Abstract
Formål
NCIC Clinical Trials Gruppe PA.3 var en randomisert kontroll studie som viste forbedret total overlevelse (OS) hos pasienter som fikk erlotinib i tillegg til gemcitabin for lokalavansert eller metastatisk bukspyttkjertelkreft. Før behandling, pasientene hadde plasmaprøver trukket for fremtidige studier. Vi søkte å identifisere biomarkører innen disse prøvene.
Experimental Design
Bruke nærhet ringsanalyse (PLA), ble en sonde panel bygget fra kommersielt tilgjengelige antistoffer for 35 viktige proteiner valgt fra en global genetisk analyse av bukspyttkjertel kreft, og som brukes til å kvantifisere protein nivåer i 20 pl av pasientens plasma. For å finne ut om noen av disse proteiner nivåer uavhengig assosiert med OS, univariate og mulitbaraible Cox modeller ble brukt. I tillegg undersøkte vi sammenhengen mellom biomarkør uttrykk og sykdom stadium ved diagnose ved hjelp av Fishers eksakte test. Korrelasjonen mellom Erlotinib følsomhet og hver biomarkører ble vurdert ved hjelp av en test av samspillet mellom behandling og biomarkør.
Resultater og konklusjon
Av de 569 kvalifiserte pasienter, 480 hadde eksempler tilgjengelige for studien. Prøvene ble tilfeldig fordelt i trening (251) og valideringssett (229). Blant alle pasienter, forhøyede nivåer av interleukin-8 (IL-8), karsinoembryonalt antigen (CEA), hypoksi-induserbar faktor-1 alfa (HIF-1 alfa) og interleukin-6 ble uavhengig av hverandre forbundet med lavere OS, mens IL- 8, CEA, blodplate-avledet vekstfaktor-reseptor alfa og mucin-1 ble assosiert med metastatisk sykdom. Pasienter med forhøyede nivåer av reseptor-tyrosin-proteinkinase erbB-2 (HER2) ekspresjon hadde forbedret OS når de ble behandlet med erlotinib sammenlignet med placebo. I konklusjonen, er PLA et kraftig verktøy for å identifisere biomarkører fra arkiverte, små volum serumprøver. Disse dataene kan være nyttig å stratifisere pasientens utfall uavhengig av terapeutisk intervensjon
Trial Registrering
ClinicalTrials.gov NCT00040183
Citation. Shultz DB, Pai J, Chiu W, Ng K, Hellendag MG, Heestand G, et al. (2016) A Novel Biomarker Panel Undersøke Response to gemcitabin med eller uten Erlotinib for kreft i bukspyttkjertelen Therapy i NCIC Clinical Trials Gruppe PA.3. PLoS ONE 11 (1): e0147995. doi: 10,1371 /journal.pone.0147995
Redaktør: Anthony W.I. Lo, Queen Mary Hospital, HONG KONG
mottatt: 24 september 2015; Godkjent: 10 januar 2016; Publisert: 25 januar 2016
Copyright: © 2016 Shultz et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er tilgjengelig i papir og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Midler til denne studien ble gitt av Mine blå prikker og Sydney Ng minnefond. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og forfatterne av dette manuskriptet har følgende konkurrerende interesser: GH har fungert som konsulent for Bayer, Merrimack, og Genomisk Health. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDCA) er en aggressiv kreft med en dårlig prognose. Pasienter diagnostisert med resektable svulster er potensielt kureres, men lokalavansert (LA) eller metastatisk PDCA er jevnt dødelig. [1, 2] Forbedret biomarkører for å avgrense den terapeutiske behandling av avansert PDCA og forbedre resultatene.
Validert prognostiske biomarkører for bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDCA) er begrenset. CA 19-9, den mest etablerte biomarkør for pdca, har en sensitivitet og spesifisitet for kreft i bukspyttkjertelen på ca 80% og 90%, henholdsvis [3], og i enkelte tilfeller nivåer er prediktive for kjemoterapi eller strålings responser [4, 5]. Imidlertid kan CA 19-9 bli feilaktig forhøyet hos pasienter med obstruktiv leversykdom eller pankreatitt, og feilaktig negative pasienter som mangler Lewis-antigen glykosyltransferase (5-10% av populasjonen). I tillegg CA 19-9 nivåer gir begrenset innsikt i de biologiske funksjonene i PDCA som kan lede systemisk behandling. Derfor blir bedre biomarkører for å veilede pasientbehandling.
PA.3 var en randomisert fase III studie utført av NCIC Clinical Trials konsernet som viste bedret overlevelse hos pasienter behandlet med erlotinib pluss gemcitabin sammenlignet med gemcitabin alene, i som, EGFR-ekspresjon ble ikke prediktiv for en reaksjon som erlotinib [6]. I denne studien, i pre-behandling plasmaprøver fra pasienter som er registrert på PA.3, søkte vi å identifisere biomarkører som var prognostisk for å overleve, samt prediktiv for en respons på erlotinib.
Metoder
Plasmaprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble innhentet fra 480 av 569 pasienter inkludert på NCIC kliniske studier gruppe (CTG) PA.3 (Clinical.Trials.gov Identifier NCT00040183), et dobbelt blindet internasjonal fase III studie av erlotinib (235) versus placebo pluss gemcitabin (245) pasienter med lokalavansert eller metastatisk bukspyttkjertel adenokarsinom [6]. Prøvene ble oppnådd på tidspunktet for registrering. Det primære endepunktet for studien var OS. Studien er beskrevet i dette manuskriptet ble godkjent av Stanford Research Compliance Office: IRB # 5136 (protokoll 27 492). På tidspunktet for registrering i PA.3, ble pasienten informeres skriftlig samtykke innhentes og under godkjenning fra vår egen forskning samsvar kontor, vi ikke få seperate informert skriftlig eller muntlig samtykke fra pasienter for vår studie.
Før til laboratorieanalyse, ble prøver randomisert til en trenings (251 totalt, 129 fikk erlotinib) eller en validering (229 totalt, 106 fikk erlotinib) kohort. Nærheten ligering assay (PLA) [7] ble brukt til å måle den relative konsentrasjonen av 35 biomarkør proteiner (tabell 1). I korte trekk, ble PLA sondesett satt til blokkerte serum og inkubert ved 37 ° C i to timer. Deretter ble ssDNA splinter med ligase lagt robot (Velocity11, Agilent Technologies) og inkuberes ved 30 ° C i 15 minutter. Til slutt ble Uracil-DNA-utskjæring Mix (Epicentre) tilsatt, og det resulterende DNA ble amplifisert ved hjelp av PCR med platina Taq (Invitrogen), og PCR-produktet ble deretter amplifisert med iTaq med SYBR (Bio-Rad) ved hjelp av kvantitativ PCR (Model 7500, Applied Biosystems) for å bestemme de relative konsentrasjoner av hver potensielle biomarkører.
biomarkør prober ble utviklet for tidligere studier og andre som ble syntetisert for denne studien. [7, 8] potensielle biomarkører ble identifisert gjennom en global genetisk analyse [9] og besto av en omfattende litteratur søk for å identifisere publiserte datasett, etterfulgt av en vurdering av om potensielle biomarkører ble uttrykt enten på celleoverflaten eller i plasma, og til slutt enten biomarkører ble spesielt forhøyet i bukspyttkjertelkreft versus kronisk pankreatitt . Av de potensielle kandidater som er identifisert i denne publikasjonen, 320 ble bekreftet til å bli utskilt, og til stede ved høye nivåer i serum hos pasienter. Deretter fikk vi en analyse av genuttrykk datasett i bukspyttkjertelen ductal adenokarsinom fra Gene Expression Omnibus [10, 11] og etter å identifisere nivåene av genuttrykk for de 320 antatte biomarkører for kreft i bukspyttkjertelen som er beskrevet ovenfor, brukte vi en k-means til identifisere 13 forskjellige underkategorier. Fra hver av disse valgte vi 5 biomarkører som skal inkluderes i vårt panel, for en total av 65 prober. Flere andre biomarkører ble identifisert ved direkte litteratursøk. Fordi kommersielt tilgjengelige antistoffer for mange av biomarkører identifiserte var utilgjengelig, var mindre enn halvparten av de potensielle PLA sonder bygget (tabell 1).
biomarkør nivåer ble dikotomisert til høye og lave kategorier basert på om de var større enn medianen. Vi neste testet for en statistisk signifikant sammenheng med total overlevelse (OS) i både trening og validerings kohorter bruker Cox regresjonsmodeller. Alder ( 70 vs. ≥70), kjønn (kvinnelige kontra mannlige), rase (hvit vs ikke-hvite), ECOG funksjonsstatus (0-1 vs. 2), smerteintensitet (≤20 g 20), og sykdomsstadiet (III kontra IV) var andre kovariater inngår i multivariable regresjonsmodeller. Hver biomarkør ble analysert enkeltvis ved hjelp av Cox-modeller, inkludert det samme settet med kovariater nevnt ovenfor. I en egen analyse, undersøkte vi om biomarkør uttrykk (over eller ikke over medianen) var assosiert med sykdom scenen. Biomarkører hvis uttrykk var signifikant assosiert med stadium ble bestemt med Fishers eksakte test. Til slutt, for hver biomarkør, testet vi dens effekt i å forutsi for bedret overlevelse på grunn av erlotinib ved hjelp av en multivariabel Cox modell inkludert en ekstra interaksjonsledd mellom behandling (erlotinib vs. placebo) og binære biomarkør uttrykk nivå.
resultater
Proteiner som konsentrasjoner, etter dichotomizing basert på å være større enn medianen, assosiert signifikant (p 0,05) med OS i både trening og validering kohort på univariate eller multivariabel analyse er presentert i figur 1A og 1B, henholdsvis . Resultatene som vises er for pasienter i valideringen kohort. Som vist på multivariabel analyse, høy interleukin 8 (IL-8) nivået var assosiert med dårlig overlevelse i begge behandlingsgruppene, mens høyere carcinoembryonic antigen (CEA) og hypoksi-indusert faktor 1 alfa (HIF-1alfa) nivåer var assosiert med dårligere overlevelsen hos pasienter behandlet med erlotinib. Fullstendige resultater er tilgjengelige i S1 og S2 Tabeller
Hazard ratio (HR) (fra høy til lav biomarkør konsentrasjon) og p-verdier vises for biomarkører som var signifikant assosiert (p 0,05). Med overlevelse. Resultatene som vises er fra validerings kohorter.
Tjuefire prosent av pasientene som er registrert på PA.3 hadde stadium III (lokalavansert) i stedet for metastatisk sykdom (stadium IV). I en separat analyse, undersøkte vi hvorvidt eller ikke biomarkør konsentrasjon (større enn median) var assosiert med trinn (III vs. IV). Betydelig flere pasienter med høyt IL-8, CEA, plate avledet vekstfaktor alfa (PFGFRalpha), og mucin 1 (MUC-1) nivåer hadde stadium IV metastatisk sykdom. (Fig 2). Resultatene som vises er fra valideringen kohorten
ORS og p-verdier er vist for biomarkører som var signifikant assosiert (p 0,05).. Resultatene som vises er fra valideringen kohorten.
Til slutt, vi søkt å identifisere biomarkører som spådd for en respons på behandlingen ved å måle interaksjonseffekt mellom erlotinib behandling, biomarkør nivå, og OS. I en multivariabel analyse, hvor biomarkør-nivåene ble analysert ved å være større eller mindre enn medianen, ble ingen signifikant assosiert med erlotinib respons i både trening og valideringssett. Men når nivået av hver markør ble undersøkt som en kontinuerlig variabel, og de statistiske begrensninger var avslappet til p 0,1 for treningssettet og p 0,05 i valideringssettet, reseptor tyrosin-proteinkinase erbB-2 (HER2) alene var identifisert som å ha en signifikant interaksjonseffekt med erlotinib respons (HR for samhandling 0,95, 95% KI 0,72 til 1,26, p = 0,08 i trening kohort og 0,7, 95% KI 0,5 til 0,99, p = 0,004 i validering kohort). I valideringen årsklassen var pasienter med HER2 over median bedret overlevelse ved behandling med erlotinib (median OS 8.2 vs. 5 måneder, HR 0,36, 95% KI 0,21 til 0,63, p 0,0001), mens ingen signifikant forskjell mellom erlotinib og placebo var funnet fra pasienter med HER2 2 nivåer lavere enn median (median OS 6,0 vs. 8,3 måneder, HR 1,28, 95% KI 0,8 til 2,1, p = 0,3) (figur 3).
median total overlevelse (med 95 % KI) ble forbedret med erlotnib behandling hos pasienter med høyere enn median nivåer av plasma HER2 (8,2 vs. 5,0 måneder), men ikke hos pasienter med lavere plasma HER2 (6,0 vs. 8,3 måneder).
diskusjon
NCIC CTG PA.3 bevist sin hypotese om at erlotinib pluss gemcitabin resulterer i bedre OS i forhold til gemcitabin alene for lokalavansert eller metastatisk PDCA, men median OS i den eksperimentelle og kontroll armene avvek etter bare 0,3 måneder (6,2 versus 5,9). Målet med denne studien var å identifisere biomarkører som var prognostisk i enten arm, korrelerende med metastatisk versus lokalavansert sykdom, eller logisk for bedret overlevelse hos pasienter behandlet med erlotinib versus placebo når det legges til gemcitabin.
Plasma proteiner som har nivåer var assosiert med overlevelse i vår studie, IL-6 [12], IL-8 [13], CEA [14], og HIF-1 alfa-[15, 16], er tidligere blitt identifisert som prognostisk i lokalt avansert eller metastatisk kreft i bukspyttkjertelen. HIF-1 alfa-, en transkripsjonsfaktor kritisk for hypoksi signalering, ikke utskilles, og er antagelig påvises i plasma på grunn av tumorlyse. IL-6 [17] og IL-8 [18], som kan bli utskilt fra tumor eller stromale vev, så kan hypoksi-indusert protein, noe som tyder på at bukspyttkjertelkreft kan forplante seg gjennom hypoksi signalering via HIF-1 alfa, men deres rolle i å fremme sykdom progresjon er uklart. IL-8 og CEA var også mer sannsynlig å være forhøyet hos pasienter med metastatisk sykdom, som var, MUC-1 og PDGFRalpha. Slike markører kan brukes til å identifisere okkult metastatisk sykdom hos pasienter som ville da være optimalt behandlet ved systemisk kjemoterapi, utelatelse aggressiv lokal terapi. MUC-1 er overuttrykt i bukspyttkjertel kreft og har vært vist å assosiere med HIF-1 alfa for å drive ekspresjonen av hypoksi-indusert onkogener, inkludert PDGF [19, 20], som har reseptorer, PDGFRalpha og PDGFRbeta regulere pdca cellemigrering og metastase [ ,,,0],21, 22].
HER2 ble identifisert som et potensielt prediktiv for erlotinib respons i vår studie. Dette er den første kliniske eksempel å knytte sykdommen respons som erlotinib med blod biomarkør. Nylig,
HER2
ble vist å bli forsterket i 2% av 469 ikke-forbehandlet PDCA svulster [23]. HER2 signalisering, som hemmes av erlotinib [24], har vært målrettet i HER2 + PDCA, vurderes ved immunhistokjemi, ved hjelp av trastuzumab, i minst 2 tidligere fase II-studier [25, 26], verken som viste gode resultater i forhold til historiske resultater . Det har vært kjent at HER2 amplifikasjon bør verifiseres ved hjelp av FISH eller andre metoder i motsetning til IHC alene [27], noe som kan ha ført til de tidligere negative forsøk. Vi hypotese at den beskjedne overlevelsesgevinst av å legge erlotinib til gemcitabin i PA.3 rettssaken kan ha blitt forbedret ved hjelp av biomarkører som HER2 å velge for pasienter som mest sannsynlig vil svare på erlotinib.
CA 19-9 var ikke identifisert som en prognostisk biomarkør i denne undersøkelsen, i motsetning til tidligere rapporter [28-31]. En mulighet for dette resultatet er at i denne studien, ble PLA kun brukt til å rapportere relative mengder av proteiner i denne høyt multi-dannede analysen. Analysere CA 19-9 med en median cutoff verdi i stedet for en absolutt proteinkonsentrasjonen kan ha påvirket disse resultatene. En tidligere studie ved hjelp av PLA fant at selv om CA 19-9 nivåene var 16 ganger høyere i bukspyttkjertelen pasienter sammenlignet med normale kontroller innenfor denne populasjonen av lokalavansert sykdom, CA 19-9 var også ikke ikke prognostisk av utfallet. [8].
Vår studie har flere begrensninger. Vi har målt et forholdsvis lite antall proteiner, og det er ikke klart at alle PLA-prober var i stand til å gjenkjenne sitt mål med tilstrekkelig dynamisk område. På grunn av begrensede vevsprøver, vi var ikke i stand til å bekrefte om markørene identifiserte var også over-uttrykt i vev og likeledes på grunn av begrenset tilgjengelighet av plasmaprøver, kan vi ikke bekrefte våre resultater med en annen metode som enzymbundet immunosorbent-assay (ELISA). Imidlertid er nøyaktigheten av PLA blitt verifisert via ELISA i tidligere studier, og markører som ble identifisert i denne studien har vært implisert av andre som er prognostiske for PDCA utfall. Til slutt, den nylig rapportert stor randomisert studie i bukspyttkjertelkreft (LAP07 studie) l unnlatt å bekrefte fordel for erlotinib for PDCA, [32] fremhever behovet for prediktiv biomarkører for erlotinib og andre behandlinger for behandling av denne utfordrende malignitet.
Konklusjoner
Vi identifiserte flere biomarkører som var knyttet til overlevelse og sykdom stadium i PDCA. HER2 kan også være prediktive for en respons på erlotinib. Videre studier er nødvendig for å bekrefte disse resultatene i en uavhengig datasett.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Resultater av univariate og multivariable analyser, for gemcitabin pluss placebo og gemcitabin pluss erlotinib kohorter, inkludert validering og opplæring sett, av sammenhengen mellom biomarkør nivåer og overlevelse
doi:. 10,1371 /journal.pone.0147995.s001 product: ( DOCX)
S2 Table. . Detaljer om multivariable analyser for biomarkører identifisert som signifikant korrelert (p 0,05) til total overlevelse (data fra valideringsprøver)
Resultater vist indikere korrelasjonen for hver variabel til overlevelse: HR (CI) og p-verdi
doi: 10,1371 /journal.pone.0147995.s002 plakater (docx)
takk
Vi vil gjerne takke Justin Bui for korrekturlesing og formatering dette manuskriptet. Vekselstrøm erkjenner også støtte fra My Blue Dots.
