da 2xSSC, 0,1% IGEPAL CA-630, pH 7,5 i 20 minutter etterfulgt av 0.2XSSC pH 7,5 i 10 minutter, hver forvarmet til 50 ° C og omrørt i en inkubator ved 50 ° C. Til slutt, hvert lysbilde ble kort skylles i to badene i romtemperatur DDH
2o og umiddelbart blåst tørt med komprimert N
2 og skannet.
Array dataanalyse
Skanning ble utført med Axon er GenePix 4000B microarray scanner (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) og bildene ble analysert med GenePix Pro 3.0 for å forberede datafiler for tomten analyse med Spectralware programvare V2.2. (Spectral Genomics, Houston, Texas). Spots ble definert av den automatiske grid funksjon i programvaren og manuelt justert ved behov. Flekker som viser ikke noe signal, eller åpenbare mangler, ble ekskludert fra dataanalyse, lokal bakgrunn ble subtrahert, og total intensitet, samt fluorescensintensiteten forhold av de to fargestoffer, ble beregnet for hver enkelt flekk. Plot analyse ble utført ved hjelp av online tilgjengelig versjon av SpectralWare programvare (Spectral Genomics) ved hjelp av globale middeltemperaturen normalisering av dataene. I tillegg ble datasett analysert ved hjelp av Microsoft Excel. Etter å ha utført global middeltemperatur og globale median normalizations, gjennomsnitts prosenter av fire fluorescerende signaler (to signalene fra duplisert klone på rekke og to signaler fra fargen reversere eksperiment) for hver klon ble beregnet. Alle analyser ble gjort på log
2 forholdstall. For å redusere falske positive resultater, kloner som viser test /referanse forholdet verdi høyere enn 1,2 ble vurdert tjente og kloner som viser test /referanse forholdet verdi lavere enn 0,8 ble endelig tapt, men bare dersom resultatene av alle fire fluorescerende signalene var konsekvent. Kloner ble ekskludert fra analysen dersom forholdet mellom verdiene av de fire hybridiserte flekker av hver klon skredet terskelverdiene (0,8-1,2) i et ikke-konkordant materie.
Kvantitativ PCR vurdering av telomer-lengden
telomerlengde ble vurdert i svulst DNA fra alle endetarmskreft tilfeller og fra de med tilstrekkelig normal kolonepitelet DNA ved hjelp av DNA som forberedt på array CGH-analysen [14 ]. I en del av tilfellene, PBL DNA var tilgjengelig, og ekstrahert ved hjelp av de Gentra AutoPure kjemi som beskrevet ovenfor.
To master mikser av PCR reagenser ble forberedt, ett med T primer paret, den andre med S primerpar. Femten mikroliter av T konsentrat-blanding ble tilsatt til hver prøve brønn, styrer godt og standardkurve vel av den første platen og 15 ul S-konsentrat-blanding ble tilsatt til hver prøve brønn, styrer godt og standardkurve brønn i den andre platen.
For hver prøve analysert, tre identiske 5 pl aliquoter av DNA-prøven (15 ng /alikvot) ble tilsatt til platen 1 og en annen 3 alikvoter ble tilsatt til den samme stilling i godt platen 2. For hver standardkurve , en referanse DNA-prøven ble fortynnet i serie i TE ved 1: 2 ganger per fortynning for å fremstille seks konsentrasjoner av DNA som strekker seg fra 0,78 til 25 ng /pl.
Fem mikroliter av hver konsentrasjon ble distribuert til standardkurven brønner på hver plate. Platene ble deretter forseglet med et gjennomsiktig klebemiddel deksel, sentrifugert kort på 800 g og transportert på is til ABI 7900HT instrument for analyse.
T og S PCR ble utarbeidet identisk med unntak av oligonukleotid primere. De endelige konsentrasjoner av reagenser i PCR var 20 mM Tris-HCl, 0,2 mM av hver dNTP, 2,0 mM MgCl², 1% DMSO, 150 nM ROX fargestoff, 0,2X SYBR grønn I (Molecular Probes), 5 mM DTT, 1,25 U AmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems). De endelige telomer-primer konsentrasjoner var tlf 1b, 600 nM; tlf 2b 900 nm. Kontrollen genet (B2-globin på kromosom 11) konsentrasjoner var HBB1 300 nm; HBB2 700 nm. Primersekvensene (skrevet 5′- 3′) var tlf 1b: CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT;
tlf 2b: GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT;
HBB1: GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC;
HBB2: CACCAACTTCATCCACGTTCACC.
Alle PCR ble utført på ABI Fast Real-Time 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, California). De termiske syklusforhold for begge primerne parene startet med en 95 ° C inkubering i 10 minutter for å aktivere AmpliTaq Gold-DNA-polymerase. For telomere PCR, ble dette etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 sekunder, 54 ° C i 2 minutter. For HBB PCR, ble dette etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 sekunder, 58 ° C i 60 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder. Dataene ble deretter analysert ved SDS ABI programvare for å generere standardkurven for hver plate.
Metodikk for ABI 7900HT bruker SYBR grønt fargestoff en
SYBR Grønn en dobbeltrådet Binding Dye binder ikke-spesifikt til dsDNA og genererer en eksitasjon utslipp profil. For kvantitativ PCR, ble SYBR Grønn ett brukes med en passiv henvisning fargestoff (ROX). Den 7900HT instrument analyserte syklus til syklus endring i fluorescens-signal som et resultat av amplifikasjon under en PCR. Under normal amplifikasjon av PCR-produktet tre regioner karakterisere utviklingen av PCR.
telomerlengde analyse
telomer-lengden, målt ved PCR blir ofte rapportert som et forhold mellom den telomere (T) og standard-genet (S) målinger (T /S). Som basepar lengde er intuitivt lettere å forstå, ble forholdene forvandlet til basepar lengde ved hjelp av en tidligere validert formel rapportert med teknikken ved Cawthon beskrevet over [14]. Resultatene av statistiske tester som sammenligner gruppene er den samme enten T /S-forhold, eller telomerlengde anvendes. Som basepar lengde er intuitivt lettere å forstå, ble Southern blots utført for å bestemme telomer-restriksjonsfragment (TRF) lengde på en undergruppe av deltakere (n = 16) og en lineær regresjon ble brukt for å sammenligne TRF lengde til T /S-forholdet , hvilket resulterer i den følgende ligning: bp = [T /S] * 1470,8 + 7674,5 hvor 1470,8 representerer helningen av linjen å sammenligne den relative T /S-forholdet til målingen av telomerlengde i basepar av den midlere TRF og 7674,5 er y skjæringspunktet.
p53 mutasjon analyse
Tilstrekkelige mengder av svulst DNA var tilgjengelig fra 17 av de 19 svulster å teste for somatiske p53 mutasjoner.
PCR-amplifikasjon ble utført i et totalvolum på 12,5 ul inneholdende 5 ng genomisk DNA, hver primer ved 0,2 mM, dNTP på 0,2 mM, 2,0 mM MgCl
2, 0,5 U av Taq-polymerase (AmpliTaq gull, Applied Biosystems, CA) med PCR-reaksjon buffer gitt av produsenten. Denaturerende væskekromatografi (DHPLC) analyser, etterfulgt av direkte sekvensering av PCR-produktene ble utført som beskrevet tidligere (14).
den kodende sekvensen, og de skjøtforbindelses områder av
TP53
eksoner 5-8 var PCR forsterket ved hjelp av 4 par intronic primere som følger:
Exon5F 5 «GCC GTC TTC CAG TTG CTT 3»
Exon5R 5 «CAA CCA GCC CTG TCG TCT CT 3»
Exon6F 5 «GGG GCT GGA GAG ACG ACA 3»
Exon6R 5 «TCC TCC CAG AGA CCC CAG TT 3»
Exon7F 5 «CTT GCC ACA GGT CTC CCC AA 3 «
Exon7R 5′ AGG GGT CAG CGG CAA GCA GA 3 «
Exon8F 5′ AAA TGG GAC AGG Tags GAC 3 «
Exon8R 5′ AAG TGA ATC TGA GGC ATA AC 3 «
Alle PCR-reaksjoner ble utført i en 25 ul reaksjonsvolum som består av 10X PCR-buffer II (Applied Biosystems, Foster City, CA), 2 mM MgCl2, 2,5 mM hver dNTP, 10 pM av hver primer, 0,75 enheter Taq AmpliGold DNA-polymerase (Applied Biosystems, Foster City, CA), og 10 ng av templat DNA. PCR ble utført ved anvendelse av en Tetrad termosykler (MJ Research, Waltham, MA) med følgende betingelser: innledende denaturering ved 94 ° C i 9 minutter, etterfulgt av 35 sykluser ved 94 ° C i 30 sekunder (58 ° C i 30 sekunder eksoner 5,6,7) og (55 ° C i ekson 8), 72 ° C i 45 sekunder, og endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 minutter. PCR-produktene ble kjørt på en 2% agarose-gel sjekken. PCR-produkter ble preparert for DNA-sekvensering som følger: 5 ul av PCR-produkt med 1 pl hver eksonuklease og 10X reker alkalisk fosfat tuf buffer og deretter kjørt på en Tetrad termosykler med følgende betingelser: 37 ° C i 15 minutter, 80 ° C i 15 minutter. 1.6pmol av primer sammen med malen ble sekvensert på ABI PRISM ™ 3700 DNA Analyzer (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA 94404) i Core Facility. Mutation Surveyor programvare (SoftGenetics LLC, State College, PA) ble brukt til å analysere resultatene.
Vurdering av telomerase aktivering i CRC
Telomerase aktivitet ble målt ved hjelp trapes
TM telomerase deteksjon kit. (Chemicon International). Macrodissected tumorvev ble homogenisert i 200 pl 1 x CHAPS lyseringsbuffer og deretter inkubert i 30 min på is og sentrifugert ved 4 ° C og 12000 g i 20 minutter. Til 2,0 ul av denne supernatanten, 5,0 ul 10X TRAP-buffer, 1,0 ul av en blanding av 10x d-NTPs, ble 1,0 mL av TS primerblanding og 0,4 ul av TaqDNA polymerase tilsatt til et totalvolum på 50 ul. Telomer-forlengelse ved 30 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 30 PCR-sykluser ved 94 ° C i 30 sekunder og 60 ° C i 30 sekunder. 10 ul av PCR-produktet ble kjørt på en 12% polyakrylamid-gel og farget med SYBR
TM gull (Molecular Probes, Eugene, OR). Gelen ble fotografert med en UV transilluminator og stige. Telomerase aktivitet ble uttrykt som bandet forholdet mellom stigen av PCR produkt og intern kontroll.
Vurdering av ALT
Telomeric C-Circle DNA er delvis enkelt-strandet telomere DNA sirkler spesifikke celler stille ALT [15]. C-sirkler ble vurdert i tumor-DNA ved hjelp isothermic forsterkning av C-sirkel komplementære tråden og hybridisering med
32P- (CCCTAA)
3 probe ved Capital biovitenskap (Capital biovitenskap, Maryland, USA). En DNA-prøve ble kalt ALT + om det er påvist C-sirkler. C-sirkler er ekstrakromosomalt telomeric DNA består av delvis doble strandet telomeric sirkler med en delvis dobbelttrådet telomeric DNA med en kontinuerlig C rik strand og ufullstendig G rik strand. C-sirkler er sterkt forbundet med tilstedeværelse av ALT [15].
Analytisk tilnærming
Å etablere CIN status basert på kromosom gevinst eller tap, data ble analysert i R bruker aCGH pakken fra Bioconductor [16].
Filtrering ble utført for å fjerne kartlagte kloner, kloner kartlegging til Y-kromosom, og kloner mangler i mer enn 25% av pasientene. Vi så tilregnet manglende observasjoner ved hjelp av en LOWESS tilnærming. Fraksjonen av deltakere med gevinster eller tap av hver klon ble plottet ved kromosom antall og plassering, av CIN status (figur S1).
I tillegg ble Wilcoxon test anvendt for å evaluere forskjellen i CRC tumor telomerlengde mellom: 1) CIN + og CIN- endetarmskreft, 2) ALT + og Alt- prøver, og 3) telomerase + og telomerase- prøver [17]. Chi-squared tester eller Fishers eksakte test ble anvendt for å evaluere krets mellom ALT status og CIN status, og mellom telomerase aktiveringsstatusen og CIN status. Den Spearman korrelasjon mellom endetarmskreft svulst telomerlengde og andelen av klone med gevinst eller tap ble beregnet.
Resultater
Array CGH evinced omfattende variasjon i DNA-kopi nummeret endres
Vi studerte 19 unge debut MSS endetarms kreft etter bevis for CIN hjelp aCGH består av omtrent 3000 BACS. Vi har vist at det er MSS rektale tumorer som har svært lave nivåer av DNA-kopitall endres. Seks svulster (32%) hadde lave nivåer av kromosomforstyrrelser med 1% til 17% av kloner som har DNA kopiantall endringer og ble klassifisert som CIN- av aCGH. Tretten svulster (68%) hadde 20% av kloner som viser DNA kopiantall endringer og ble klassifisert som CIN + gruppen. MSS CIN- svulster 0 til færre enn 5 kromosomarmer som ble helt vunnet eller tapt, sammenlignet med CIN + gruppen som hadde åtte til 18 kromosomarmer viser komplett gevinst eller tap (figur S2).
Andel av gevinster eller tap i CIN + og CIN- endetarmskreft
brøkdel av deltakere med gevinster og tap per kromosom region for pasienter med CIN + endetarmskreft sammenlignet med de med CIN- endetarmskreft er vist i figur S1. Forskjeller i gevinst eller tap ble observert i hele genomet, med de mest markante forskjeller i kromosomer 13, 17 og 18. CIN + endetarmskreft hadde flere gevinster /tap enn CIN- endetarmskreft (gjennomsnitt: 33,1 vs 9,7, p = 0,0007, tabell 1 ).
CIN +
CIN-
Mean (SD) eller% Gjennomsnittlig (SD) eller% p-valueFraction gevinst /tap, mener (SD) 33,08 (8,76) 9,66 (7,92) 0,0007 telomerlengde, mener (SD) 8211 (308) 9178 (1396) 0.0066Telomerase0.0949 Yes80.0% 25,0% No20.0% 75,0% ALT0.2335 Yes50.0% 100,0% No50.0% 0,0% p530.3348 Yes36 0,4% 66,7% No63.6% 33,3% Tabell 1. Egenskaper ved CIN + og CIN- endetarmskreft
kolorektal kreft svulster evaluert med rekke CGH ble klassifisert som 1) CIN- om. 20% av klonene viste DNA-kopi antall endringer eller som 2) CIN + hvis ≥ 20% av klonene viste DNA kopiantall endringer. CIN + CRC hadde et høyere antall saker som viste gevinster og tap per kromosom region i forhold til de av CIN- CRC. CIN + CRC har betydelig kortere kreft telomerer (8211 bp) enn CIN- CRC (9178 bp; p = 0,0066). CIN + tumorer var mer sannsynlig å vise aktivering av telomerase enn var CIN- CRC, men det var ingen sammenheng med CIN status av en svulst og hvor ofte en svulst brukt alternativ forlengelse av telomerer som en telomer vedlikehold mekanisme (p = 0,2335). Tilstedeværelsen av p53-mutasjoner korrelerte ikke med den CIN status av tumoren (p = 0,3348). CSV Last ned CSV
telomerlengde i CIN + og CIN- endetarmskreft
endetarmskreft telomer-lengden var signifikant assosiert med CIN status, slik at CIN- endetarmskreft hatt lengre telomerer enn CIN + endetarmskreft (p = 0,0066, Figur 1). Telomer-lengden var også signifikant korrelert med andel av kloner med gevinst eller tap (r = -0,50, p = 0.0310).
Panel A: telomer-lengden av tumor-DNA i kromosomer stabil (CIN-) endetarmskreft er betydelig lengre enn for kromosomer ustabil (CIN +) endetarmskreft (p = 0,0066). CIN status bestemmes som CIN- om fra 20% av kloner viser DNA-kopi nummer gevinster eller tap. Endetarmskreft er CIN + hvis mer enn 20% av kloner har gevinster eller tap.
Panel B: Aktivering av telomerase (Telomerase +) i endetarmskreft korrelerer med kortere tumor telomerlengde enn i svulster som ikke benytter telomerase (Telomerase -) som en telomer vedlikehold mekanisme (p = 0,0040)
Blant CIN- svulster, telomerer var lenger i svulsten DNA i forhold til deres tilsvarende normal epitelceller DNA. I kontrast til telomerer på CIN + tumor-DNA var kortere enn de i tilsvarende normal epitel DNA. (P = 0,0039).
Vi har evaluert videre om forskjeller i telomerlengde eller CIN status kan være relatert til aktivering av telomerase eller ALT. Vi observerte at svulster med kortere telomerer var mer sannsynlig å ha aktivering av telomerase (p = 0,0040 Figur 1, Panel B) gjorde, men svulsten telomer-lengden ikke korrelerer med tilstedeværelse av ALT (p = 0,4923, tabell 2). CIN + tumorer var mer sannsynlig å vise aktivering av telomerase enn var CIN- svulster (p = 0,0949; Tabell 1], men det var ikke en forskjell i gevinst /tap mellom CRC med telomerase aktivering og CRC uten telomerase aktivering (p = 0,3168; Tabell 1 .) Det motsatte var sant med hensyn til ALT CIN- svulster var like sannsynlig som CIN + svulster vise bevis for ALT (p = 0,2335;. Tabell 1) selv om de svulster som var Alt- hadde flere gevinster /tap enn ALT + CRC (gjennomsnitts : 39,3 vs 22,6, p = 0,0091, figur 2, tabell 2) svulster som forlenget telomerer via utstilt C-Circle formasjonen ikke er til stede i Alt- tumorer (figur 3)
telomerlengde
Brøk Gevinst.. /Tap
Mean (SD)
p-verdi
Mean (SD)
p-verdi
CIN Status0.00660.0007 CIN + 8211 (308) 33,1 (8,8) CIN- 9178 (1396) 9,7 (7,9) Telomerease0.00400.3168 Yes8193 (295) 28,8 (14,3) No9307 (1512) 19,2 (16,4) ALT0.49230.0091 Yes8676 (1208) 19,6 (13,5) No8226 (397) 38,7 (7,9) p530.54140.7726 Yes8443 (370) 26,3 (17,0) No8676 (1281) 22,9 (12,0) Tabell 2. telomerlengde og brøkdel av klone gevinster /tap ved tumor egenskaper.
endetarmskreft svulster evaluert med rekke CGH ble klassifisert som en) CIN- om 20% av klonene viste DNA kopiantall endringer eller som 2) CIN + hvis ≥ 20% av klonene viste DNA kopiantall endringer. Svulster med kortere telomerer var mer sannsynlig å være CIN + (p = 0,0066) og for å ha aktivert telomerase (p = 0,0040). Heller ikke nærvær av alternative forlengelse av telomerer (ALT) (p = 0,4923) og heller ikke nærvær av p53 mutasjons status korrelert med tumor telomerlengde (p = 0,5414). CIN + endetarmskreft hadde en høyere andel av kloner som viste gevinster og tap enn CIN- svulster (p = 0,0007). Svulster med eller uten aktivering av telomerase ikke har en signifikant forskjellig brøkdel av gevinster eller tap av kloner (p = 0,3168). Men for svulster stiller ALT brøkdel av gevinster og tap av kloner var lavere enn for svulster med ingen bevis ALT (p = 0,0091) .Ingen forskjellen er sett i brøkdel av klone gevinster eller tap mellom svulster med vår uten p53 mutasjoner ( p = 0,7726). CSV Last ned CSV
Svulster som var Alt- viste signifikant mer kromosom gevinst /tap enn ALT + endetarmskreft (p = 0,0091).
Panel A. Hematoxylin og vevssnitt eosin fra et MSS CIN- ALT +, Telomerase- endetarmskreft (til venstre) og fra MSS CIN +, Alt-, Telomerase + endetarmskreft. Begge er moderat differensierte adenokarsinomer. Kjertelen-til-stroma ratio er høyere i ALT + /tele- saken, og den har mindre desmoplastic stroma.
Panel B. Dot /blot viser tilstedeværelse av C-sirkler. C sirkler, ekstrakromosomalt telomeric DNA, er sterkt forbundet med ALT. Vurderes i tumor-DNA med isothermic forsterkning av C-sirkel komplementære tråden og hybridisering med
32P- (CCCTAA)
3 probe ved Capital biovitenskap (Capital biovitenskap, Maryland, USA), ble en prøve som heter ALT + hvis C-sirkler ble oppdaget. ALT +, telomerase negativ tumor på venstre hadde 10% av BAC-kloner som viser avvikende hybridisering og er klassifisert som en CIN- svulst. ALT – ,, telomerase positiv svulst på høyre hadde 40% av kloner med avvikende hybridisering og er klassifisert som en CIN + svulst.
