Abstract
Denne studien ble gjennomført for å tyde de innbyrdes roller (i ) metylering innenfor E2-bindingssete i og II (E2BS-i /II) og replikasjonsorigo (nt 7862) på lang styreområde (LCR), (ii) ekspresjon av virale oncogen
E7
, (iii) ekspresjon av transkriptet (
E7-E1∧E4)
som koder for E2-repressor-proteinet og (iv) virusmengde, i humant papillomavirus 16 (HPV16) knyttet livmorhalskreft (CaCx) patogenesen. Resultatene viste overrepresentasjon (p 0,001) av metylering ved nukleotid 58 av E2BS-I blant
E2
-intact CaCx tilfeller sammenlignet med
E2
-disrupted tilfeller. Bisulfitt sekvensering av LCR avdekket overrepresentasjon av metylering ved nukleotid 58 eller andre CPGs i E2BS-I /II, blant
E2
-intact tilfeller enn
E2
-disrupted saker og mangel på metylering ved replika i tilfelle av begge. Viral transkripsjon (
E7-E1∧E4
) som produserer repressor E2 ble analysert ved APOT (forsterkning av papillomavirus onkogen karakterutskrift) -koblet-kvantitativ-RT-PCR (av
E7 Hotell og
E4
gener) for å skille episomal (ren eller samtidig med integrert) fra rent integrerte virale genomer basert på forholdet,
E7
C
T /
E4
C
T. Relativ kvantifisering basert på komparative C
T (terskelen syklus) metode avslørte 75,087 kaster høyere
E7
mRNA uttrykk i episomale tilfeller over rent integrerte tilfeller. Virusmengde og
E2
genet kopiantall er negativt korrelert med
E7
C
T (p = 0,007) og
E2
C
T (p 0,0001), henholdsvis hver normalisert med
ACTB
C
T, blant episomale tilfeller bare.
k
en anordning clustering analyse vurderer
E7
C
T fra APOT-kombinert-kvantitativ-RT-PCR-analyse i forbindelse med virusmengde, viste enorm heterogenitet blant HPV16 positive CaCx tilfeller portretterer integrert virale genomer. Funnene gir ny innsikt i HPV16 relatert CaCx patogenesen og markere at CaCx saker som havn episomale HPV16 genomer med intakt
E2
er sannsynlig å være tydelig biologisk, fra de rent integrerte virale genomer i form av vertsgener og /eller trasé som er involvert i livmorhalskreft
Citation:. Das Ghosh D, Bhattacharjee B, Sen S, Premi L, Mukhopadhyay jeg, Chowdhury RR, et al. (2012) Noen ny innsikt om HPV16 Relaterte Livmorhalskreft Patogenese basert på analyser av LCR Metylering, Viral Load, E7 og E2 /E4 uttrykk. PLoS ONE 7 (9): e44678. doi: 10,1371 /journal.pone.0044678
Redaktør: Giuseppe Viglietto, Universitetet Magna Graecia, Italia
mottatt: 22 juni 2012; Godkjent: 07.08.2012; Publisert: 06.09.2012
Copyright: © Das Ghosh et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Institutt for bioteknologi (Grant No. BT /PR8014 /med /14/1220/2006), Government of India. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
HPV16 synes å være den vanligste høy risiko HPV type identifisert i CaCx tilfeller forstadier til livmorhalskreft, og i cytologisk normale livmorhalsprøver [1], [2]. I India blant de HPV positive CaCx tilfeller, er flertallet HPV16 DNA positive [3], [4].
Det er fastslått at selv om HPV genomet eksisterer i episomale form i lavgradige lesjoner, virusgenomet blir integrert, med økende grader av lesjon [5]. Til tross for denne observasjonen, analyse av foreningen av HPV-infeksjoner med CaCx utvikling avslører tilstedeværelse av både integrert samt episomale former for HPV, spesielt HPV16, i CaCx tilfeller [6]. Våre observasjoner har vist at
E2
genet avbrudd er betydelig overrepresentert blant CaCx tilfeller sammenlignet med kontroller [7]. Men over 60% av de CaCx tilfeller havnen intakt
E2
, til tross for at HPV16 E2 protein regulerer transkripsjon av
E6 Hotell og
E7
gener negativt [7] , [8]. Dette fikk oss til å utforske nye paradigmer av livmorhalskreftutvikling, noe som ville tilby innsikt i mekanismene som er involvert i vedvarende
E6 Twitter /
E7
mRNA uttrykk selv med
E2
genet intakt, dvs. tilstedeværelse av samtidige virale genomer (både episomale og integrerte) eller rene episomale virale genomer [7], [9] – [11]
Basert på en sammenligning mellom femten HPV16 positiv cytologisk normal og femtisju HPV16. positive CaCx tilfeller med intakt
E2
genet, foreslo vi at tap av E2 repressor aktivitet i slike tilfeller, hovedsakelig av E-avstamning, kan være forårsaket av CpG metylering ved nukleotid 58 innen E2 bindingssete i (E2BS- i) ved siden av p97 promoter, og dermed dempning av bindingen av E2 til dette området [7], [9]. Vi senere observert at virusmengde på
E2
-intact tilfeller var betydelig høyere sammenlignet med de med forstyrret
E2
genet. Dette ytterligere bedt oss om å tolke at virusmengden i forbindelse med
E2
-status, kan være årsaks relevans i CaCx patogenesen [12]. Den biologiske påliteligheten til slike observasjoner er sannsynlig å bli støttet av det faktum at E2-protein forbedrer viral DNA replikasjon ved å interagere med det virale replikasjonsfaktoren E1 og å rekruttere det til replikasjonsorigo [13] – [15] og spiller også en mer direkte rolle i replikasjon tilrettelegge viral genom segregering av tethering de virale genomer å være vert mitotiske kromosomer [16] – [17]
Vi foretok denne studien, med fokus på HPV16 positive E2 intakt og E2 forstyrret CaCx tilfeller i utgangspunktet, følges. ved deres inndeling i episomale og integrerte former, for å bestemme de innbyrdes rollene til (i) metylering innenfor E2 bindingsseter i og II (E2BS-i /II), og replikasjonsorigo i LCR, (ii) ekspresjon av virale oncogen
E7
, (iii) uttrykk for transkripsjon (
E7-E1∧E4) Hotell som koder for E2 repressor protein og (iv) virusmengde, i HPV16 relatert CaCx patogenesen. Vår studie gitt ny innsikt i alternative mekanismer for tap av E2 repressor aktivitet, noe som kan være relatert til E2BS-I /II metylering, tilstedeværelse av transkripsjon (
E7-E1∧E4
) som koder for E2 repressor protein, høy virusmengde og
E7
uttrykk blant HPV16 positive CaCx tilfeller med episomal (ren eller samtidig med integrert) virale genomer og ikke blant de tilfeller med rent integrerte virale genomer. I denne studien har vi ytterligere identifisert ved å bruke en ny teknikk, APOT-kombinert-kvantitativ-RT-PCR, at det var enormt mangfold blant de HPV16 positiv CaCx tilfeller både i form av viruskopiantall og
E7
uttrykk nivåer.
Materialer og metoder
prøver og fag
prøvene som brukes til denne studien ble nestet i en pågående naturlig kohortstudie [7], [11], [12 ]. De HPV16 positive maligne prøver (N = 184; histopathologically bekreftet invasive plateepitelkarsinom og klinisk diagnostisert som tumor stadium III og ovenfor som per FIGO klassifisering) ble avledet fra gifte fag, deltar på en kreft henvisning sykehus (Saroj Gupta Cancer Centre og Research Institute, sør-24 Parganas, Vest-Bengal, India). Prøvene (ferske biopsi vev) ble samlet inn fra deltakerne med skriftlig informert samtykke godkjent av institusjonelle etiske komité for menneskelig eksperimentering av det indiske Statistisk Institute. Detaljer om fag, vareprøver, DNA, PCR-basert HPV16 deteksjon, bestemmelse av
E2
avbrudd status ved å overlappe DNA-basert PCR og estimering av virusmengde er beskrevet andre steder [12]. Ut av de 184 tilfellene antallet prøver å huse intakt
E2
var 140, og at det å ha forstyrret
E2
var 44.
Fastsettelse av metylering status for HPV16 DNA med restriksjons enzym fordøyelsen og PCR
i
E2
-intact tilfeller metylering status for E2BS-i [50-ACCGAAA
CCGG
T-61] og også den regionen fra LCR til
E6 plakater (LCR
E6
) ble bestemt ved restriksjons-fordøyelse med
HpaII /MspI Hotell og
McrBC
enzymer (New England Biolabs) henholdsvis, og analysert ved PCR, etter publiserte protokoller [9]. Omtrent 20% av metylert (basert på
McrBC
begrensning fordøyelse) saker ble tilfeldig valgt fra hvert av
E2
-intact (30/140) og
E2
-disrupted (9/44) kategorier for bisulfitt sekvensering, ved hjelp av primerpar 5′-TAA GGT TTA AAT TTT TAA GGT TAA TTA AAT-3 «og 5′-ATC CTA AAA CAT TAC AAT TCT CTT TTA ATA-3» dekker stillinger 7748 -115 [18].
RNA isolering og revers transkripsjon
Totalt RNA, fra 41 kreftprøver, ble isolert, renset og behandlet med DNase jeg bruker Qiagen RNeasy sensoren ved å følge produsentens protokoll. Ett mikrogram av total RNA ble revers-transkribert ved hjelp av 200U fra M-MuLV revers transkriptase (Fermentas) i en 20 pl reaksjon inneholdende 5X RT-buffer [Fermentas; 250 mM Tris-HCl (pH 8,3 ved 25 ° C), 250 mM KCl, 20 mM MgCl
2, 50 mM DTT], 10 mM dNTP, 0,1 M DTT, 20U RNase inhibitor og 400 ng (dT) 17 -P3 primer. Blandingen inneholdende RNA og primere ble oppvarmet ved 70 ° C (10 minutter) og avkjølt (10 minutter) før tilsetning av 5X buffer, 0,1 M DTT og RNase-inhibitor, og deretter inkubert ved 25 ° C (2 minutter), etterfulgt av Tilsetningen av revers transkriptase og påfølgende inkubasjoner ved 25 ° C (10 minutter) og 42 ° C (60 minutter). Reaksjonsblandingen ble inaktivert ved 70 ° C (15 minutter).
Bekreftelse av fysiske tilstand av HPV16 genomer og tilstedeværelse av det virale transkriptet, E7-E1∧E4, i CaCx tilfeller ved APOT-koplede-kvantitativt RT-PCR-analyse – en ny teknikk
Concept of APOT-kombinert-kvantitativ-RT-PCR-analyse
APOT analysen ble brukt primært for å få forsterket produkter over hele regionen fra
E7
til
E2
hjelp total cDNA dannet med en oligo-dT primer (dT) 17-P3, hvor P3 var en adapter sekvens (etter prinsippet om 3 «RACE) [19]. I stedet for den påfølgende måte å bekrefte intactness av virale genomer ved Southern hybridisering, nestet PCR med separate RT-PCR (TaqMan) primer-probe sett for
E7 Hotell og
E4
ble utformet i denne studien å sjekke intactness av virale genomer basert på kvantitative forskjellen mellom
E7 Hotell og
E4
transkripsjonsnivåer.
E7
er alltid (både i episomal og integrerte forhold) funnet å være intakt på grunn av sin rolle i onkogenisitet, og det ikke havna noen spleise-krysset området. Så, kvantifisering av
E7
transkripsjon fra viral cDNA bassenget kan markere viral tilstedeværelse uavhengig av genomisk status (episomal eller integrert). På den annen side,
E2
koding av intakt repressoren beholder
E4, etter som i sin tur holder hengselet-kodende område av E2-proteinet. Hengsel-kodende region velig havner flertall av avbrudd områder for viral integrering i vertsgenomet [20]. Dermed kvantifisering av hengslene-kodende region innenfor
E4
fra viral cDNA bassenget, kunne markere tilstedeværelsen av intakt
E2
. Så sonde-primersett ble utformet for
E7 Hotell og
E4
for TaqMan-baserte QRT-PCR på APOT-PCR produktene. Differential forsterkning av
E7 Hotell og
E4
i episomer og integrerer kan være indisert ved forskjeller i C
T-verdier på
E7
– og
E4
-spesifikk QRT-PCR.
APOT-PCR.
Den første PCR med P1 (5′-CGG ACA GAG CCC ATT ACA AT-3 «) og P3 (5» GAC TCG AGT CGA CAT CG-3 «) og den andre nestet PCR med P2 (5′-CCT TTT GTT GCA AGT GTG ACT CTA CG-3′) og (dT) 17-P3 (5»-GAC TCG AGT CGA CAT CGA TTTTTTTTTTTTTTTT-3 «) ble utført på 41 CaCx tilfeller følgende publiserte protokoller [19]. PCR-produktene ble undersøkt ved agarosegel (1,5%) elektroforese av P2 -.. (DT) 17-P3 produkter
TaqMan-baserte kvantitativ RT-PCR av E7 og E4 på APOT-PCR-produkter
reaksjonen mix (10 mL) av
E7 Hotell og
E4
duplex QRT-PCR inneholdt 2X TaqMan® Universal PCR Master mix (Applied Biosystems), 3 ng primere og 2 mikrometer probe . Primeren-probe for HPV16
E7 plakater (frem: 5’AAG TGT GAC TCT ACG CTT CGG TT -3 «; omvendt: -5» GCC CAT TAA CAG GTC TTC CAA A- 3 «; probe: 5’FAM-TGC GTA CAA AGC ACA CAC GTA GAC ATT CGT A-BHQ -3 «) og HPV16
E4 plakater (frem: 5’CTT GGG CAC CGA AGA AAC AC -3′; omvendt: 5′-GAT TGG AGC ACT GTC CAC TGA GT -3 «; probe: 5′-Vic-ACG ACT ATC CAG CGA CC-BHQ -3») produsert 78 bp og 118 bp amplikonene hhv. Den sanntids-PCR-programmet inngår UNG-aktivering ved 50 ° C i 2 minutter, innledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder og annealing ved 60 ° C i 1 minutt. PCR-kontrollene var NTC (non-mal kontroll) samt separate porsjoner fra revers transkripsjon reaksjoner med (i) alle reagenser unntatt mRNA, (ii) mRNA og alle reagenser men ingen revers transkriptase, og (iii) HPV-negative celle mRNA. Den duplex Analysen ble utført minst to ganger, med tre replikater per prøve i hver analyse.
PCR fra GAPDH, og TP53 for å bekrefte tilstedeværelse av mRNA og fravær av DNA
Tilstedeværelse av mRNA ble bekreftet ved hjelp PCR med primere som spenner ekson-exon krysset av
GAPDH
. Reaksjonen volum på 10 ul inneholdt 1,25 mM MgCl
2, 100 mM dNTP, 1 enhet AmpliTaq Gold® DNA polymerase (Applied Biosystems) og 50 ng primere (forward: 5′-CAG CCT CAA GAT CAT CAG CA-3 «; omvendt: 5′-TGT GGT CAT GAG TCC TTC CA-3») og 1 ul cDNA i 10X AmpliTaq Gold ® buffer (Applied Biosystems). PCR Programmet omfattet 40 sykluser med denaturering ved 94 ° C, hybridisering ved 55 ° C og forlengelse ved 72 ° C, hver i 1 minutt, sammen med innledende denaturering i 8 minutter ved 95 ° C og endelig forlengelse i 5 minutter ved 72 ° C. Tilstedeværelse av 106 bp fragment ble sjekket inn 2,5% agarosegel.
Fravær av DNA-kontaminering ble bekreftet ved PCR med primere som spenner introner av
TP53
. Reaksjonen volum på 20 ul inneholdt 2 mM MgCl
2, 50 mM dNTP, 1 enhet AmpliTaq Gold® DNA polymerase (Applied Biosystems), 40 ng primere (forward: 5′-CCT GAA AAC AAC GTT CTG GTA A- 3 «, omvendt: 5′-GCA TTG AAG TCT CAT GGA AG-3») og 2 ul cDNA i 10X AmpliTaq Gold ® buffer (Applied Biosystems). PCR programmet stod for 35 sykluser med denaturering ved 94 ° C, hybridisering ved 56 ° C og forlengelse ved 72 ° C, hver i 1 minutt, sammen med innledende denaturering i 8 minutter ved 95 ° C og endelig forlengelse i 5 minutter ved 72 ° C. Tilstedeværelse av 448 bp fragment ble sjekket inn 1,5% agarosegel.
Relativ kvantifisering av
E7 Hotell og
E2
mRNA uttrykk av qRT- PCR (TaqMan)
E7 Hotell og
E2
genekspresjon ble kvantifisert blant en undergruppe av 30 prøver, hvorav 17 var episomal (ren eller samtidig) og 13 ble rent integrert ved QRT-PCR (relativ kvantifisering med sammenlignende C
T-metoden). E7 ekspresjon ble kvantifisert ved hjelp av den samme primer-probe set som i APOT-koplede-kvantitativ RT-PCR-assay [
21
].
E2
uttrykk ble anslått fra 82 bp fragment av E2-spesifikk primer-probe [fremover: 5 «AAC GAA GTA TCC TCT CCT GAA ATT ATT AG 3»; omvendt: 5 «CCA AGG CGA CGG CTT TG 3»; probe: 5 «(BODIPYR6G) -CAC CCC GCC GCG ACC CAT A- (DQ) 3»]. Reaksjonsblandingen (10 ul) inneholdt 2 ul cDNA, 50 ng primere, 0,1 mikrometer prober og 2X TaqMan® Universal PCR Master Mix, (Applied Biosystems). Menneskelig ACTB Endogen Control (VIC /MGB Probe, Primer Limited) (Applied Biosystems) (amplicon size = 171 bp) ble brukt som normalizer. PCR-programmet og kontrollene som ble brukt var samme som i APOT-koplede-kvantitativ RT-PCR-analyse. Analysene, med tre gjentak per prøve, ble gjentatt to ganger.
Statistiske analyser
Kolmogorov-Smirnov test ble utført for å finne ut om test-variabler som viruskopiantall, uttrykk for husholdningsgenet og virale gener fulgte normalfordeling. Uavhengig to-utvalgs t-test og Mann-Whitney U-test ble brukt for å identifisere forbindelse med sykdom fenotype, henholdsvis for variabler som fulgte normalfordeling og de som ikke gjorde det. Chi-kvadrat analyse ble utført for å teste for sammenslutning av metylering innen E2BS-I med
E2
avbrudd-status blant CaCx prøvene.
k
en anordning clustering algoritmen (
k
= antall klynger) ble brukt til å kategorisere ulike former for rent integrerte virale genomer. Alle analyser ble utført ved hjelp av programvarepakke, SPSS for Windows v16.0.
Resultater
Metylering status for LCR og E2BS-I (nukleotid 58) av HPV16 positiv CaCx tilfeller huse intakt eller forstyrret
E2
Etter vår tidligere studie [9] vi undersøkt videre rolle CpG metylering ved nukleotid (nt) 58 innen E2 bindingssete i (E2BS-i), i CaCx patogenesen ved en direkte sammenligning mellom HPV16 positiv CaCx tilfeller skjuler virale genomer med intakt eller forstyrret E2-genet ved hjelp av et utvidet sett av ett hundre og åtti-fire CaCx prøver. Begrensning fordøyelse (
HpaII /MspI
) og påfølgende PCR-analyse viste metylering ved E2BS-I (nukleotid 58), proksimal til p97 arrangøren i LCR, for å være betydelig høyere (p 0,001) mellom
E2
-intact tilfeller (69/140, 49,28%) sammenlignet med
E2
-disrupted tilfeller (5/44, 11,36%).
bisulfitt-sekvensering analyse av LCR DNA fra 39 CaCx tilfeller bekreftet at blant
E2
-intact tilfeller (n = 30), metylering var mer fremtredende (figur 1) ved nukleotid posisjonerer 31 (SPI bindingssetet, 63,33%), 37 og 43 (E2BS-II, 86,66% og 60%, henholdsvis), 52 og 58 (E2BS-i, 70% og 83,33%, henholdsvis) sammenlignet med den virale replikasjonsorigo (posisjon 7862, 3,3%). Videre sammenlignet med
E2
-intact tilfeller,
E2
-disrupted tilfeller (n = 9) portrettert ingen metylering ved posisjonene 7862 og 31 og mindre metylering ved de andre posisjonene. Representative electropherograms er vist i figur S1.
(A) Søylediagram som sammenligner prosentandel av prøvene metylert ved forskjellige CPGs i LCR av HPV16-genomet mellom
E2
-intact og
E2
-disrupted prøver. (B) skjematisk fremstilling av de nevnte CpG stillinger i LCR: 7862 – Viral replikasjonsorigo; 31 – Spi bindingssete; 37 og 43 – E2BS II; 52 og 58 – E2BS I.
Bekreftelse av tilstedeværelsen av viral transkripsjon
E7-E1∧E4
som koder repressor E2 i CaCx tilfeller basert på APOT-kombinert-kvantitativt RT-PCR-analyse og klassifisering av prøver i episomal (ren eller samtidig) og rent integrerte virale genomiske former
Etter å ha bekreftet forekomst av metylering i CPGs innen E2 bindingsseter grenser til p97 promoter i tilfeller huse intakt
E2 Hotell og fravær i tilfeller huse forstyrret
E2
, vårt neste mål var å bekrefte tilstedeværelse av E7-E1∧E4 transkripsjoner i det tidligere å bekrefte uttrykk for repressor
E2
transkripsjoner i slike tilfeller i motsetning til de tilfeller ha forstyrret
E2
. Vi har anvendt den APOT analysen i hvilket tilfelle nærvær av bandet størrelse på 1050 bp ved elektroforese av PCR-produkter erholdt med P2 og (dT) 17-P3 primere i 1,5% agarosegel (figur 2A), ble betraktet som spesifikke for repressor
E2
-splice variant,
E7-E1∧E4
, etter kodet fra intakt
E2
genet. Fravær av 1050 bp bandet og tilstedeværelse av band av andre enn 1050 bp lengder indikerer tilstedeværelse av integrere-avledet transkripsjoner [19]. Men tilstedeværelse av 1050 bp bånd sammen med off-størrelse bånd indikere tilstedeværelse av blandede eller samtidig former, dvs., sameksistens av episomal og integrerte former av virale genomer. En slik analyse identifisert 22 CaCx tilfeller portretterer tilstedeværelsen av
E7-E1∧
E4 transkripsjon og dermed E2-repressor transkripsjoner og 19 CaCx tilfeller mangler tilstedeværelsen av denne karakterutskrift. De CaCx tilfelle kan således bli spekulert som skjuler episomal (n = 4), samtidig behandling (n = 18) og integrert (n = 19) former av virale genomer, som vi bekreftet senere ved å utføre sanntids-PCR (Taqman-analyse) ved hjelp av PCR produktene oppnådd med P2 og (dT) 17-P3 primere, tilsvarende
E7 Hotell og
E4
uttrykk, i stedet for Southern hybridisering.
The real-time PCR ( RT-PCR) data tilsvarende
E7 Hotell og
E4 plakater (figur 2B) har vært representert som C
T-verdier, der C
T er definert som terskelen syklus av PCR ved hvilken, ble det amplifiserte produktet først detektert.
E7
– og
E4
-spesifikke PCR effektivitet ikke variere basert på absolutt kvantifisering av standardkurve metode ved hjelp av ulike kopiantall (1,75 × 10
8, 1,75 × 10
6 og 1,75 × 10
4 eksemplarer) av pUC19 plasmid vektor med HPV16 referansesekvens innsats (figur S2). Tilstedeværelse av mRNA ble bekreftet ved PCR med primere som spenner ekson-exon krysset av
GAPDH plakater (figur 2C) og fravær av DNA-kontaminering ble bekreftet ved PCR med primere som spenner introner av
TP53 plakater (figur 2D )
(A) representant gelelektroforese viser P2 -. (dT) 17-P3 produkter. Felt 1: prøve viser nærvær av 1050 bp bånd-størrelse som indikerer episomal virale genom. Tilstedeværelsen av andre band-størrelser indikerer samtidig status; Sporene 2, 3, 4, 6: Fravær av band-størrelse 1050 bp indikerer integrert status av disse prøvene. Lane 5: 100 bp stige (Roche). (B) TaqMan-baserte kvantitative RT-PCR forsterkning plott av
E7 Hotell og
E4
cDNA.
E7
er transkribert i både episomal (ren eller samtidig) og integrert tilfeller, men
E4
er transkribert i bare episomale tilfeller. (C) Agarose gel elektroforese av PCR-produkter av
GAPDH
cDNA (primere span ekson-exon krysset). Felt 1: negativ kontroll; Felt 2: CaSki-cellelinje DNA (negativ kontroll); Lanes 3-7: prøve cDNA som viser spesifikk bandet størrelse på 106 bp; Lanes 3 og 7 viser episomal (rene eller samtidig) prøver T323 og T329, henholdsvis, mens, Lanes 4-6 viser rent integrerte prøver T327, T326 og T328, henholdsvis; Lane 8:
Hae
III fordøyd x174 DNA-markør (Promega)?. (D) Agarosegel-elektroforese av PCR-produkter av
TP53
cDNA (primere span introner). Lane 1-6, 8, 9: prøve-cDNA ikke vist spesifikt bånd størrelse på 448 bp; Lanes 1, 2, 4, 6 og 9 viser rent integrert prøver T326, T327, T345, henholdsvis T344 og T328, mens, baner 3, 5 og 8 viser episomal (ren eller samtidig) prøver T329, T323 og T339, henholdsvis; Lane 10: CaSki cellelinje DNA (positiv kontroll); Lane 11: prøve-DNA (positiv kontroll); Lane 12: vann (negativ kontroll); Lane 7:?.
Hae
III fordøyd x174 DNA-markør (Promega)
Ifølge APOT-kombinert-kvantitativ-RT-PCR-analyse, genomisk status for HPV 16 kunne også tolkes på grunnlag av forholdet,
E7
C
T /
E4
C
T. De CaCx prøver (19/41) viser
E7 Hotell og
ACTB
uttrykk, men ingen
E4
uttrykk (
E7
C
T /
E4
C
T = ubestemt), ble utpekt som tilfeller med integrerte virale genomer. CaCx prøver (18/41) som viser mer uttrykk for
E7
enn
E4 product: (
E7
C
T /
E4
C
T≤1) sammen med
ACTB
uttrykk, ble betraktet som tilfeller portretterer tilstedeværelse av både episomal og integrerte virale genomer (samtidig). Det var fire CaCx tilfeller viser tilsvarende nivåer av uttrykk for både
E7 Hotell og
E4 product: (
E7
C
T /
E4
C
T = 1) sammen med
ACTB
uttrykk, og disse ble ansett som prøver husing episomale virale genomer. Det var ingen signifikant (p = 0,186; t-test) forskjell i
ACTB
mRNA uttrykk mellom CaCx tilfeller skjuler episomale virale genomer (rent og samtidig) med gjennomsnitt ± SD = 32.98 ± 3.99 og rent integrerte virale genomer med gjennomsnitt ± sd = 34,99 ± 3,26. Dermed 53,66% (22/41) av CaCx tilfeller næret intakte virale genomer hvorav 18,18% (4/22) hadde rene episomale genomer og 81,82% (18/22) hadde ledsagende genomer (tabell 1).
reanalyse av våre data på E2BSI metylering ved nt 58 i LCR på denne undergruppe av prøvene, avslørte også at en slik metylering var signifikant (p
trend = 0,001) høyere blant de sakene som skildrer episomal (ren og samtidig) virale genomer (17/22; 77,27%) i forhold til de som har rent integrerte virale genomer (5/19, 26,32%).
Analyse av uttrykk for
E7 Hotell og
E2
gener i CaCx tilfeller skjuler episomal (ren og samtidig) eller rent integrert HPV16 genomer og sammenheng med virusmengde
Vårt neste mål var å undersøke om de to typer kreft, (i) de som skjuler episomal ( ren og samtidig) og (ii) integrert virusformer, skilte seg i viral onkogene uttrykk, ved å analysere
E7
mRNA. Vi kvantifiseres
E7
uttrykk (normalisert ved
ACTB
) av TaqMan-baserte QRT-PCR av cDNA produkter som genereres direkte fra mRNA, i en undergruppe av 17 episomal (rent episomal og samtidig) og 13 rent integrerte tilfeller.
E7
mRNA uttrykk (
E7
C
T /
ACTB
C
T) ble funnet å være normalfordelt i både episomal (Kolmogorov-Smirnov Z-verdi = 0,418, p = 0,995) og integrerte (Kolmogorov-Smirnov Z verdi = 1,06, p = 0,211) tilfeller. Forholdet,
E7
C
T /
ACTB
C
T, var signifikant lavere (p 0,001; t-test) blant episomal (gjennomsnitt ± sd = 0,84 ± 0,15) enn integrert (gjennomsnitt ± sd = 1,12 ± 0,18) tilfeller som indikerer høyere
E7
uttrykk i det tidligere.
Relativ kvantifisering basert på komparative C
T-metoden også avdekket signifikant forskjell (p 0,001; Mann-Whitney U-test) mellom A C
T (
E7
C
T –
ACTB
C
T) verdier av tilfeller med integrert virus genomer (median A C
T = 1,26) og med episomale genomer (median A C
T = -4,97). Den sammenleggbare endringen analyse (ved hjelp av to
-ΔΔCT, hvor ΔΔC
T = median A C
T av episomal – median A C
T integrert), avbildet som
E7
uttrykk i tilfeller med episomal (ren og samtidig) virale genomer var 75.087 folder høyere enn tilfeller med rent integrerte virale genomer
viral kopiantall (naturlig log transformert) per 100 ng genomisk DNA var også signifikant høyere (p. 0,001 ; Mann-Whitney U-test) blant de 17 episomale tilfeller (median ln (virusmengde) = 18,02 per 100 ng DNA) i forhold til de 13 rent integrerte tilfeller (median ln (virusmengde) = 9,28 per 100 ng DNA). Forholdet,
E7
C
T /
ACTB
C
T, ble funnet å være signifikant korrelert med virusmengde (p = 0,007, R
2 = 0,398) de episomale prøver (ren og samtidig) (figur 3A), men ikke innenfor de rent integrerte prøvene (p = 0,51;. R «sup> 2 = 0,038) (figur 3B)
(A) korrelasjon av
E7
C
T /
ACTB
C
T med virusmengde (naturlig logg verdiene) i CaCx tilfeller med episomal (rent episomal og samtidig) virale genomer; (B) Korrelasjon av
E7
C
T /
ACTB
C
T med virusmengde (naturlig logg verdiene) i CaCx tilfeller med integrerte virale genomer; (C) Korrelasjonen av
E2
C
T /
ACTB
C
T med virusmengde (naturlig logg verdiene) med hensyn til
E2
genet i CaCx tilfeller med episomal (rent episomale og samtidige) viral genom.
episomal (rene og samtidige) tilfeller viste samtidig uttrykk for
E2
mRNA (gjennomsnitt (
E2
C
T /
ACTB
C
T) ± sd = 0,92 ± 0,18), mens de rent integrerte tilfellene klarte å gjøre det. Forholdet,
E2
C
T /
ACTB
C
T, ble funnet å være signifikant korrelert (p 0,001; R
2 = 0,621) (Figur 3C) med
E2
gen kopiantall (median ln (
E2
belastning) = 15,41 per 100 ng DNA) blant slike tilfeller skjuler episomal (ren og samtidig) virale genomer.
Felles analyse av
E7
C
T-verdier fra APOT-kombinert-kvantitativ-RT-PCR-analyse og virusmengde blant CaCx prøver portretterer rent integrerte HPV16 genomer syssels
k
en anordning clustering
den manglende korrelasjonen av
E7
uttrykk med virusmengde, blant CaCx tilfeller med integrerte virale genomer, pekte mot muligheten for eksistensen av heterogenitet blant slike CaCx tilfeller med hensyn til
E7
uttrykk. Vi dermed ytterligere analysert våre data ved å utføre en klyngeanalyse (
k
en anordning clustering) basert på virusmengde og
E7
C
T (APOT-kombinert-kvantitativ-RT-PCR ). En slik analyse kan optimalt klassifisere tilfeller med forstyrret virale genomer (46,34%; 19/41) inn i fire grupper (figur 4) som vist i tabell 2. De respektive klase sentre har vært representert i tabell 3.
ACTB
mRNA uttrykk av disse tilfellene ikke korrelerer med en av deres virusmengde (p = 0,588; lineær regresjon), eller
E7
C
T-verdier (APOT-kombinert-kvantitativ-RT-PCR) (p = 0,753; lineær regresjon)
Cluster. 1: lav virusmengde og lav
E7
uttrykk; Cluster 2: høy virusmengde og lav
E7
uttrykk; Cluster 3: moderat virusmengde og moderat
E7
uttrykk; Cluster. 4: lav til moderat virusmengde og høy
E7
uttrykk
Av disse fire klyngene, Cluster 1 (gjennomsnittlig virusmengde ± sd = 6,87 ± 1,074; middel
E7
C
T ± sd = 37,91 ± 1,416) inkludert 6 prøver (31,60% av rent integrerte prøver). Samlet sett disse hadde lav virusmengde og lav
E7
uttrykk. Cluster 2 (gjennomsnittlig virusmengde ± sd = 17,01 ± 1,447; middel
E7
C
T ± sd = 36,38 ± 1,948) inkludert også 6 prøver (31,60% av rent integrerte prøver), som hadde høy virus belastning og lav
E7
uttrykk. Blant disse prøvene,
ACTB
transkripsjon (med samme mengde cDNA som brukes i APOT-kombinert-kvantitativ-RT-PCR-analyse for
E7 Hotell og
E4
) korrelerte ikke med virusmengde (p = 0,942; lineær regresjon). Cluster 3 (gjennomsnittlig virusmengde ± sd = 14,72 ± 3,359; middel
E7
C
T ± sd = 12,47 ± 2,128) inkluderte 5 prøver (26,32% av rent integrerte prøver) og disse portrettert moderat virusmengde og moderat
E7
uttrykk. Cluster 4 (gjennomsnittlig virusmengde ± sd = 9,36 ± 2,694; middel
E7
C
T ± sd = 2,41 ± 0,467) inkludert 2 prøver (10,56% av rent integrerte prøver), som avslørte lav til moderat virusmengde og svært høy
E7
uttrykk. Distansene av prøver fra sentrene for deres tilsvarende klynger er gitt i tabell 2. Dermed av de fire klynger, to ble funnet å være preget av moderat til høy
E7
uttrykk og de resterende to avbildet lav
