Abstract
Bakgrunn
Tykktarmskreft (CRC) regnes som en kompleks sykdom, og dermed flertallet av genetisk mottakelighet antas å ligge i form av lav penetrans varianter etter en polygenic modell av arv. Kandidat-genet studier har så langt vært en av de grunnleggende tilnærminger tatt for å identifisere disse resistens varianter. Den konsekvente involvering av noen signalveier i kreftutvikling gitt støtte til sti-baserte studier som en naturlig strategi for å velge gener som potensielt kunne havna ny mottakelighet loci.
Metodikk /hovedfunnene
Vi har valgt to hoved~~POS=TRUNC karsinogenisitetsstudier relaterte pathways: Wnt og BMP, for å skjerme de impliserte gener for nye risiko varianter. Vi gjennomførte en case-control forening studie i 933 CRC tilfeller og 969 kontroller basert på koding og regulatoriske SNPs. Vi inkluderte også rs4444235 og rs9929218, som ikke oppfylte våre kriterier, men tilhørte to gener i BMP sti og hadde konsekvent vært knyttet til CRC i tidligere studier. Verken allel, eller genotypiske eller haplotypic Analysene viste noen tegn på sammenheng mellom de 37 skjermede varianter og CRC risiko. Justering for kjønn og alder, og stratifisert analyse mellom sporadiske og kontrollgrupper ikke ga noen positive resultater heller.
Konklusjon /Betydning
Til tross for relevansen av begge veier i patogenesen av sykdommen, og det faktum at dette er faktisk den første studien som vurderer disse banene som kandidat-gen utvalg tilnærming, ikke vår studie ikke presentere noen bevis for tilstedeværelsen av lav penetrans varianter for de utvalgte markører i noen av de vurderte gener i vår kohort .
Citation: Fernández-Rozadilla C, de Castro L, Clofent J, Brea-Fernández A, Bessa X, Abulí A, et al. (2010) enkeltnukleotidpolymorfi i Wnt og BMP Pathways og tykktarmskreft Risiko i en spansk Cohort. PLoS ONE 5 (9): e12673. doi: 10,1371 /journal.pone.0012673
Redaktør: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: Mai 20, 2010; Godkjent: 06.08.2010; Publisert: 09.09.2010
Copyright: © 2010 Fernández-Rozadilla et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Fondo de Investigacion Sanitaria /FEDER (05/2031, 08/0024, 08/1276, PS09 /02 368), Xunta de Galicia (PGIDIT07PXIB9101209PR, Ministerio de Ciencia e Innovacion (SAF 07-64873), Asociacion Espanola contra el Cancer (Fundacion Cientifica y Junta de Barcelona), og Fundacion de Investigacion Medica Mutua Madrilena. de bevilgende myndighet hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de viktigste former for kreft, som er den nest hyppigste svulst i begge kjønn og en av de viktigste sykelighet årsaker i den vestlige verden [1]. Den genetiske bidrag til CRC er estimert til å være rundt 35% av omfattende tvillingstudier [2]. Men svært penetrant varianter, som forårsaker mendelsk predisposisjon syndromer, står bare for, på det meste, 5% av sykdomstilfeller [3]. De resterende genetisk mottakelighet er tenkt å følge en polygenic modell, med et samspill av flere lav pene allele varianter dukker opp i høy frekvens i den generelle befolkningen, og hver overdragelse en beskjeden effekt på risikoen sykdom [4], [5].
Kandidat-genet studier har vært en av de mest brukte verktøyene i screening for nye varianter som påvirker CRC risiko. Gene utvalg i disse studiene er i hovedsak basert på de funksjonelle konsekvensene av en mulig sammenheng, og dermed gener utvalgte har enten blitt valgt på grunn av den tidligere tilstedeværelse av andre høy /lav risiko alleler [6], eller deres deltakelse i en sti innblandet i patogenesen av sykdommen [7]. Kandidat-genet studier kan utføres enten ved direkte tilnærminger, hvor variantene genotypede antas å være den underliggende årsaken til sykdommen på grunn av sin plassering (varianter i exonic eller regulatoriske regioner), eller ved indirekte metoder, der tag SNPs dra nytte av de koblingsulikevekt egenskapene til det menneskelige genom for å prøve og skjermen det meste av variasjonen i en gitt gen.
Denne sistnevnte tilnærmingen har også tillatt, sammen med utviklingen av high-throughput teknologier, implementering av ny hypotese -fri tilnærminger (i opposisjon med hypotesebasert kandidat-genet tilnærminger), som dekker det meste av genomet (genom-wide association studier eller GWAS). Denne implementeringen har med hell ført til identifisering av noen nye resistens loci [8] – [14], inkludert rs4444235 og rs9929218, som faller innenfor rekkevidden av to gener som hører til BMP pathway. Likevel, disse har blitt funnet å forutse bare en liten andel av sykdommen følsomhet, mens de resterende ennå ikke oppdaget [15].
Vi forsøkte derfor å finne slike resistens varianter gjennom en kandidat-gen tilnærming screening en valgt antall varianter innen to cellulære trasé som konsekvent har vært knyttet til CRC tumorogenesis: wnt og BMP signalveier [16], [17]
wnt pathway inneholder gener som har for lenge vært kjent for. være ansvarlig for noen arve CRC syndromer, for eksempel
APC Hotell og familiær adenomatøs polypose [18]. Videre er somatiske endringer i
APC
er funnet i nesten 80% av de sporadiske kolorektal kreft, og Wnt signale aktivering involvert i den beste delen av sporadisk kolorektal karsinom [19]. På den annen side, virker den BMP-reaksjonsveien som positiv regulator av noen av de wnt proteinene [17], og den tumorundertrykkende rollen til denne signalveien i patogenesen av CRC og andre kreftformer er vel etablert [20], [21]. Dessuten mutasjoner i to av sine gener,
SMAD4 Hotell og
BMPR1A
, er ansvarlig for juvenil polypose syndrom, en annen arvelig CRC tilstand [22]. Vurderer all denne informasjonen, trodde vi det ville være interessant å skjerme noen av genetiske variasjonen innenfor disse trasé for noen bevis for nye CRC relaterte varianter som kan forklare det minste en del av den manglende arvbarhet. Vår tilnærming var hovedsakelig funksjonell, for bare SNPs innenfor exonic eller
cis
regulatoriske sekvenser (5 «og 3» unstranslated regioner) ble valgt til å analysere sitt forhold til CRC mottakelighet.
Resultater og diskusjon
Etter vår vei baserte kandidat-gen valgmetoden, utførte vi vår studie i totalt 45 SNPs som var i enten exonic eller regulatoriske regioner, i en samlet av 21 gener fra både wnt og BMP veier. Detaljer om SNP funksjoner og foreningen verdier for de 37 SNPs som bestått kvalitetskontroll kriterier er vist i tabell 1. Ingen av de siktede SNPs var signifikant assosiert med en endret risiko for CRC, vurderer odds-ratio og tilhørende p-verdier for allel og genotypisk tester (trend, dominerende og recessive). Logistisk regresjon for alder og kjønn justering ble utført, selv om det ikke ble bedre p verdi resultater. Haplotype analyseresultater var konsekvent i både unphased og Haploview, og viste ingen tegn til positive assosiasjoner, enten for noen av de 8 gener som denne analysen ble utført (
AXIN1
,
HDAC9
,
BMP4
,
DACT1
,
CDH3
,
CDH1
,
BTRC
, og
APC)
, (Figur S1). Stratifisering analyse som sammenligner sporadiske og familiære tilfeller ble også gjennomført, men det gjorde ikke gi noen bevis for forskjeller i mottakelighet mellom gruppene som kan være et tegn på noen konkrete assosiasjoner innenfor hver av gruppene (tabell 2).
Dermed vår strategi har ikke klart å påvise noen ny mottakelighet loci for CRC risiko.
Pathway-baserte forventninger har vist seg å være ganske nedslående i litteraturen også, for sterk kandidat trasé, slik som DNA-reparasjons seg, overraskende mislyktes også i å identifisere eventuelle nye risiko varianter [7], [23] – [24]. I tillegg til dette har de fleste av de genetiske varianter som har blitt funnet å være assosiert med sykdom er plassert i intergeniske regioner, med potensielle funksjoner som er ennå ikke kjent.
Likevel, i lys av de siste oppdagelser som oppfølging analyse av genomdata, både Wnt og BMP har tjent en fornyet berømmelse. Den mottakelighet locus funnet på 8q24 (rs6983267) har vært knyttet til en forbedret Wnt signaliserer gjennom sin interaksjon med TCF4 [25], [26], og en meta-analyse utført på en rekke GWAS data lyktes i å knytte to varianter i
BMP4 Hotell og
CDH1
genområder med sykdommen (rs4444235 og rs9929218, henholdsvis) [8].
Selv om dette er faktisk den første foreningen studie som vurderer trasé som helhet for gen utvalg, noen av genene inkludert i vår analyse (dvs.
APC, CCND1
,
CDH1 Hotell og
TCF7
) hadde allerede blitt undersøkt for risiko alleler [ ,,,0],6], [27] – [30]. Det er ganske oppsiktsvekkende at det har vært en økende debatt om noen av disse loci, spesielt p.V1822D variant i
APC plakater (rs459552). Dette missense endringen er mye dokumentert i litteraturen, og noen studier kanten og det som nøytral (denne undersøkelsen og andre) [31], og noe overdrar sin mindre allele en beskyttende effekt [6], [28]. Mangel på passende studie makt, har resulterende fra tilstrekkelig antall prøver vært et stort problem i mange av disse studiene og dermed de fleste av dem ikke har gitt meget overbevisende resultater [32].
Selv om vår studie hadde over 80% makt til å oppdage eller så lavt som 1,21 med mindre allelfrekvensene av 0,30 (57% av våre SNPs), og 1,24 for MAFs ned til 0,2 (78% av SNPs), forutsatt en log-additiv modell og α = 0.05, vi var ute av stand til å oppdage eventuelle positive assosiasjoner som tyder på tilstedeværelsen av eventuelle nye CRC mottakelighet varianter. Likevel er det ganske bemerkelsesverdig at, om enn vår manglende evne til å gjenskape foreninger for
BMP4 Hotell og
CDH1
SNPs, er dette den første studien som undersøker noen av de såkalte 10 nye GWAS -discovered mottakelighet loci i et Sør-europeiske befolkningen.
til tross for våre negative resultater, må vi vurdere at vi ikke overhodet omfattende dekke alle mulige lav penetrans varianter innenfor de utvalgte gener. Dette er hovedsakelig på grunn av det faktum at vår strategi var rent funksjonelle, velge de variantene som var
a priori
gode kandidater til å være direkte forbundet med sykdommen. Dette kan faktisk utgjøre en begrensning i studien, for det meste av genetisk variasjon innenfor loci ble ikke undersøkt. Derfor tror vi det videre arbeidet bør gjøres for å undersøke et bredere utvalg av loci i disse banene, spesielt med tanke på tidligere positive assosiasjoner som er beskrevet så langt for både Wnt og BMP-relaterte gener.
fordyper de potensielle odds ratio av variantene er beskrevet så langt (1.11, CI 1.08-1.15 og 0.91, CI 0.89-0.94 for rs4444235 og rs9929218, henholdsvis), antar vi større kohorter kan være nødvendig for å oppdage slike subtile effekter. På den annen side, når man vurderer kandidat-gen nærmer seg, vil det også være nyttig å meta-analyse tidligere studier og trekke den informasjon på tvers av dem helt i søke av bevisene for eventuelle nye veier knyttet til patogenesen av sykdommen.
Materialer og Metoder
Studie populasjoner
fag var 933 CRC pasienter og 969 kontroller som tilhørte EPICOLON prosjekt, en prospektiv, multisenter, populasjonsbasert epidemiologi undersøkelse studere forekomsten og funksjonene i familiære og sporadisk CRC i den spanske befolkningen [33]. Tilfeller ble valgt på 11 sykehus i Spania som alle pasienter med en
de-novo
histologisk bekreftet diagnose av tykktarms adenokarsinom og som deltok 11 samfunnet sykehus over hele Spania mellom november 2006 og desember 2007. Pasienter som CRC utviklet i sammenheng med familiær adenomatøs polypose eller inflammatorisk tarmsykdom, og tilfeller der pasienter eller familie nektet å delta i studien ble ekskludert. Demografiske, kliniske og tumorrelaterte karakteristika for probands, samt en detaljert familiehistorie ble oppnådd ved anvendelse av en forhåndsetablert spørreskjema, og registrert på en enkelt database. Av disse 592 (63%) var menn og 341 (37%) kvinner. Median alder for tilfellene var 73 (range 26-95), mens mener var 71 (SD ± 10.7). Sykehus-baserte kontroller ble rekruttert sammen med saker og ble bekreftet å ha noen kreft eller tidligere historie med svulst, og ingen familiehistorie med CRC. Alle kontroller ble tilfeldig valgt og matchet med saker for kjønn og alder (± 5 år) i en 1:01 ratio. Begge sakene og kontroller var av europeisk herkomst og fra Spania.
Etikk uttalelse
Studiet ble godkjent av «Comité Ético de INVESTIGACION Clínica de Galicia», og hver av de institusjonelle gjennomgang styrene sykehusene hvor prøvene ble samlet inn ( «etikkutvalg av Hospital Clinic-Barcelona», «Etikk komité for Hospital del mar-Barcelona», «etikkutvalg av Hospital tyske Trias Pujol-Barcelona», «etikkutvalg av sykehuset Sant Pau-Barcelona «,» etikkutvalg av Hospital Universitari Arnau de Vilanova-Lleida «,» etikkutvalg av Hospital Generelt-Alicante «,» etikkutvalg av Hospital de Donosti »,« etikkutvalg av Hospital General de Asturias -Oviedo «,» etikkutvalg av Hospital klinisk-Zaragoza «,» etikkutvalg av Hospital de Calahorra-La Rioja «,» etikkutvalg av Hospital Meixoeiro-Vigo «). Alle prøver ble innhentet skriftlig informert samtykke anmeldt av den etiske styret i tilsvarende sykehus
DNA-ekstraksjon
DNA ble innhentet fra fryst perifert blod.; ekstraksjon ble utført i en CHEMAGEN robot (Chemagen Biopolymer-Technologie AG, Baesweiler, Tyskland) i henhold til produsentens anvisninger, på den galiciske Public Fundation av Genomisk medisin i Santiago de Compostela. Saker og kontroller ble hentet i blandede grupper for å unngå enhver form for skjevhet.
Kandidat-genet utvalg
Både Wnt og BMP trasé ble først valgt etter funn av Nishanian et al. [34], som demonstrerte samspillet mellom disse to banene. Begge banene ble grundig undersøkt gjennom Kreft Genome Anatomy Prosjekt stedet [35], men vi klarte ikke å finne noe informasjon om BMP sti i enten denne eller andre nettlesere. Av den grunn ble Wnt gener valgt ved å surfe på vei gjennom Biocarta [36], mens BMP gener måtte være strengt velges fra forrige litteraturen [17], [34]. Førti-en gener ble til slutt valgt å bli inkludert i analysen.
SNP utvalg og genotyping
SNP utvalgskriteriene bare ansett funksjonelle markører med mindre allelfrekvensene over 0,05 og minst to uavhengige valideringskriterier som ble etablert i dbSNP [37]. Dette inkluderte alle exonic varianter valgt med Pupasuite [38] og gen-regulatoriske regioner i
cis plakater (5’or 3 «UTR slutter), som definert av FESD nettleser [39]. 5’UTR varianter ble bare tatt med når de overholdt til de ovennevnte kriterier og ble antatt å være i den potensielle bindingssetet av en kjent transctiptional bindende faktor. 3 «UTR varianter ble inkludert på grunn av sitt potensial forhold til miRNA bindende regioner [40]. Fordi noen av de utvalgte gener hadde ingen SNPs på slike slike i noen av de tre nettleserne på tidspunktet for SNP utvalg, de til slutt måtte bli droppet ut av studiet. Til slutt ble 43 SNPs valgt innen 21 gener som skal skjermes som potensielle direkte modifikatorer av CRC mottakelighet (tabell 3).
rs4444235 og rs9929218 er to varianter som ligger i nær-by og intronic regioner av
BMP4
og
CDH1
, henholdsvis, som nylig er blitt rapportert å være assosiert med sykdommen [8]. Tatt i betraktning at de SNPs at vi hadde valgt innenfor disse to genene ikke var gode taggere for disse to variantene (R-squared verdier var 0,6 for SNPs i
BMP4
, og 0,02 for de som er i
CHD1
) (figur 1), bestemte vi oss for å inkludere dem i vår studie også, selv om de ikke oppfyller våre kriterier, slik at det totale antallet avhørt SNPs stige til 45.
R-squared relasjoner mellom SNP parene. A. rs4444235-rs17563 i
BMP4 Hotell og B. rs9929218-rs1801552 i
CDH1
Genotyping ble utført med MassARRAY (Sequenom Inc., San Diego, USA) teknologi i Santiago de Compostela node i den spanske Genotyping Center. Calling av genotyper ble gjort med Sequenom Typer v4.0 programvare ved hjelp av alle data fra studien samtidig.
Statistiske analyser
Kvalitetskontroll ble utført, først ved å utelukke både SNPs og prøver med genotype suksess priser under 95%, med hjelp av Genotyping data Filter (GDF) [41]. Genotypiske distribusjoner for alle SNPs i kontrollene var i samsvar med Hardy-Weinberg likevekt som vurderes ved hjelp av en X
2 test (1
df). Alle p-verdiene som ble oppnådd var ≥0.05, for derved å utelukke muligheten for genotyping artefakter (data ikke vist). Befolknings stratifisering ble vurdert med struktur v2.2 [42]. I korte trekk ble posibility av ulike scenarier testet anta et ulikt antall underliggende populasjoner (k området fra 1 til 4), slik at for et stort antall iterasjoner (25 K i innkjøringsperioden, etterfulgt av 500 K repetisjoner). Den logaritmiske sannsynlighet ble beregnet for dataene for en gitt k (betegnet som L (K)) i hvert forsøk. Vi har også utført flere kjøringer for hver verdi av k beregne den totale midlere L (K) og dens standardavvik. Alle resultater så ut til å være overensstemmende med den opprinnelige antagelse av en enkelt eksisterende populasjon. Dessuten ble ytterligere fremgangsmåter for bedre forvirrende variable visualisering foretatt ved hjelp av en Principal Component Analysis (PCA) ved hjelp av EIGENSOFT verktøyet
smartpca product: [43], selv om antallet markører var meget lav. Ingen forskjeller ble funnet av befolkningen lagdeling mellom saker og kontroller for enten struktur eller de første 10 komponentene i PCA analyse (Figur S2). Etter kvalitetskontroll 1746 prøver (854 tilfeller og 892 kontroller) og 37 SNPs forble for videre analyser.
Foreningen Testene ble utført av chi-squared tester for hvert enkelt SNP og haplotyper der det er mulig med både Haploview v4.0 [ ,,,0],44] og unphased [45]. Kort sagt, LD mønstre på tvers av gener som mer enn en SNP ble genotypet ble sjekket inn Haploview og testet for foreningen å bruke unphased (for å sjekke i noen av haplotyper ble forbundet) og Haploview (for å se hvilke av haplotyper ble forbundet). Genotypiske foreningen tester, logistisk regresjonsanalyse for kjønn og alder justering, og stratifisert analyse mellom sporadiske og familiære grupper ble beregnet med plink v1.03 [46]. ELLER og 95% konfidensintervall ble beregnet for hver statistikk, og for å ta opp spørsmålet om multiple-testing, permutasjon tester og Bonferronikorreksjon ble brukt. Studier makt ble beregnet med CATS-programvare [47].
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
haplotype struktur og analyse for de 8 gener som mer enn en SNP ble genotypet. Tabellen viser foreningens verdier for hver SNP generert av Haploview
doi:. 10,1371 /journal.pone.0012673.s001 plakater (3,40 MB TIF)
Figur S2.
Prinsipal komponent analyse tomt for første vs. andre komponenten, sammenligne vårt tilfelle og kontrollpopulasjoner
doi:. 10,1371 /journal.pone.0012673.s002 plakater (0,96 MB TIF)
Merk S1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0012673.s003 plakater (0,03 MB DOC)
Takk
Vi er oppriktig takknemlig til alle pasienter som deltok i denne studien som ble rekruttert i 11 spanske sykehus som en del av EPICOLON prosjektet. Vi takker Maria Magdalena-Castro (MMC), Olga Lortes (OL) og Eva Fernández (EF) for deres utmerkede teknisk assistanse.
