Abstract
Nevroblastom er den vanligste ekstra kranie solid kreft i barndommen. Til tross for opptrapping av behandlingsregimer, et betydelig mindretall av pasientene dør av sykdommen. Disialoganglioside (GD2) er gjennomgående uttrykt ved høye nivåer i neuroblastom tumorer, som har blitt målrettet med en viss suksess ved bruk av terapeutiske monoklonale antistoffer. GD2 uttrykkes også i en rekke andre kreft, men med unntak av noen perifere nerver er stort sett fraværende fra ikke-transformerte vev. Kimære antigen-reseptorer (biler) er kunstige type I-proteiner som pode spesifisiteten av det monoklonale antistoff på en T-celle. Kliniske data med tidlig CAR design rettet mot GD2 har vist noen lover i neuroblastom. Her beskriver vi en GD2 målretting CAR retroviral kassett, som er optimalisert for CAR T-celle utholdenhet, effekt og sikkerhet
Citation. Thomas S, Straathof K, Himoudi N, Anderson J, Pule M ( 2016) En optimalisert GD2 målretting Retroviral kassett for mer potent og tryggere Cellular Therapy av Nevroblastom og andre kreftformer. PLoS ONE 11 (3): e0152196. doi: 10,1371 /journal.pone.0152196
Redaktør: Sophia N. Karagianniss, Kings College London, Storbritannia
mottatt: 27 januar 2016; Godkjent: 10 mars 2016; Publisert: 31 mars 2016
Copyright: © 2016 Thomas et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. studien ble finansiert av neuroblastom Society nå re-merket «nevroblastom UK». Denne lille veldedighet gitt et tilskudd på £ 133 000 i 2005 til et prosjekt med tittelen «Genetic Engineering av T-celler for adoptiv immunterapi av Nevroblastom». Martin Pule er støttet av den britiske NIHR Biomedical Research Centre og Wellcome Trust. John Anderson er støttet av Great Ormond Street Hospital, Biomedical Research Centre og Great Ormond Street Hospital Barnas Charity. Karin Straathof støttes av Great Ormond Street Hospital, Biomedical Research Centre og Wellcome Trust. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. MP har fått kontrakt forskningsmidler fra Cellectis. Han eier aksjer og mottar lønn bidrag fra Autolus Ltd. Han er oppfinner på patenter som er registrert av UCLB og har mottatt og kan motta royalty derfra. Han har mottatt honorarer fra Roche og Amgen for å snakke. JA og ST eier lager fra Autolos Ltd. De er oppfinnere på patenter som er registrert av UCLB og kan motta royalty derfra. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Nevroblastom står for omtrent 15% av kreftdødsfall hos barn [1]. Til tross for markert intensivering av terapi, mindre enn 40% av høyrisikopasienter er langtidsoverlevende, med kjemoterapi og strålebehandling motstand og sene tilbakefall være kjennetegnet av behandlingssvikt [2]. Disialoganglioside (GD2), en overflate glykolipid antigen som er allestedsnærværende og rik på neuroblastom-celler, så vel som å ha cancer-spesifikk ekspresjon i en rekke voksne og pediatriske maligniteter [3], er et ideelt mål for immunterapi [4]. Faktisk, anti-GD2 monoklonale antistoffer utprøves en del av standard behandling for høy risiko neuroblastom, og deres effekt og toksisitetsprofilen er veletablert [3,5].
Administrasjon av tumorspesifikke T-celler (adoptiv immunterapi) har vist seg å være en effektiv behandling for kreft Epstein Barr-virus-drevet lymfomer [6] og melanom [7] med responser i voluminøse resistent sykdom. Det har imidlertid ikke vært mulig å generere neuroblastom spesifikke T-celler ved hjelp av tradisjonelle fremgangsmåter for valg og ekspansjon. Kimære antigen-reseptorer (biler) kan konstrueres ved å forbinde enkeltkjede variabel region (scFv) fra et monoklonalt antistoff mot intracellulære signal domener. GD2-målretting CAR derfor gi oss en alternativ fremgangsmåte for generering av neuroblastom-spesifikk T-celler ved hjelp av genteknologi. GD2 CAR terapi kan føre til bedre respons enn mAb behandlingen på grunn av en vedvarer og dynamisk avvisning av GD2-uttrykke svulst.
En fase I klinisk studie av anti-GD2 CAR transduced T-celler i tilbakefall høyrisiko neuroblastom pasienter rapportert noen effekt [8]. En mulig begrensning av denne studien var bruken av en første generasjon CAR, og gir bare CD3ζ ITAM-signaler, noe som kan ha resultert i dårlig utholdenhet og ekspansjon. En økende mengde kliniske data for CD19 CAR i B-celle-maligniteter, så vel som en dobbel-merking studie [9] viser at biler forutsatt ytterligere kostimulerende signaler som resulterer i forbedret varighet og effekt. Her beskriver vi vår innsats for å konstruere en mer potent men trygt GD2 målretting kassett for bruk mot neuroblastom, som benytter en tidligere beskrevet tredje generasjon endodomain [10]. Fokus for dette arbeidet er optimalisering av gjenværende CAR arkitektur og uttrykk kassett for maksimal effekt og sikkerhet.
CAR undersøkt i studien rapportert av Pule et al brukte en scFv avledet fra 14-18, en mAb som i en kimære form er for tiden i vanlig klinisk bruk. Vi har derfor brukt en målretting domene fra en annen anti-GD2 mAb familien å unngå anti-idiotype avvisning /aktivering av CAR T-celler. For å redusere sjansen for avvisning, ble en humanisert versjon av bilen testet, og iterativ optimalisering av CAR arkitektur ble utført. Anti-GD2 mAb terapi er assosiert med perifer neurotoksisitet. Mens den første GD2 CAR studien ikke rapportere dette [8], henger den bekymring som stadig mer potente biler er innført i klinikken. I påvente av denne eventualitet, vi co-uttrykt CAR med iCasp9 selvmord genet [11] og optimalisert en bi-cistronisk retroviral kassett for å opprettholde co-uttrykk og konsekvent transgen utgang. Den endelige konstruksjonen ble testet in vivo. Vi har generert en GD2 CAR rettet mot retroviral kassett optimalisert for effekt og sikkerhet.
Resultater
CAR med humanisert scFv gir lignende uttrykk og økt cytokine release og T-celle ekspansjon
KM8138 er et fullstendig humanisert anti-GD2-monoklonalt antistoff konstruert ved poding av epitope bindende komplementaritetsbestemmende regioner (CDR) av det murine anti-GD2-antistoff KM666 på kompatible human V
H og V
L rammeverkregioner [12]. Den resulterende humane scFv-sekvensen er forskjellig fra den murine i 31 stene i rammeområdene utenfor CDR. Murint antistoff 14,18-avledet scFv anvendt i tidligere beskrevne GD2 Biler kan være et mål for immunavstøtning enten på grunn av anti-idiotype (siden terapeutiske mAb’er i dagens kliniske anvendelse er avledet fra den samme klon), eller fra anti-mus-antistoffer. Vi utledes derfor en CAR basert på det humaniserte KM8138 antistoff [12]. For å bestemme eventuelle konsekvenser av å bruke en humanisert scFv, også generert en bil stammer fra foreldre mus antistoff dermed genererte vi et par av anti-GD2 CAR identiske med unntak av deres scFvs, som ble hentet fra en murine anti-GD2 mAb KM666, eller sin humanisert motstykke KM8138 [12]. Bilene hadde humant IgG1 hengsel-Fc avstandsstykker, CD28 transmembrane domenet og CD28-OX40-Zeta endodomain (fig 1A). Utgangspunktet vi søkt å sammenligne uttrykk og funksjon av dette humanisert CAR (HuK666) med sin muse motpart (MuK666). Normal donor humane T-celler ble transdusert med like titere på retrovirale vektor koder for hver reseptor. Overflateekspresjon av hver bil bestemt ved flow-cytometri med et polyklonalt anti-Fc var identisk (figur 1B). Mean fluorescens intensitet (MFI) av omsatte T-celler var ikke forskjellig mellom humanisert og murine biler. Transduserte T-celler var i en 4-timers kromfrigjøringsanalyse CD56-utarmet T-celler som uttrykker enten CAR viste sammenlignbar dreping av den GD2-bærende Lan-1 neuroblastom-cellelinje og en tilsvarende mangel på aktivitet mot A204 osteosarcom cellelinjen som mangler ekspresjon av GD2. Hverken ikke-omsatte T-celler (NT) eller T-celler transdusert med et irrelevant CAR rettet mot CD19 vises noen cytotoksisitet til enten cellelinje (figur 1C) Begge reseptorer var i stand til å stimulere proliferasjonen av transduserte T-celler som brønner som utskillelsen av IL2 og IFN-g som reaksjon på LAN1 men ikke A204 (fig 1 D). Det var ingen signifikant forskjell mellom huK666 og muK666 biler for spredning (figur 1D), interferon γ frigjøring (Fig 1E), eller interleukin 2 (IL-2) frigjøring (Fig 1F) selv om det var en ikke-signifikant trend for alle tre mot forbedret funksjonen til huK666 CAR.
(a) Sammenligning av aminosyresekvensene i huK666 og muK666 scFv er sammenlignet. Komplementaritetsbestemmende regionene er vist i rødt. Linkersekvensen er vist i grønt. På høyre, arkitekturer av bilene generert for innledende sammenligning av huK666 med muK666. Begge skiller seg bare i scFvs brukt blir enten de opprinnelige murine muK666 sekvenser, eller humanisert (CDR podet) huK666. Ellers bilene består av et humant IgG1 hengsel-CH2-CH3 spacer, en TM domene avledet fra CD28 og en forbindelse endodomain bestående av fusjoner mellom endodomains fra CD28, OX40 og CD3-Zeta. (B) Stabilitet av muK666 vs huK666 biler. T-celler fra 5 donorer ble omformet med like titer av retroviral supernatant koding for muK666 eller huK666 biler. CAR ekspresjon ble påvist ved hjelp av anti-human-Fc-polyklonale antistoffer. MFI var identisk i begge konstruksjoner. Et representativt eksempel er vist med NT (grønn), histogrammer muK666 (blå) og huK666 (rød) kledde. Disse CAR T-celler ble utfordret med LAN-en (en Nevroblastom cellelinje som uttrykker GD2) og A204 (en rabdomyosakrom cellelinje som er GD2 negativ). Cytotoksisitet er vist i (c), proliferasjon på dag 7 er vist i (d), IFN-γ i (e) og IL-2-frigjøring i (f). Viste data som betyr +/- SEM fra 6 uavhengige eksperimenter med ulike givere.
Spacer bestående av IgG1 Fc domene resulterer i optimal drap og cytokine release
CAR-funksjonen kan bli påvirket av spacer domene utvalg [13-15]. I tillegg til den huK666 baserte CAR beskrevet ovenfor inneholdende det humane lgG1 hengsel-CH2-CH3-domene som spacer, genereres det ytterligere huK666 CAR varianter hvor avstandsstykket regionen ble består av hengselet alene, hengslet festet til stilken CD8a eller den CD8a stengel alene (fig 2A). Valg av disse avstandsstykker var basert på størrelse vederlag med IgG1 hengsel stående være en kort mellomrom, CD8 stengel middels og IgG1 Fc være en lang spacer. Vi har postulert også at CD8 stilken ikke kan tillate tilstrekkelig artikulering av scFv og dermed vi genereres en ytterligere variant med lgG1 hengsel koblet til CD8 stilken. For å tillate enkel deteksjon av CAR, merket vi huK666 med en amino-terminal HA-tag, inn mellom signal-peptid og VH. Videre, for å kontrollere for variasjon i vektoruttrykk, klonet vi munn- og klovsyke 2A sekvens Tav (2ATaV) i ramme med den karboksy-terminale enden av bilen, noe som i sin tur ble klonet i ramme til avkortet CD34 (dCD34ngg). Vi kunne derfor oppdage CAR uttrykk i forhold til vektor uttrykk ved farging for HA og anti-CD34.
Flere huK666 biler ble klonet inn i en identisk format der scFv ble merket med et HA-tag, og bilen var co -expressed med en avkortet FMD-2A sekvens med avkortet CD34. Ekspresjonskassetten er vist i (a) og tegninger av disse formatene er vist i (b). Co-uttrykk for CAR (HA) og CD34 markørgenet fra de ulike kassetter. De fire heng regionene ble sammenlignet med hensyn til cytotoksisitet (c) (LAN1 = GD2 positiv target og A204 = GD2 negativ mål), IFN-γ sekresjon (d), IL-2 (e) og mål-spesifikk proliferasjon (f). Viste data som betyr +/- SEM fra 4 uavhengige forsøk med ulike givere.
Primær humane T-celler ble transduced med lik titer supernatant fra disse konstruerer og farget med anti-HA og anti-CD34. Et representativt flow-cytometrisk analyse av denne farging er vist i figur 2B. Hengsel-CH2-CH3, hengslene-Stalk og Stalk avstands CAR uttrykk var identiske, mens hengslene stående spacer CAR medførte redusert HA farging (figur 2B). Dette kan være på grunn av redusert stabilitet, eller til redusert tilgang til HA-tag i dette formatet. Funksjonelle eksperimenter ble utført neste, og det var klare forskjeller i evner av avstands varianter å megle cytotoksisitet, cytokine release og spredning som svar på Lan-1 celler. PBMC transdusert med en hvilken som helst av de avstandsvariant CAR vist cytotoksisitet mot Lan-1-celler; men det var signifikante forskjeller mellom effekt avhengig spacer. CAR uttrykker CH2-CH3 avstands var signifikant mer effektive enn hengsel /stilken (P = 0,009) og hengslene (p = 0,0003), selv om tendensen til å drepe forbedret sammenlignet med stilken var ikke-signifikant. Ingen av avstands variant CAR-mediert noen drap på GD2 negative A204 celler (figur 2C). Forskjeller ble også observert i evnen av de andre avstands variantene for å stimulere produksjonen av IFN-γ eller IL-2 etter kultur med LAN1 celler. CH2CH3 spacer gående indusert både av cytokiner, og var betydelig bedre enn hengsel for IFN-γ produksjon (p 0,003, figur 2D), og vesentlig bedre enn hengsel /stilken (p 0,03) og hengslene (p 0,006) for IL -2 produksjon (fig 2E). Med unntak av hengselet varianten alle reseptorer virket sammenlignbare når det gjelder deres evne til å stimulere celleproliferasjon som respons på GD2-bærende LAN1 til tross for stor variasjon mellom givere (figur 2f). T-celler som uttrykker hengsel variant viste liten påvisbar spredning, noe som er konsistent med redusert evne til denne reseptoren for å mediere IL-2-frigjøring. Samlet IgG Fc regionen syntes å være den optimale spacer for GD2 CAR og vi brukte denne reseptoren formatet i senere optimaliseringer.
Forbedret CAR funksjon gjennom endring av Spacer
En normal funksjon av CH2 -CH3 region av Fc-regionen av immunglobuliner er bindingen av Fc-reseptorer for immuneffektorceller. Den humant lgG1 CH2-CH3-spacer som brukes i GD2 CAR er den naturlige ligand for høy affinitet FcγRI (CD64) som uttrykkes på medfødte effektorer som makrofager og monocytter. Derfor er det en teoretisk risiko for engasjement av CAR uttrykke T-celler med myeloide celler ved binding av CD64 resulterer i både utenfor mål toksisitet av myeloide celler, og avledning av bilen T-celler fra sin tiltenkte effektor funksjon. Faktisk er dette fenomenet av biler som inneholder IgG1 CH2-CH3-avstandsstykker er tidligere blitt rapportert [16,17]. De kritiske aminosyrer for IgG1 anerkjennelse bor i CH2 domene (PELLGG og ISR motivene [18]), og Hombach et al har vist at erstatning av disse viktige aminosyrer med de tilsvarende aminosyrer fra IgG2 innenfor rammen av CAR design, har ingen hemmende effekt in vitro av en CD30 rettet mot CAR, men hindrer utenfor mål lyse av CD64-uttrykke THP1 celler [16]. Derfor mutert vi PELLGG og ISR rester som per tilnærming av Hombach et al (fig 3A) og viste tilsvarende uttrykk i T-celler av CAR bærer muterte (forkortet til PVAA) CAR (Fig 3B). Den PVAA-muterte CAR beholdt antigen spesifikk effektorfunksjon mot SupT1 celler konstruert for å uttrykke GD2 på sterke nivåer (Fig 3C). Mens PVAA holdige CAR lysert GD2-uttrykke LAN1 celler med tilsvarende effekt i forhold til villtype, hadde PVAA CAR betydelig redusert utenfor mål cytolysis mot CD64 uttrykker THP1 celler (p = 0,0005 Figur 3D). Tilsvarende mens co-kulturen i WT-CAR T-celler med THP1 celler resulterte i gjennomsnittlig påvises IL1β i supernatanten av 886pg /ml, dette ble redusert til verdier som ikke var over bakgrunnen med PVAA inneholder CAR (Fig 3E). Derfor inkorporering av en mutasjon for å forhindre binding av høy affinitet FcγR unngår for høyt giftighet av den GD2-CAR.
(a) aminosyresekvens av villtype (øverst) og mutert (PVAA) CH2 regioner ansvarlig for FcγR bindende. (B) strømnings farging med anti-Fc-antistoff for å vise tilsvarende nivå av ekspresjon av reseptoren med eller uten PVAA mutasjonen. Identiske biler med og uten PVAA ble sammenlignet side om side i form av cytotoksisitet mot GD2 konstruert SupT1 og GD2 negativ villtype SipT1-celler (c), cytotoksisitet mot GD2 positiv LAN1 celler og FcRγ positive THP-1-celler (d), og IL- 1β frigivelse av kultur med THP-1-celler (e). Viste data som betyr +/- SEM fra 4 uavhengige forsøk med ulike givere.
Optimalisering av co-uttrykk med selvmord genet
Selv gir et kraftig potensiell behandling for kreft, bil- T-celler har kapasitet til å megle potensielt fatale bivirkninger. GD2 målretting kan føre til on-target off-tumor toksisitet forårsaket av sentrale og perifere nervesystem GD2 uttrykk. En måte å slette enkelte CAR T-celler i møte med uakseptabel toksisitet er ønskelig. For å oppnå dette, vi co-uttrykte induserbar Caspase 9 (iCasp9) selvmord genet [11]. Co-uttrykk for CAR og iCasp9 brukte selv spalte FMD-2A som sekvens TAV
13. Dette resulterer i obligat 1: 1 co-uttrykk for CAR med selvmord genet. Siden retrovirale uttrykk resulterer i en normal fordeling av uttrykk intensitet, er en vurdering rømning av lavt nivå iCasp9 uttrykke car T-celler. I tillegg kan et høyt nivå av iCasp9 være basalt giftig. Celler som uttrykker lavt nivå iCasp9 kan overleve selvmord genet aktivering, så vi søkt å oppnå homogen lyse uttrykk for CAR og iCasp9, til tross for den ekstra transkripsjonen byrde at 1,5 kb iCasp legger til vektor, og for å vise at iCasp9 var ikke basalt giftig ved oppnådd uttrykk nivåer. Vi modifiserte vektoren og åpne leserammer som følger: Vector 3’LTR U3 ble modifisert til å omfatte den kylling β-globin kromatin isolator [19]. Stillaset feste regionen fra det humane interferon-β-genet ble innsatt i 3’UTR [20] (figur 4A). Vi har også generert konstrukter med begge modifikasjoner sammen men titere var for lav til å være brukbar, og ble ikke undersøkt videre (data ikke vist). Dessuten ble hele den åpne leseramme kodonoptimaliserte. Til slutt, for å sikre at iCasp9 ikke resulterte i basal toksisitet ved høy-ekspresjonsnivåer vi genereres en ikke-funksjonell mutant med det aktive sete cystein mutert til serin (figur 4A). PBMC ble transdusert med like titere av retrovirale supernatant for hver reseptor, og ekspresjon ble målt 72 timer etter transduksjon ved strømningscytometri. Den midlere fluorescensintensitet av hver variant fusjonert til den ikke-fungerende iCasp9 er litt større enn det tilsvarende ikke-optimalisert-reseptor bundet til en funksjonell iCasp9, noe som tyder sterkt uttrykkende celler kan gå tapt som følge av uønsket, ikke-spesifikk aktivering av iCasp9 (Fig 4B og 4C)
(a) Ni forskjellige uttrykk kassetter ble sammenlignet. Tre forskjellige retrovirale vektorer ble generert-villtype SFG, SFG med stillas-vedlegg region (SAR) settes inn i 3’UTR og SFG med CHS4 innsatt i 3’LTR U3 regionen. (Retrovirale vektorer med både SAR og CHS4 ble generert men produsert svært lav vektor titere og ble ikke sammenlignes videre); Inn i disse retrovirale vektorer villtype iCasp9-2A-huK666 CAR konstruksjoner ble satt inn og iCasp9 ble satt inn i 3 former; kodonoptimalisert, vill-type, og med det katalytiske domene mutert. (B) Histogrammes på dag 3 etter transduksjon (blå linje). Kledde T-celler dyrket i 20nm CID er vist i rødt. Bargraphs av MFI celler i fravær av CID på dag 3 (c) og (d) dag 7. Viste data som betyr +/- SEM fra 5 uavhengige eksperimenter med ulike givere.
For å evaluere effekten av vektor modifikasjoner i løpet av flere lengre perioder, transduserte PBMC ble deretter dyrket i totalt 7 dager. Over varigheten av denne kulturen perioden vi bemerket differensial reduksjon i nivåene av uttrykk mellom 3 grupper: den umodifiserte (ingen SAR /CHS) og CHS-reseptorer viste en betydelig nedgang i MFI opp alt 22,4 til 49,5% sammenlignet med dag 3 MFI (fig 4D sammenlignet med figur 4C). Denne reduksjonen i ekspresjon var ventet, og skyldes sannsynligvis respons av MoMLV LTR til T-celleaktivering tilstand. Etter lengre tids 7 dagers kultur MFI av vektorer som inneholder SAR var betydelig høyere enn umodified. Denne reduksjonen i ekspresjon ble betydelig mindre markert for SAR-holdige reseptorer (p 0,02 for ikke kodon optimalisert, se figur 4D) som tyder på at det SAR fungerer for å hindre at nedregulering av de GD2 biler. Fenomenet lavere MFI på dag 7 sammenlignet med Dag tre er observert like i vektorer som inneholder eller ikke inneholder C til S mutasjon som tyder på at ikke-spesifikk aktivering av selvmord genet er ikke ansvarlig for den lyddemping.
Etter inkubasjon med CID nivåene av CAR uttrykk for levende PBMC ble vurdert ved flowcytometri (fig 4B). Som forventet C-til-S mutante reseptorer var refraktære til CID behandling. Verken kodon-optimalisering eller inkludering av SAR sekvens påvirket CID respons, men CHS4 sekvensen syntes å føre til større grad av omsatte T-celler rømmer CID behandling (figur 4B). Flukten fra selvmord genaktivering syntes å være observert hovedsakelig de lave CAR-expressers og dette var i samsvar med den lavere samlet uttrykk observert for CHS4 reseptorer. Mens et svært lite antall av rest CAR-uttrykke T-celler kunne påvises i de umodifiserte og SAR grupper etter CID behandling, er det uklart om cellene beholder tilstrekkelig CAR uttrykk for å vise aktivitet.
Derfor, i form av uttrykk , stabilitet og respons på CID, kodon-optimalisert SAR-holdige reseptoren (iCasp-HUK) utførte den beste og denne reseptoren ble sammenlignet med den opprinnelige HuK666 CAR for sin evne til å formidle cytotoksisitet og cytokine release i respons til LAN1 celler (fig 5 ). Transduserte PBMC ble inkubert i 72 timer i fravær eller nærvær av 10 nm CID og deretter ko-dyrket med Lan-1 eller A204 celler. Et eksempel på ekspresjonen av disse bilene i nærvær og fravær av CID er vist i fig 5A. Nivåer av HuK666-iCasp9 uttrykk ble effektivt eliminert ved induksjon av iCasp9 (Fig 5A).
SAR kodonoptimalisert kassett ble tatt videre og sammenlignet med den opprinnelige kassett uten iCasp9. (A) Uttrykk for bilen var uendret. Tømming er vist ved FACS etter tilsetning av CID. Funksjonen av kassetter med og uten iCasp9 ble vurdert ved (b) Killing (c) IFN-γ frigivelse og (d) IL-2-frigjøring. Viste data som betyr +/- SEM fra 4 uavhengige forsøk med ulike givere.
HuK666-omsatte PBMC vises sammenlignbare nivåer av cytotoksisitet og cytokine release i respons til LAN1 cellene uavhengig av tidligere kultur med KID. I fravær av CID den HuK666-iCasp9 konstruere utført samt reseptoren mangler selvmord genet. Men en 72-timers forbehandling med CID avskaffet utgivelsen av cytokiner ved (Fig 5C og 5D) og cytotoksisitet av (Fig 5B) T-celler som uttrykker Huk-iCasp9.
In vivo
funksjon av iCasp9-CAR kassett
for å bekrefte at effekten og spesifisiteten av co-uttrykt optimalisert CAR og selvmord genet observert in vitro var sannsynlig å likestille til klinisk effekt vi evaluert iCasp9-CAR kassett i en immunkompetente musemodell. Den GD2 antigen er et gangliosid identisk kjemisk struktur mellom arter slik at ScFv huK666 ScFv binder GD2 likt i mus og humane celler. Vi har gjort bruk av den svakt immunogene CT26 koloncancercellelinje, som stadig danner tumorer subkutant i Balb /c-mus. CT26 celler ble transduced med en gammaretrovirus koding GD2 og GD3 synthases, og en klone (nummer 7) med lyse GD2 uttrykk ble valgt for analyse av GD2 målretting av GD2-CAR i en immunkompetente modell (S1 fig). CT26-klone 7 celler indusert spesifikk frigjøring av IL-2 og IFN-γ følgende co-kultur med splenocytes transduced med GD2-CAR (S2 fig). In vivo ble CT26-gd2 klone 7-deriverte svulster effektivt eliminert med bil omformet splenocytter i motsetning til gd2 negative CT26 celler som vokste i samme takt som svulster hos mus behandlet med untransduced splenocytes (fig 6).
Balb-C mus ble innocultaed med 1×10
6 CT26 eller CT26-GD2 celle blandet i matrigel. 10 dager etter tumor-inokulering, ble musene under letalt bestrålte (200 rad), og to uker etter tumorinjeksjon ble musene intravenøst transplantert med et totalt 1.5×10
6 transduserte splenocytter eller ikke transduserte kontroller etter haleveneinjeksjon. Vill type CT26 ble brukt som antigen negative kontroller (a, c), mens CT26 -GD2 svulster behandlet med untransduced T-celler (b) ikke regress mens CT26-gd2 svulster utfordret med CAR T-celler tilbakedannede. Hver linje representerer en mus.
Diskusjoner
Høy risiko Nevroblastom representerer et uløst klinisk problem. Neuroblastom svulster uttrykke diasialoganglioside GD2 overflod og overalt. GD2 er en av få solid-tumorantigener med relativt lite uttrykk på andre vev, spesielt GD2 lavt nivå uttrykk i perifere nerver, noe som gjør GD2 et attraktivt mål for CAR terapi. En tidlig GD2 CAR T-celle studie ble utført som sammenlignet EBV-CTL og perifert blod T-celler transduced med biler i samme pasient. Svarene var forbigående og bare lavt nivå utholdenhet av CAR T-celler ble observert [8].
En mulig begrensning av den studien var bruk av en første generasjon [21] reseptoren, som bare sender immunologiske signal en på ligering. Andre generasjon biler har blitt beskrevet, som også overføre kostimulerende signaler [22]. En dobbel merking sammenligning av første og andre generasjons CAR antyder overlegenhet av sistnevnte forbindelse [9]. Faktisk en økende mengde av kliniske data med andre generasjon CAR rettet mot CD19 CAR T-celleterapi i B-celle maligniteter har bekreftet overlegenhet av andregenerasjons CAR [23,24]. Her inngår vi en endodomain som overfører to samtidig stimulerende signaler, en hver fra Ig super coreceptor familie (CD28) og TNF-familien coreceptor familie (OX40).
Økt klinisk erfaring har vist at biler som omfatter bindingsdomener avledet fra murine antistoffer kan fremkalle alvorlige reaksjoner hos pasienter, som kan bidra til økt clearance av omsatte T-celler og CAR aktivering med betydelig toksisitet [25,26]. Dette eventualitet er mer presserende i Nevroblastom: siden anti-GD2 mAb terapi er nå standard-of-care, vil mange pasienter har vært utsatt for det kimære 14-18 mAb. Spesielt disse terapeutiske antistoffer er avledet fra den samme klon som CAR brukes av Pule et al. CAR-inneholdende 14,18-baserte scFv er blitt demonstrert nylig å føre til tonic signalering tilstrekkelig til å hemme funksjonen [27]. Derfor prøvde vi å ta opp muligheten for både pre-formet og CAR-indusert anti-idiotype og anti-mus rammeverk respons. Vi har derfor brukt en annen bindemiddel-familien, som ble humanisert.
funksjonen av reseptoren, og valget av den korrekte avstandsholderen kan være viktig for klinisk effekt [13,14,21,28]. Guest et al har undersøkt hvordan rekkefølgen av avstandsholderen og CAR funksjon synes å forholde seg til avstanden til reseptorbindingssetet på mål-antigenet fra mål-cellemembranen [13]. Forfatterne merket seg at i tilfelle av NCAM og 5T4, antigener hvori CAR-epitopen er lokalisert tilstøtende til membranen, deres beslektede CAR kreves nærvær av en Fc avstandsstykke for optimal funksjon. Fjernelse av denne avstandsholderen resulterte i reduksjon i cytotoksisitet og IFN-γ sekresjon fra transduserte T-cellene i respons på antigen-uttrykkende tumorceller. Det motsatte dukket sant i tilfelle av CD19 og CEA, begge antigener hvori CAR-bindingssetet er lengre borte fra membranen. CAR rettet mot disse to sistnevnte antigener som vises redusert IFN-γ respons hvis de inneholdt Fc spacer, selv om cytotoksisitet var upåvirket. Hudeček et al i ROR-1 og CD19-modeller har antydet at optimal lengde og fleksibilitet av spacer er også avhengig av plasseringen av en mål-epitop i forhold til celleoverflaten [14,28].
Vi observerte at endring av avstandsholderen i vårt GD2 CAR resulterte i endringer i cellepotensialet og cytokin sekresjon av transduserte PBMC. Samlet Fc spacer gitt optimal respons mens begge reseptor variantene inneholder CD8 stilken dukket sub-optimal i forhold til cytotoksisitet og IL-2-utgaven, selv om stilken-variant-omsatte PBMC ble konsekvent observert å utsondre høyere nivåer av IFN-γ på stimulering enn PBMC transdusert med Fc-variant. Manglende samsvar mellom cytotoksisitet, spredning og cytokinutskillelse for visse reseptor konstruksjoner har blitt nevnt tidligere [13] [29,30]. Transduksjon nivåer var konsistent lik for alle avstands varianter, og dette synes ikke å ta hensyn til observerte forskjeller i funksjon, unntatt i tilfellet med hengselet variant, som ble svakt uttrykt på celleoverflaten av transduserte celler, og viste liten eller ingen reaktivitet mot tumor celler i en hvilken som helst av de målte parametre. Dette kan være på grunn av begrenset tilgang for påvisning av anti-HA-antistoff til HA koden på hengsel reseptoren eller til en redusert stabilitet på celleoverflaten, selv om denne reseptoren konfigurasjon har blitt observert å være funksjonell i andre systemer [13,21]. Innlemming hengselsregionen inn i stilken varianten først negativt å påvirke reseptor-funksjon og forbedres cytokin sekresjon i forhold til stilken alene. Det er blitt hevdet at nøkkelen funksjon i avstands regionen for å bestemme funksjon er fleksibilitet, slik at bindende domene for å få tilgang målet antigen. En mulighet er at inkludering av hengslet segment kan redusere reseptor fleksibilitet og at dette kan overvinne noen fordel avledet fra en svak økning i reseptoren lengde.
Til slutt, har vi valgt Fc-avstands variant som å være optimale i våre hender og tok dette frem for videre undersøkelser. Men ett problem som har blitt bemerket med biler som inneholder IgG Fc er bindingen av denne regionen for å Fcy reseptorer (FcγR) på celler i det medfødte immunsystemet som resulterer i upassende off-target aktivering av de omsatte T-celler [16,17].
