Abstract
Bakgrunn
aklorhydri forårsaket av f.eks atrofisk gastritt gjør det mulig for bakteriell overvekst, som induserer kronisk inflammasjon og skade på mukosaceller av infiserte individer kjøre gastrisk ondartede sykdommer og kreft.
Enterococcus faecalis product: (
E. Faecalis
) kan kolonisere achlohydric mager og vi ønsket derfor å studere virkningen av
E. faecalis
infeksjon på inflammatorisk respons, reaktive oksygenforbindelser (ROS) formasjon, mitokondrie respirasjon, og mitokondrie genetisk stabilitet i mage slimhinneceller.
Metoder
For å skille endringer indusert av bakterier fra de av betennelsesceller vi etablert en
in vitro E. faecalis
infeksjonsmodell systemet ved hjelp av magekreft cellelinje MKN74. Total ROS og superoksid ble målt ved fluorescens mikroskopi. Cellular oksygenforbruk ble preget non-invasiv bruker XF24 mikroplatebasert respirometri. Genuttrykk ble undersøkt av microarray, og respons trasé ble identifisert ved Gene Set Analysis (GSA). Valgte gentranskriptene ble bekreftet ved kvantitativ sanntids-polymerase kjedereaksjon (QRT-PCR). Mitokondrie mutasjoner ble bestemt ved sekvensering.
Resultater
Infeksjon av MKN74 celler med
E. faecalis
indusert intracellulær ROS produksjon gjennom en vei uavhengig av oksidativ fosforylering (oxphos). Videre
E. faecalis
infeksjon indusert mitokondrie-DNA ustabilitet. Etter infeksjon, gener som koder for inflammatoriske respons proteiner var transcriptionally oppregulert, mens DNA-skade reparasjon og cellesykluskontroll gener ble nedregulert. Cellevekst bremset ned når infisert med levedyktig
E. faecalis Hotell og svarte på en doseavhengig måte å
E. faecalis
lysat.
Konklusjoner
Infeksjon med
E. faecalis
indusert en oxphos uavhengig intracellulær ROS respons og skadet den mitokondrielle genomet i mage cellekultur. Endelig bakterier forårsaket en NF-kB betennelsesreaksjon samt nedsatt DNA skade respons og cellesykluskontroll genuttrykk.
transkripsjon profilering
Array Express sjonsnummer E-MEXP-3496.
Citation: Strickertsson JAB, Desler C, Martin-Bertelsen T, Machado AMD, Wadström T, Winther O et al. (2013)
Enterococcus faecalis
infeksjon forårsaker betennelse, Intracellulær Oxphos-Uavhengig ROS produksjon, og DNA-skade i Human Gastric kreftceller. PLoS ONE 8 (4): e63147. doi: 10,1371 /journal.pone.0063147
Redaktør: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, USA
mottatt: 28 august 2012; Godkjent: 02.04.2013; Publisert: 30 april 2013
Copyright: © 2013 Strickertsson et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. AMDM er støttet av et fellesskap fra portugisisk Science, Technology Foundation. LFH er støttet av den danske MRC. Jabs er støttet av den danske Kreftforeningen og Universitetet i København SUND. TMB og OW støttes av en bevilgning fra Novo Nordisk Foundation til Bioinformatikk Centre. CD og LJR støttes av NORDEA-fonden. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er blant de ti mest vanlige kreftformer, og med en global årlig dødelighet på ca 700.000, er det den nest vanligste årsaken til kreftrelatert dødelighet [1]. Tarm typen magekreft utvikler seg gjennom en serie av patologiske hendelser starter med kronisk betennelse, atrofisk gastritt, intestinal metaplasi, og til slutt kreft [2].
Kronisk betennelse og kreft har blitt koblet i flere studier av pasienter og av genetisk modifiserte mus, og antas å være involvert i patogenesen av omtrent 25% av alle krefttilfeller i verden [2] – [4]. Karakteristika for kreft-relaterte inflammasjon omfatter tilstedeværelse av kjemokiner og cytokiner i tumorvev, som har potensial til å stimulere tumor-celle-proliferasjon og overlevelse av maligne celler [5], [6]. Kronisk inflammasjon favoriserer også en overproduksjon av DNA-ødeleggende reaktive oksygenarter (ROS), hvis produksjon kan være tilfeldige oksidativ fosforylering (oxphos) reaksjoner i mitokondriene (oxphos avhengig) eller fremstilt fra utsiden mitokondriene oftest av nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat ( NADPH) oksidase (oxphos uavhengig) (for oversikt se [7] – [9]). Kronisk produksjon av ROS forårsake DNA-skade, slik at akkumulering av mutasjoner som i sin tur kan aktivere onkogener og /eller inaktivering av tumorsuppressorgener og dermed øke risikoen for kreftutvikling [3].
Den vanligste risikofaktor for å utvikle magekreft er kronisk bakteriell infeksjon i magen med
Helicobacter pylori product: (
H. pylori
) [10]. Kronisk infeksjon i magen ved
H. pylori
påvirker gastrisk pH-balanse og kan forårsake aklorhydri eller hyperchlorhydria [11]. Selv om denne bakterien er klassifisert som et klasse en kreftfremkallende, er det ikke alltid forbundet med en økt risiko for magekreft utvikling. For eksempel
H. pylori
infiserte pasienter med duodenalsår og høye nivåer av magesyre har en redusert risiko for å utvikle magekreft i forhold til de fra den generelle befolkningen [11] – [13]. I motsetning til pasienter med atrofisk gastritt og redusert syresekresjonen har en økt risiko for utvikling av magekreft [11], [13], [14]. Den økte risikoen for kreft i achlorhydric individer kan skyldes bakteriell overvekst av andre bakterier i mage lumen [15]. I begge achlorhydric mennesker og dyremodeller bakteriell overvekst årsaken kronisk gastritt som utvikler seg til intestinal metaplasi og til slutt magekreft [16] – [18]. Blant de bakterier som finnes i magesekken av achlorhydric mus var
enterokokker
art, som er gram-positive kokker i stand til å overleve i miljøer med en pH så lav som 4,5 [19], [20].
Enterococcus faecalis product: (
E. Faecalis
) er et medlem av den menneskelige commensal microbiota og en av de mest vanlige bakterier i mage-tarmkanalen [19]. Til tross for dette,
E. faecalis
kan fungere som et humant patogen [21], og har blitt funnet i betydelig antall i orale til kreft og i humane tykktarmkreftformer [22], [23]. I forhold til dette
E. faecalis
er i stand til å produsere N-nitrosaminer og for å indusere genetisk ustabilitet i colonic epitelceller gjennom oksidativ skade på DNA [24], [25].
gastritt er forbundet med infiltrasjon av immunceller i vev, noe som gjør det vanskelig å dissekere handling av immunceller fra at av fôr slimhinnecellene
in vivo
. Vi har derfor brukt en
in vitro
vev kultur modell som tillot oss å undersøke hvor isolert slimhinneceller svare på bakterier og de molekylære mekanismer som tarmbakterier, som
E. faecalis
indusere skader i mage epitelceller. Ved hjelp av denne modellen vi undersøkt effekten av
E. faecalis
infeksjon i mage adenokarsinom cellekulturer på ROS produksjon, cellulær respirasjon, vekst, DNA-skade /reparasjon og inflammatoriske responser.
Materialer og metoder
Cell Culture,
E. faecalis
, og vekstvilkår
Menneske MKN74 adenokarsinom cellekulturer fra den japanske Innsamling av forsknings Bioressurser cellen bank (JCRB # JCRB0255) ble opprettholdt i RPMI 1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, California), supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen), 100 ug /ml streptomycin, og 100 U /ml penicillin (Invitrogen) ved 37 ° C, og 5% CO
2 fuktig atmosfære. Infeksjoner ble utført med
E. faecalis
stamme (ATCC 29212). Bakterier ble dyrket i 5% blod-agar-plater ved 37 ° C. Optisk tetthet (OD) av bakterier som var dyrket i RPMI 1640 medium ble målt ved 550 nm med en UV-1601 spektrofotometer (Shimadzu, Kyoto, Japan) (figur S1).
E. faecalis
lysat ble utarbeidet av fryse /tine bakteriesuspensjonen tre ganger, mens sonicating suspensjon mellom hver syklus.
Infeksjon av mage celler for RNA og DNA
For 24 timer infeksjoner , 80% konfluente MKN74 cellene ble vasket med PBS og inkubert i antibiotikafritt medium. Overnatting dyrkede kolonier av
E. faecalis
ble tilsatt til MKN74 cellekulturen ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 50 bakterier pr celle. 5 dagers infeksjoner ble utført ved å behandle 65% konfluente MKN74 celler med
E. faecalis
ved en MOI på 10 eller med et lysat proteinkonsentrasjon på 40 ug /ul. Hver 24 timer ble cellene vasket med PBS og ferskt medium og bakterier eller lysat ble tilsatt. Kontrollceller ble behandlet på samme måte i fravær av bakterier eller bakterielle lysatet.
In vitro
studier ble gjennomført med et magekreft cellelinje for å teste den skadelige effekten av
E. faecalis
på mage adenokarcinomceller. Disse cellene skiller seg fra normale gastriske epitelceller ved å gjennomføre flere kromosomale aberrasjoner, men har fordelen av å være en reproduserbar modell system som på mange måter replikerer de hendelser som inntreffer i magen. Sammenligning av infiserte celler til ikke-infiserte celler gir et pålitelig bilde av skader og endringer i genekspresjon forårsaket av infeksjonen.
RNA og DNA
Etter infeksjon, RNA og DNA ble ekstrahert ved tilsetning av Trizol reagens (Invitrogen) til hver kulturflaske. RNA ble isolert i henhold til den produserer protokollen. DNA-inneholdende mellomproduktet fase ble utfelt ved tilsetning av 100% etanol. Prøvene ble sentrifugert ved 4 ° C, 3500 g i 6 min. Fenol-etanol Supernatanten ble fjernet og det gjenværende DNA-ekstraksjon ble utført ved hjelp av en NucleoSpin vev kit (Macherey-Nagel, Duren, Tyskland). RNA- og DNA-konsentrasjoner ble målt på et Nanodrop ND-1000 spektrofotometer. RNA integritet tall ble målt på en 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, California) i henhold til de produserer protokollen.
Måling av ROS og Superoxide
To dager før infeksjon 8 × 10
4 MKN74 celler ble sådd ut i hver brønn i en Lab-Tek
TM Chambered Coverglas (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts). MKN74 celler ble farget i to timer før infeksjon med 2-Plex deteksjon mix. ROS og superoksid farging ble utført ved hjelp av ROS /RNS Detection Kit (Enzo Life Sciences, Farmingdale, New York) i henhold til produsentens anvisninger. MKN74-celler ble infisert ved MOI på 50 ° C i 30 minutter og analysert under et Zeiss LSM 510 konfokalt mikroskop ved hjelp av LSM 510 programvaren (Zeiss, Oberkochen, Tyskland). Infisert farget MKN74 celler ble brukt som negativ kontroll.
Lokalisering av
E. faecalis
under infeksjon
8 × 10
4 MKN74 celler /brønn ble sådd i en 8-kammer glassbunn lysbilde (Thermo Fisher Scientific) 24 timer før farging. For å identifisere lokalisering av
E. faecalis
etter smitte vi separat farget plasmamembranen med CellMask
TM Deep Red plasmamembran flekk (C10046, Invitrogen) og den bakterielle celleveggen ved hjelp BacLight
TM Grønn bakteriell flekk (B-35000, Molecular sonder, Invitrogen) i overensstemmelse med de to protokollene hhv. Cellene og bakterier ble vasket 3 ganger i PBS før infeksjon. Cellene ble infisert ved MOI på 100 ° C i 4 timer og analysert under et Zeiss LSK 510 konfokalt mikroskop ved hjelp av LSM 510 programvaren (Zeiss). Dette eksperimentet ble gjentatt tre ganger og 8 champers ble undersøkt hver gang.
XF24 Micro basert respirometri
respirometri av MKN74 celler ble utført ved hjelp av en XF24 ekstracellulær Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA ). Halvparten av belagt MKN74 celler ble infisert med
E. faecalis
på en MOI på 50 for 4, 8 eller 24 timer, mens den andre halvparten var igjen infisert. Etter inkubering ble bakteriene fjernet ved bruk av 4% penicillin /streptomycin (5 U /ml) og 4% cefotaxim (100 ug /ml) (ACS Dobfar Generics S.A., Luxembourg, Belgia). Celler ble inkubert i en CO
2 fri inkubator ved 37 ° C i 1 time for å tillate at temperaturen og pH-likevekt. Mikroplaten med celler ble deretter lastet inn i XF24 og oksygenforbrukshastighet av hver brønn ble målt over en periode på 100 minutter. Legemidlene oligomycin (0,5 um), FCCP (0,3 uM) og antimycin A (2,0 pM) ble etter tur tilsatt til hver brønn. Flere detaljer er tilgjengelig i Fil S1.
mtDNA Ustabilitet
Frekvensen av mutasjoner i D-loop-regionen i mitokondrie-DNA, ble bestemt ved PCR forsterkning bruk av prim C6-CA5 (tabell S1 ). De amplifiserte fragmentene ble klonet inn i pCR2.1 vektor (Invitrogen) og innsatser fra 328 kolonier ble amplifisert ved hjelp av VectorD-sløyfe primere (tabell S1). De forsterkede fragmenter ble renset og sekvensert ved hjelp av ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit og en ABI Prism 3730 DNA Sequencer (Perkin-Elmer, Waltham, Massachusetts). For å bestemme mutasjoner, ble sekvensene brukes som spørringer mot Cambridge referansesekvensen hentet fra MitoMap (https://www.mitomap.org. Aksesseres februar 9. 2012).
microarray og GSA
RNA med en RNA integritet rekke 8 eller høyere fra tre kontroll og tre infeksjonsprøver (med levedyktig
E. faecalis
eller med
E. faecalis
lysat 40 ug /ul) for 24-timers og 5 dagers forsøk ble sendt til RH Microarray Center ved Københavns universitetssykehus. RNA ble forsterket og merket med 3 «IVT Express kit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) i henhold til produsentens anvisninger. 250 ng total RNA ble benyttet som inndata. De merkede Prøvene ble hybridisert til Genechip Genome U133 pluss 2 arrays (Affymetrix). Arrays ble vasket og farget med phycoerytrin konjugert streptavidin bruker en Affymetrix lufthåndtering Station® 450, og arrays ble skannet i en Affymetrix GeneArray® 2500 skanneren for å generere fluorescerende bilder, som beskrevet i Affymetrix GeneChip® protokollen. 24 rå celle intensitet filer (CEL-filer) ble generert i GeneChip® Command Console® programvare (AGCC) (Affymetrix). Den rå CEL-filer ble gjort offentlig tilgjengelig på ArrayExpress med tiltredelse nummer E-MEXP-3496. Forbehandling av mikromatriser for genet sett analyse (GSA) ble gjort med R /Bioconductor [26], [27]. Bakgrunnsjustering, quantile normalisering og endelig samandrag å sondere settuttrykk intensiteter ble utført av GCRMA algoritmen [28] for hver eksperimentell betingelse, separat (File S2).
Kvantitativ Revers transkripsjon PCR
cDNA ble syntetisert ved hjelp av Super III First-Strand Synthesis SuperMix for qPCR (Invitrogen). Genekspresjon ble analysert ved QRT-PCR bruker SYBR grønnere q-PCR SuperMix for ABI PRISM (Invitrogen). Primere ble utformet ved hjelp Primer-Blast programvare fra NCBI på [29]. Reaksjonene ble kjørt på en ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (SDS) fra Applied Biosystems. Data ble normalisert til GAPDH-mRNA-ekspresjon.
Vekst assay
8000 celler ble fordelt til hver brønn av seks 24-brønners plater og inkubert ved 37 ° C og 5% CO
2 etter to dager før behandling. Celler ble behandlet i quadruplicates som følger; 4 brønner av uinfiserte kontrollceller, 4 brønner behandlet med 400 ug /ul
E. faecalis
lysat, 4 brønner behandlet med 40μg /mL lysat, 4 brønner som ble behandlet med 4 ug /ul lysat og 4 brønner behandlet med levedyktig
E. faecalis
på en MOI på 10. En plate av celler ble fiksert hver dag. Fiksering ble utført ved vasking med PBS og feste med 1 ml 10% formalin i 10 min. Fikserte celler ble farget med 1 ml 0,1% krystallfiolett (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri), og platene ble ristet i 30 min. Cellene ble vasket, tørket og krystallfiolett ble ekstrahert med 500 pl 10% eddiksyre. Absorbans ble målt ved 620 nm på en POWERWAVE XS (BioTek Instruments, Winooski, Vermont).
Statistical Analysis
Enkelt klassifisering analyse av varians (ANOVA) ble anvendt for å teste forskjeller i maksimal respiratorisk kapasitet , ATP omsetning og oxphos uavhengig oksygenforbruk. ANOVA ble videre brukt for å teste forskjeller i cellevekst ved ulike behandlinger med
E. faecalis
. Når ANOVA antydet signifikante forskjeller mellom behandlinger ble Tukeys ærlig betydelig metode som brukes til å teste for forskjeller mellom oksygenforbruk eller antall celler. mtDNA mutasjon frekvensene ble vurdert av chi-kvadrat og Fishers eksakte test. ROS Resultatene ble uttrykt som middelverdier av minst tjue uavhengige målinger og analysert ved uparet to-halet
t
-test. QRT-PCR-resultater ble uttrykt som middelverdier av minst tre uavhengige eksperimenter, målt i tre tekniske replikater, og analysert ved uparet to-halet
t
-test. Forskjellene mellom datasettene ble vurdert signifikant ved p-verdier ≤ 0,05. Feilfelt = ± SEM med mindre annet er angitt.
Identifikasjon av regulerte trasé ble gjort av en GSA-metoden, GAGE [30], forbedret for å utnytte tilgjengelige induksjons undertrykkelse informasjon (for omfattende detaljer og beregninger se File S2). Pathways var representert ved lister over gener (gen sett) lastet ned fra Molecular Signaturer Database (MSigDB) 3.0 [31]. C2 samling av kuraterte gensettene (kanoniske trasé og genekspresjonssignaturer av genetiske og kjemiske forstyrrelser) med genet symboler identifikatorer. Gene set p-verdier ble korrigert for multippel testing ved å estimere den falske funnraten og signifikansnivå ble satt til 1%.
Resultater
E. faecalis
infeksjon induserer intracellulær ROS og superoksid produksjon
andre, og vi har tidligere vist at achlorhydric gastrin KO mus hadde bakteriell overvekst med
enterokokker Hotell som er normalt ikke en del av mage flora [ ,,,0],20]. Selv
enterokokker
generelt er antatt å være av lav patogenitet, vedvarende overvekst i achlorhydric mus er assosiert med en inflammatorisk respons og til slutt disse mus utvikler mage kreft [20], [32]. For å karakterisere patologisk prosess i mage cellene vi undersøkt hvordan bakteriene påvirket epiteliale mage celler. Ved anvendelse av prober overvåking intracellulær ROS-produksjon, har vi funnet at 30 minutter etter infeksjon stimulert en betydelig økning i intracellulær ROS dannelse (figur 1A). Med sonder spesifikke for superoksid produksjon vi viste at ROS besto hovedsakelig av superoksid i MKN74 celler (Figur 1a). Fluorescensintensitet ble kvantifisert ved hjelp av LSM 510 programvare og en statistisk signifikant økning i intracellulær ROS og superoksid i de infiserte celler sammenlignet med ikke-infiserte kontrollceller ble observert (figur 1B). Vi fant ingen bevis for at foreslått invasjon av cellene av bakterier, så vi konkludere med at den intracellulære ROS ble produsert av de infiserte celler og ikke av internalisert
E. faecalis product: (Figur 1 C-D).
MKN74 celler infisert med
E. faecalis
i 30 minutter ved MOI50. (A) Representant fluorescens mikroskop bilde av MKN74 celler farget med ROS påvise prober (grønn) og superoksyddannende påvise prober (oransje) Scale barer = 50 mikrometer. (B) Kvantifisering av fluorescens intensitet ved hjelp av LSM 510 programvaren. En statistisk signifikant økning i intracellulær produksjon av ROS (p 0,01) og superoksid (p 0,02) i de infiserte celler sammenlignet med ikke-infiserte kontrollceller ble observert. * Angir signifikant forskjell. (C) Fluorescens bilde som viser MKN74 plasmamembran (rød) og
E. faecalis product: (grønn) etter 4 timer på infeksjon. Flankerer bildene viser YZ og XZ planet. (D) Delt bilde av C. Ingen bevis for bakteriell invasjon av cellene ble observert.
Infeksjon reduserer mitokondrie aktivitet og øker oxphos uavhengig oksygenforbruk
Kilden til ROS funnet etter bakterieinfeksjon kan enten være generert av ekstracellulære bakterier [33] og /eller som produseres fra inne i cellene [34], [35]. Intracellulær ROS kan enten være generert i en oxphos avhengig eller uavhengig måte. For å undersøke og deretter karakterisere mulige intracellulær ROS produksjon forbundet med
E. faecalis
infeksjon; vi målte hvor bakteriell infeksjon påvirket mitokondrie åndedrett ved å måle ATP omsetning, pusteevne og oxphos uavhengig oksygenforbruk (figur 2). For å sikre at resultatene reflekterte åndedrett av de MKN74 cellene eneste, ble alle bakterier fjernet før målingene. Det var ingen signifikant forskjell i ATP omsetning av kontroll-celler dyrket i 4-24 timer, mens en betydelig 2- og 4 ganger reduksjon (p 0,001) av ATP omsetningen var tilstede mellom henholdsvis kontroll-celler og infiserte celler inkuberes i 8 og 24 timer (Figur 2A). En tilsvarende korrelasjon ble funnet i luft kapasitet, hvor kapasiteten til infiserte celler var også signifikant 2- og 4 ganger reduserte (p 0,01) sammenlignet med kontroll-celler etter 8 og 24 timer etter infeksjon (figur 2B). Den oxphos-uavhengig oksygenforbruk av kontrollceller var uforandret for celler dyrket i 4-24 timer. I motsetning til den oxphos-uavhengig oksygenforbruk av celler infisert med bakterier økte fra -50% av den totale oksygenopptak etter 4 timers infeksjon å bli den primære oksygen utilizer (p 0,001) (figur 2C). Dette tyder på at
E. faecalis
samhandle med epitelceller som induserer ROS dannelse og oksygenforbruk av andre intracellulære enzymsystemer enn oksidativ fosforylering. Uttrykk for NOX1-5 og Duox1-2 ble undersøkt i gastrisk cellelinje; Men uttrykket ble ikke påvirket av infeksjon (tabell S2).
MKN74 celler ble inkubert med eller uten
E. faecalis
for 4, 8 eller 24 timer. Bakteriene ble fjernet og oksygenforbrukshastigheten ble målt i en XF24 Ekstracellulær Flux Analyzer. (A) omsetning ATP, (B) respiratorisk kapasitet og (C) oxphos-uavhengige oksygenforbruk ble bestemt som beskrevet i teksten. ▪ = Kontrollceller, ο =
E. faecalis
infiserte celler. (N = 3-6, feilfelt indikerer standardavvik ** og *** angir signifikant forskjell p 0,01 og p 0,001 henholdsvis)
E.. faecalis
infeksjon forårsaket mitokondrie-DNA ustabilitet
Vi har tidligere vist at infeksjon med patogene
H. pylori
stammer induserte mutasjoner i mitokondrie genome i human cellekultur [36]. Gitt at infeksjon med
E. faecalis
øke intracellulær ROS vi undersøkt om det også forårsaket genomisk mtDNA ustabilitet. Den totale hyppigheten av mitokondrie D-loop region mutasjons hendelser var signifikant høyere i MKN74 cellekulturer infisert med
E. faecalis product: (45,5%) enn hos ikke-infiserte kontrollcellekulturer (23,0%; p 0,01) (figur 3). Videre infiserte celler viste et høyere antall overganger (36,4%) enn kontrollcellene (21,8%; p 0,05). Delesjoner (0% kontroll /3,9% infiserte), innsettinger (1,1% kontroll /2,6% infiserte), og transversions (0% kontroll /2,6% infiserte), idet sistnevnte vanligvis sett på som en konsekvens av ROS, ble påvist oftere i infisert celler. Dermed infeksjon med
E. faecalis
induserer mutasjoner i mage celler (figur 3).
Mutasjoner oppdaget i mtDNA D-loop region etter smitte. MKN74 celler ble infisert med
E. faecalis
MOI 10 for 5 dager. Infiserte MKN74 cellekulturer hadde et signifikant høyere antall totale mutasjoner og overgangs mutasjoner enn ikke-infiserte kontrollcellekulturer. * Angir signifikant forskjellig fra ubehandlet celler p. 0,05
Infeksjon forårsaket en NFkB dominert betennelsesreaksjon og en ROS respons
For å få ytterligere biologisk innsikt i cellulære responser i mage celler til
E. faecalis
infeksjon vi utført en microarray analyse undersøke globale endringer i genuttrykk i celler infisert med levedyktig
E. faecalis
eller behandlet med
E. faecalis
lysat. Snarere enn å fokusere på uttrykk for enkeltgener vi brukte GSA [30] for å identifisere stier og prosesser aktivert eller hemmet av infeksjonen. Med fokus på sett av gener i stedet for individuelle gener øker robusthet, sensitivitet og biologisk relevans også for moderat regulerte sett av gener. Dette oppnås ved å øke signal-til-støy-forhold, noe som gjør det mulig å tolke moderate endringer i enkeltgener [37]. GSA testet 2403 gensettene og resulterte i 484 regulert trasé å være statistisk signifikant for enten live-infeksjoner og /eller lysat stimuli (Figur S2). Med fokus på disse veiene statistisk signifikante for live infeksjoner, noen av de gensettene dømt til beste karakter denne studien ble manuelt delt inn i tre grupper (figurene 4, 5 A og 6 A). Undersøke betennelse og ROS,
E. faecalis
infeksjon forårsaket en betydelig oppregulering av flere veier som er involvert i immunresponser, inkludert klynger av kjemokin reseptorer og kjemokin aliserte gener, gener som er involvert i G-proteinkoblet reseptor-ligand-binding, og NFKB aktivering av gener (figur 4, øvre seks gensettene). I tillegg to gensettene omfatter gener som svarer på proinflammatoriske oksidert fosfolipider var sterkt oppregulert. Oksyderte fosfolipider er produsert av ROS og funksjon i et pro-inflammatorisk måte, [38], [39] (figur 4,-genet satt syv og åtte). Hjelpemiddel nærvær av ROS, ble et gen sett av 30 gener kjent for å bli uttrykt i respons til ROS aktivert (figur 4, bunn gen set). Det er kjent at ROS er viktige for lipopolysakkarid (LPS) -driven produksjon av flere pro-inflammatoriske cytokiner [40] er imidlertid grampositive bakterier som for eksempel
E. faecalis
uttrykker ikke LPS. Vi har derfor undersøkt hvordan ekspresjonen av individuelle gener som koder for pro-inflammatoriske cytokiner og kjemokiner ble bevirket som reaksjon på et ikke-LPS-stimulerte infeksjon i løpet av 24 timer og 5 dagers infeksjon (tabell 1). Mange gener involvert i NFkB inflammatorisk veien var signifikant oppregulert under
E. faecalis
infeksjon, inkludert interleukin-1β (IL-1SS), interleukin-1-reseptor-assosiert kinase 2 (IRAK2), VEGF, IL-8, IL-23α, IL-11, og tumornekrosefaktor-α (TNF α) de fleste som kan videre forplante NF-kB aktivering respons [41] – [44]. Blant disse var flere cytokiner tidligere identifisert i
H. pylori
medierte infeksjoner, for eksempel IL-8 og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), begge forbundet med angiogenese og med avansert magekreft, IL-1SS som er en kraftig inhibitor for syresekresjon, og også TNF-α, en regulator av celleproliferasjon, differensiering og apoptose [43] – [45]. I tillegg cytokinet IL-23α som fremmer tumor forekomst og vekst [46] og er sterkt produsert i
H. pylori
kolonis mukosa [47] ble oppregulert sammen med IL-11 som er et parietalcellen cytokin som blokkerer mavesyresekresjon, fremmer atrofisk gastritt og tumorigenesis [48], [49]. Blant andre gener funnet å vise høy, og betydelige uttrykksnivåer under infeksjon var IL-1α, IL-32, vekst differensiering faktor 15 (GDF15) og, chemokine (C-C motiv) ligand 22 (CCL22). I tillegg er en oppregulering av peroksyddismutase 2 (SOD2), som konverterer superoksyd til hydrogenperoksyd, ble sett. IL-8, Interferon regulerende faktor 1 (IRF-1) og TNFa ble validert ved QRT-PCR (figur 4 B).
(A) En del av GSA resultat. Fra det parti av gensettene vesentlig anriket på MKN74 celler infisert i 24 timer, ble en undergruppe av gensettene manuelt valgt ved forbindelse med inflammatorisk respons og respons på ROS. Tallene i parentes angir harde effektivt antall av gener i genet settet. Tittelen på hvert gen sett tilsvarer tittelen gitt på MSigDB nettstedet. Tall i fargede bokser justeres p-verdier (Q-verdier), svart indikerer statistisk signifikans på 1% FDR. (B) Karakterisering av QRT-PCR av vitnemål som koder for viktige cytokiner og chemokiner etter
E. faecalis
infeksjon i 24 timer (MOI50) og 5 dager (MOI10). * Angir signifikant forskjellig fra ubehandlede celler p. 0,05
(A) En del av GSA resultat etter 24 timer på infeksjon. Gene sett forbundet med DNA-skade reparasjon med samme oppsett som figur 4 A. (B) Karakterisering av vitnemål som koder for viktige gener involvert i MMR etter
E. faecalis
infeksjon i 24 timer (MOI50) og 5 dager (MOI10). * Angir signifikant forskjellig fra ubehandlede celler p. 0,05
DNA skade reparasjon er nedregulert i løpet av
E. faecalis
infeksjon
Den veien analyse indikerte at uttrykket av gener involvert i DNA-skade reparasjon var signifikant nedregulert i forhold til uinfiserte cellekulturer etter 24 timer på infeksjon (figur 5A). QRT-PCR bekreftet at uttrykket av flere mismatch reparasjon (MMR) gener ble nedregulert etter både 24 timer og 5 dager
E. faecalis
infeksjon (Figur 5, B). I 24 timer infiserte celler PMS1 og MSH6 var signifikant nedregulert (4 ganger og 1,8 ganger henholdsvis; P 0,001). En betydelig nedregulering av MSH2 (3 ganger), MSH3 (1,9 ganger), MSH6 (2 ganger), og PMS1 (3 ganger) (p 0,05) (Figur 5, B) ble observert i celler 5 dager etter infeksjon. De uttrykksbrette endringer av utvalgte DNA-skadereparasjonsgener etter infeksjon er vist i tabell S3. Disse resultatene tyder på at
E. faecalis
infeksjon nedregulerer store DNA-reparasjons veier fører til genomisk ustabilitet lik infeksjoner med
H. pylori product: [36], [50], [51].
Infeksjon med
E. faecalis
hemmer cellesykluskontroll og vekst av MKN74 celler
For å vurdere endringer i cellevekst indusert av
E. faecalis
infeksjon, undersøkte vi påvirkning av bakterier på ekspresjonen av cellesyklus kontrollpunkt gener og på MKN74 cellevekst. Gensettene omfattende cellesykluskontroll og sjekkpunkt gener ble nedregulert etter 24 timers infeksjon med levedyktige bakterier som tyder på en betydelig demping ned i celleproliferasjon, men også en øket risiko for mutasjoner i nye celler (figur 6 A). I kontrast, ble disse banene oppregulert i celler infisert med bakteriell lysat hvilket antyder at disse cellene var fremdeles delende etter 24 timer (figur 6 A). Vi neste målt celleproliferasjon i 5 dager og fant at levedyktige bakterier forårsaket MKN74 celleproliferasjon å bremse eller stoppe helt (Figur 6 B).
