Abstract
Esophageal plateepitelkarsinom (ESCC) står for ca 90% av spiserørskreft diagnostisert i asiatiske land, med sin forekomst på stige. Cancer stamcelle (CSC, også kjent som tumor-initiering celler, TIC) er iboende resistent mot cytotoksisk kjemoterapi og strålebehandling og medarbeidere med dårlig prognose og terapi fiasko. Målrette terapi mot kreft stamcelle har dukket opp som en potensiell terapeutisk tilnærming for å utvikle effektive regimer. Imidlertid er egnet CSC markør for ESCC for identifikasjon og målretting likevel begrenset. I denne studien vi vist de nye CSC membranproteinmarkører ved hjelp av to distinkte stemness egenskapene av cancercellelinjer ved en sammenlignende tilnærming. Etter validering av RT-PCR, qPCR og western blot analyser, inter adhesjonsmolekyl 1 (ICAM1) ble identifisert som en potensiell CSC markør for ESCC. ICAM1 fremmer kreft celle migrasjon, invasjon samt øke mesenchymale markør uttrykk og demping epitel markør uttrykk. I tillegg ICAM1 bidrar til CSC egenskaper, inkludert sfære formasjon, narkotika motstand, og tumorigenesis i mus xenotransplantasjon modell. Basert på analyse av ICAM1 regulerte proteiner, spekulerte vi at ICAM1 regulerer CSC egenskaper dels gjennom en ICAM1-PTTG1IP-p53-DNMT1 veien. Videre har vi observert at ICAM1 og CD44 kan ha en kompensasjons effekt på å opprettholde de stemness egenskapene til ESCC, noe som tyder på at kombinasjonen av multi-målsøkende behandling bør være under alvorlige hensyn til å skaffe en mer potent terapeutisk effekt på CSC av ESCC.
Citation: Tsai ST, Wang PJ, Leo NJ, Lin PS, Chen CH, Chang WC (2015) ICAM1 er en potensiell Cancer Stem Cell Marker av Esophageal plateepitelkarsinom. PLoS ONE 10 (11): e0142834. doi: 10,1371 /journal.pone.0142834
Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, TAIWAN
mottatt: 07.09.2015; Godkjent: 27 oktober 2015; Publisert: 16.11.2015
Copyright: © 2015 Tsai et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av departementet for vitenskap og teknologi, Taiwan Grants NSC102-2320-B-039-050 og MOST 102-2911-i-002- 303. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Esophageal kreft er den åttende største årsaken til malignitet over hele verden med sin forekomst på vei oppover [1]. Det representerer 1% av kreft diagnostisert i USA, med anslagsvis 17.500 nye tilfeller rapportert i 2012 [2]. Spiserørskreft er patologisk klassifisert i to store undergrupper, esophageal adenokarsinom (EAC) og esophageal plateepitelkarsinom (ESCC). ESCC står for ca 90% av spiserørskreft diagnostisert i asiatiske land. Siden tidlig deteksjon strategier ikke har blitt godt brukt til klinisk skjermen, er disse svulstene ofte diagnostisert i avansert stadium. Når metastasering skjer, øker kreftdødelighet betydelig [3]. Den samlede fem års overlevelse etter kirurgisk reseksjon er 70% ~ 92% for pasienter uten lymfeknuteaffeksjon, men bare 18% ~ 47% for pasienter med lymfeknutemetastase [4]. Mangelen på grunnleggende kunnskap om stråling og kjemoterapi motstand i disse tumorceller har vært en stor klinisk barriere for å skaffe seg et bedre resultat. Den begrensede forståelse av molekylærbiologi av svulster har forlatt oss med empiri i klinikken
Cancer stamcelle. (CSC, også kjent som tumor-initiering celle, TIC) er definert som en undergruppe av tumorceller med selv -renew evne og innebærer i kreft initiering og progresjon. CSC er også meget motstandsdyktig mot stråling og kjemoterapi, og som er ansvarlig for kreft tilbakefall etter behandling [5]. Derfor CSC har blitt sett på som et attraktivt mål å destruktivt eliminere kreftceller. Det er viktig å identifisere potensielle CSC markører som kan brukes til å isolere og karakterisere cscs deres egenskaper til å være terapeutisk målrettet. Selv om CSC har vært mye oppdaget i solide tumorer, inkludert bryst, tykktarm, gliom, prostata, lever, og føflekkreft [6-11], og flere markører for deres identifikasjon er tilgjengelig, er svært begrenset molekylær markør for esophageal CSC.
epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT) er en viktig utviklingsprosess i løpet mesoderm dannelse og nevralrøret formasjon, der epitelceller erverve en trekkfugl mesenchymale fenotype [12]. Prosessene for tumor invasjon og metastase deler mange likheter med fenotypiske EMT, herunder tap av celle-celle adhesjon og en økning i cellemobilitet. Koblingen mellom CSC og EMT ble først etablert i den transform melkekjertelepitelet [13], og de eksperimentelle resultatene viste at TGFB-indusert EMT ble knyttet til oppkjøpet av brystkreft celler med CD44
+ /CD24
– /lav svulsten-initiering fenotype, mesenchymale egenskaper, og økt evne til å danne mammospheres. Nylig kjøpte bevis indikerte at CSC spiller viktige roller i metastasering av flere typer kreft [14,15]. Derfor øker vår generelle forståelse av molekylærbiologi av CSC vil trolig avdekke hvilken rolle CSC i metastasering av kreft.
Flere integrerte analyser, inkludert genomikk, Epigenomics, transcriptomics og proteomikk, har blitt rekruttert til å studere biologi av CSC. Blant dem, proteomikk har en unik posisjon på dette området. For eksempel, flere store gjennombrudd i CSC forskning var grunn til identifisering av proteiner ved anvendelse av proteomikk tilnærming som kolonistimulerende faktorer [16] og celleoverflatemolekyler CD [17]. Dessuten er proteomikk fremstår som et kraftig verktøy for å identifisere signalkomplekser som styrer CSC differensiering og regulere CSC vedlikeholds trasé [18]. En systematisk proteomikk tilnærming til karakter CSC eiendommer vil kaste nytt lys over CSC biologi og akselerere kliniske applikasjoner i prognosen, diagnose og behandling av kreft [19].
Membran proteiner, inkludert enzymer, reseptorer, ionekanaler, og transportører, spille mange biologiske funksjoner. Dysregulering av membranproteiner har blitt knyttet til en rekke humane cancere [20]. Derfor har mange membranproteiner blitt karakterisert som markører for diagnose og terapeutiske mål, omtrent 70% av eksisterende farmasøytiske stoffet mål er membranprotein [21]. I denne studien ønsket vi å identifisere potensielle overflatemarkører esophageal CSC bruker en proteomikk tilnærming. ESCC cellelinjer med forskjellige sfære formasjon egenskaper ble anvendt for screening av egnede overflatemarkører. CSC egenskaper potensiell markør ble videre karakterisert ved hjelp av kolonidannelse analysen, resistent analysen, og tumorgenisiteten analysen i immunmangelfull mus.
Materialer og metoder
Cellelinjer og cellekultur
i denne studien ble menneskelige esophageal kreft cellelinjer kjøpt fra Bioresource Innsamling og Research Center of Food Industry Research and Development Institute (Hsinchu, Taiwan, https://www.bcrc.firdi.org.tw/). Cellelinjer CE81T /VGH (CE81T; BCRC 60166) og CE146T /VGH (CE146T; BCRC 60167) ble hentet fra 57-, og 50-åringen taiwanske menn, henholdsvis. Begge cellelinjer ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles minimale essensielle medium (DMEM; Gibco BRL) supplert med 10% (v /v) serum føtalt bovint (FBS) (Gibco BRL), 100 U /ml penicillin, og 100 mg /ml streptomycin (Gibco BRL), og holdt ved 37 ° C i en 5% CO
2/95% luft atmosfære.
Membran protein utvinning og i-gel fordøyelse
compartment protein utvinning pakkene CNM (BioChain Institute) ble anvendt for å ekstrahere membranproteiner av kreftceller. CNM Settet inneholder to kjemisk ekstraksjon trinn: (1) fjerning av cytoplasmatiske og nucleic proteiner ved reaksjonsbuffer inneholdende HEPES, MgCl
2, KCl, sukrose, glycerol, og natriumortovanadat; (2) ekstraksjon membranproteiner av NP40 og natriumdeoksycholat. Før massespektrometer-analyse, ble membranproteiner separert ved SDS-PAGE og delt opp i ti fraksjoner gel, som deretter ble kuttet i små biter (gel 1 mm
3) og underkastet in-gel fordøyelse, individuelt. Den in-gel fordøyelse prosedyre omfatter Coomassieblå avfarging, disulfid-bindingen reduksjon, acrylation med iodoacetamide, og trypsin fordøyelse, fulgt våre tidligere beskrevet metode [22].
Matrigel invasjonen og sårtilheling analysen
In vitro
invasjonen ble analysert ved hjelp av Matrigel-belagt (1 mg /ml; BD Biosciences) PET membran Transwell sett (BD Biosciences) på en 24-brønns plate. Kreftceller (1,5 x 10
5 celler i 200 ul) ble suspendert i DMEM-medium og tilsatt til den øvre halvdelen av innsatskammeret. DMEM-medium supplert med 10% FBS ble tilsatt som en kjemoattraktant til den nedre halvdel. Etter inkubering ved 37 ° C i 24 timer, ble kreftcellene passert gjennom innsatsen fiksert med 3,7% formalin (Sigma-Aldrich) og farget med 0,1% krystallfiolett (Sigma-Aldrich).
i vitro
migrasjon ble analysert ved hjelp ibidi Kultur-Sett (ibidi). Kreftceller (70μl, konsentrasjons: 7×10
5 celler /ml) ble lagt til Kultur-Insert godt og dyrket i 24 timer. Etter fjerning av kultur-Insert, kreftceller ble dyrket i 16 timer. Migrasjonen avstand av kreftceller ble registrert og målt ved hjelp av programvarebilde J.
Sphere-analysen
Sphere-analysen ble utført i 6cm kultur fatet belagt med 1% agarose. Kreftceller suspendert i serumfritt medium ble sådd ut ved en densitet 5.000 celler /skål og inkubert i 7 dager. Antallet primær sfære ble talt manuelt på syvende dagen etter mikroskop. For sekundær sfære assay, ble kulene fra primærkultur samlet og inkubert med trypsin ved romtemperatur i 10 min. Trypsinisert celler fra sfærer ble ført gjennom 26 G nål tre ganger. Dissosierte celler ble individuelt belagt på 5.000 celler /parabol tetthet i 6cm kultur parabolen for 7 dager. Antallet sekundære sfære ble talt opp på syvende dagen.
tumorigenicity analysen i immunmangelmusemodell
Dyret prosedyre (102-97-N) ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité (IACUC) ved Kina universitetssykehus (Taichung, Taiwan). Forskjellige doser av CE146T celler (10
2, 10
3, og 10
4) ble injisert subkutant i begge flanker av 5 uker gamle hann NOD-SCID-mus for å generere tumorer. Venstre flanke ble injisert med kontrollgruppe av kreftceller, og høyrekanten ble injisert med eksperimentelle gruppen. Tumorstørrelse ble målt ved kalibermåling ukentlig når tumorer ble synlig, og varigheten av observasjonen var åtte uker. Tumor volum ble beregnet med formelen: (lengde x bredde
2) /2
massespektrometer analyse
massespektrometer analyse ble utført ved bruk av lineær ionefelle-Fourier transform ion syklotronen. resonans massespektrometer (LTQ-FTICR MS, Thermo Fisher) er utstyrt med en nano-electro ion kilde (nytt mål) og en nano-HPLC system. Nano-HPLC separasjonen brukt en omvendt nano-kolonne (75 mikrometer ID × 200 mm) pakket med magi C18AQ resin (partikkelstørrelse 5 um porestørrelse 200 A °; Michrom Bioressurser) og en Agilent 1100-serien binære HPLC pumpe (Agilent Technologies) . Den analytiske Programmet ble satt til en lineær gradient fra 10% til 50% ACN med en 60 min løpende syklus. Undersøkelsen skanning av MS-analyse (
m /z
320-2,000) ble utført i LTQ-FTICR MS med en masse oppløsning på 100 000 på
m /z
400. De ti mest tallrike formere ladede ioner ble sekvensielt isolert for MS /MS ved LTQ. De resulterende data ble påført på MaxQuant programvare [23] for protein identifikasjon. Nøyaktig label-free kvantifisering ble utført ved hjelp av MaxLFQ programmet ved normalisering og maksimal peptid forhold utvinningsmetoder [24]. Betydningen terskel for identifikasjon ble satt til
P
0,01.
statistikker
Data ble uttrykt som betyr ± SD. Betydningen av forskjell ble undersøkt av Student
t
-test (to-halet).
P
0,05 ble ansett å være betydelig.
Resultater
CE146T har mer metastatiske potensial og stemness egenskaper enn CE81T
For å velge passende mål celle for identifisering av nye CSC markører, vi først preget metastatiske egenskaper som migrasjon og invasjon og sfære dannelse evne esophageal plateepitel kreft celle linjer CE81T og CE146T. Resultatene viste at CE146T har bemerkelsesverdig høyere migrasjon og invasjons egenskaper enn CE81T (Fig 1A og 1B), som ble identifisert som en godt differensiert kreftcelle. I tillegg CE146T har også høyere sfære formasjon evne enn CE81T (figur 1C). Nylige studier har vist at CSC av ESCC uttrykker høye nivåer av CD44 [25,26]. Følgelig har vi brukt strømningscytometri for å analysere ekspresjon av CD44 i CE146T og CE81T. Resultatet viste at CE146T har høyere nivåer av CD44 enn CE81T (Fig 1 D). Samlet utgjør disse data indikerte at CE146T har mer CSC befolkning og viser flere CSC egenskaper enn CE81T, noe som tyder på at vi er i stand til å identifisere CSC markører ved å sammenligne proteomikk endringer av CE146T og CE81T.
(A) Wound- healing analysen. CE81T og CE146T ble dyrket i ibidi Kultur-Insert godt, og migrasjons bilder av kreftceller ble registrert ved 0HR (fjerning av Kultur-Insert) og 16 timer. Migrasjon avstand ble målt ved hjelp av programvare image J. (B) Matrigel invasjonen assay. Representative fotografier inneholder invadert avbryte celler som ble farget med krystallfiolett. (C) Sphere formasjon assay. Ulike størrelser av kuler i CE81T og CE146T ble talt på dag 7. Forsøk ble utført i tre eksemplarer (gjennomsnitt ± SD). (D) CD44 uttrykk i CE81T og CE146T ble målt ved hjelp av flowcytometri.
Identifikasjon av CSC markører ved hjelp av en komparativ membran proteomikk tilnærmingen
Membran protein har fordelen i diagnostisk og terapeutisk anvendelse . Derfor brukte vi en komparativ membran proteomikk analyse for å identifisere nye CSC markører fra CE146T og CE81T. Selv CE146T og CE81T ikke isogen, kan CE146T uttrykke høyere nivåer av proteiner assosiert med CSC egenskaper enn CE81T basert på ovennevnte observasjoner. I MS-analyse, ble to tekniske replikater utført for hver prøve. Protein identifikasjon og etikett-fri kvantifisering av masse signaler ble analysert ved hjelp av MaxQuant programvare [23]. I denne analysen, ble totalt 652 membranproteiner identifisert, som omfattet 266 plasmamembranproteiner basert på Gene Ontologi definisjon. Blant membran proteiner, totalt 13 proteiner viste bestemt uttrykk eller mer enn en 50-dobling av uttrykk i CE146T sammenlignet med CE81T (tabell 1).
For å validere MS resultater, brukte vi RT-PCR, kvantitativ PCR (qPCR), og western blot for å undersøke de gen- og protein uttrykk nivåer av kandidat proteiner, bortsett fra to histokompatibilitetsantigener. RT-PCR og qPCR Resultatene viste at intercellulært adhesjonsmolekyl 1 (ICAM1) og prominin-2 (PROM2) har høyere genekspresjon i CE146T enn i CE81T, noe som er konsistent med den proteomikk funn (Fig 2A og 2B). Western blot viste at ICAM1 har en høy ekspresjon i CE146T, men ikke PROM2 (figur 2C). Følgelig, evaluerte vi videre karakteren av ICAM1 på CSC egenskaper ESCC.
(A) mRNA-nivåene av target-proteiner ble analysert ved hjelp av RT-PCR-analyse. GAPDH tjente som kontroll. (B) Et mRNA-nivåer av target-proteiner ble analysert ved hjelp av qPCR-analyse. (C) Protein nivåer av både PROM2 og ICAM1 ble analysert ved hjelp av western blot-analyse. β-actin tjente som lasting kontroll.
ICAM1 øker metastatisk potensial av kreftceller
For å evaluere funksjonene ICAM1 på CSC egenskaper, brukte vi den lentiviral vektor uttrykker ICAM1 spesifikke kort hårnål RNA (shRNA) for å slå ned ICAM1 uttrykk. To typer ICAM1 shRNA ble transfektert inn CE146T (merket som shICAM1 # 1 og shICAM1 # 2), begge transfekterte celler viste åpenbare knockdown av ICAM1 i western blot analyse (figur 3A). ICAM1 knockdown ikke påvirke cellevekst av CE146T (figur 3B), men det betydelig redusert cellemigrering og invasjons evnene til CE146T i sårhelende og Transwell analyser, henholdsvis (fig 3C og 3D). I tillegg er to farmakologiske ICAM1 hemmere, silibinin [27] og 18 beta-glycyrrhetinic syre (18β-GA) [28], vises tilsvarende effekt på å redusere migrasjon og invasjon evner CE146T (figur 3C og 3D). Resultatene indikerte at ICAM1 bidrar til CE146T metastatiske egenskaper
in vitro
. Derfor vi videre fastslått om ICAM1 knockdown påvirker uttrykket nivåer av EMT markører. Western blot Resultatet viste at både shRNA og farmakologisk inhibering kunne øke nivåene av epitelial markør slik som ZO-1 og dempe nivåene av mesenchymale markører slik som N-cadherin og fibronektin (figur 3E).
(A) ICAM1 uttrykk ble slått ned ved hjelp av to typer shRNA, shRNA # 1 mål sekvens er: GCCCGAGCTCAAGTGTCTAAA, og shRNA # 2 mål sekvensen er: CCTCAGCACGTACCTCTATAA. (B) Cellevekst av CE146T ble analysert ved anvendelse av MTT-analysen. ICAM1 knockdown ikke påvirke veksten av CE146T celler. CE146T-shGFP fungerte som kontroll. Effektene av ICAM1 knockdown på cellemigrering og invasjons egenskaper ble analysert ved å anvende (C) sårhelende og (D) matrigel invasjons analyser, respektivt. Begge forsøkene ble utført in triplo (gjennomsnitt ± SD). (E) Ekspresjon av EMT markører ble bestemt ved anvendelse av western blot-analyse. CE146T ble behandlet med ICAM1 inhibitor silibinin (2gm) eller 18β-GA (10 uM) for 24-timers. Uttrykk for epitel markør ZO-1 og mesenchymale markører N-cadherin og fibronektin ble undersøkt ved hjelp av spesifikke antistoffer. β-actin tjente som lasting kontroll.
ICAM1 øker sfære dannelse og narkotika motstand
CSC har vært kjent for å øke muligheten for sfære dannelse og uttrykke svært motstandsdyktig mot stråling og kjemoterapi. Til tegn funksjonene av ICAM1 på sfære formasjon, sammenlignet vi muligheten for en kule dannelse mellom shICAM1 # 1 og # 2 shICAM1 og deres kontrollgruppe shGFP av CE146T. Resultatet viste at ICAM1 knockdown reduserer sfæren dannelsen evne CE146Y, uansett i sfære nummer eller i sfæren størrelse (figur 4A). I tillegg er det også betydelig redusert annenhånds sfære dannelsen av CE146T (fig 4B).
Analysene av (A) primære sfære formasjon og (B) sekundær sfære dannelse ble utført i CE146T med eller uten ICAM1 knockdown. Det ble observert sfære antall og størrelse og telles av primær ved syvende dag kultur. (C) Legemiddelresistens analyse. CE146T-shGFP og ICAM1-shICAM1 # 1 ble behandlet med forskjellige doser av cisplatin til 24 t, og cellenes levedyktighet ble målt ved anvendelse av MTT-analysen. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer (gjennomsnitt ± SD).
Cisplatin er en vanlig brukt cellegift i kjemoterapi av spiserørskreft, mens cisplatin har også en klinisk viktig radio-sensibiliserende effekt som gjør kombinasjonsbehandling praktisk [29]. For å evaluere funksjonene ICAM1 på cisplatin motstand, behandlet vi CE146T med forskjellige doser av cisplatin og bestemt celle levedyktighet ved hjelp av MTT-analyse. Resultatet viste at ICAM1 knockdown reduserer muligheten for cisplatin motstand av CE146T, og IC50 av CE146T i kontrollgruppen (shGFP) og ICAM1 knockdown gruppe (shICA1 # 1) er 5 uM og 3,5 uM av cisplatin, henholdsvis
( fig 4C).
ICAM1 fremmer tumordannelse i immunmangelfull mus
for å studere funksjonene ICAM1 på tumorigenesis
in vivo
, vi injisert subkutant i begge flankene av NOD-SCID mus med 10
2, 10
3, eller 10
4 av CE146T celler. Venstre flanke ble injisert med kontrollgruppe av CE146T (shGFP), og høyre flanke ble injisert med eksperimentell gruppe CE146T (shICAM1 1 #) (figur 5A). Resultatene viste at selv en lav dose av CE146T celler (10
2) uten subpopulasjon anrikning er i stand til å indusere tumorgenese i NOD-SCID-mus, noe som tyder på at CE146T faktisk har høy populasjon av CSC (figur 5B og 5C). I tillegg er høyere dose av ICAM1 knockdown CE146T-celler (10
4) er nødvendig for å indusere svulstdannelse, avsløre at ICAM1 knockdown reduserer
in vivo
karsinogent potensial, en av de viktigste egenskapene til CSC (figur 5B og 5C).
(A) Forskjellige doser av CE146T celler, 1×10
2, 1×10
3, og 1×10
4, ble injisert subkutant i begge flanker av 5 uker gamle mannlig NOD-SCID mus (
N
= 4). Representative subkutane svulster avledet fra CE146T-shGPF i venstre flanke og CE146T-shICAM1 # 1 i høyre flanke. (B) Antall tumordannelse i hver gruppe ble nedtegnet og sammenfattet. (C) Tumor størrelse ble registrert ukentlig og det gjennomsnittlige tumorvolumet i hver gruppe ble plottet. Observasjonen ble fortsatt i åtte uker etter vaksinasjonen.
ICAM1 regulerer esophageal CSC egenskaper dels gjennom p53-avhengige veien
For å realisere potensialet mekanisme ICAM1 i å regulere CSC egenskaper, vi utførte en komparativ proteomikk analyse for å undersøke protein endringen mellom shGFP gruppe og shICAM1 gruppe CE146T. Blant de identifiserte liste (S1 Table), la vi merke til en p53-relaterte gruppen betydelig ned-uttrykk sammen med ICAM1 knockdown (tabell 2). P53 er en godt studert tumor suppressor i kreft biologi. Nyere studier i stamcellefeltet har markert en dyp rolle p53 som barriere mot kreft stamcelledannelse [30,31]. Derfor undersøkte vi p53 protein nivåer av CE146T i shGFP kontroll og under behandling av shRNA eller farmakologisk ICAM1 inhibitor tilstand. Western blot viste at ICAM1 knockdown og farmakologiske inhibitorer er i stand til å øke nivåene av p53 CE146T (figur 6A), noe som tyder på at ICAM1 kan regulere esophageal CSC tegn, i det minste delvis, ved å redusere p53-nivåer og dens tilhørende signalveier. Vi ytterligere validert p53-relaterte undergruppe av proteomikk funn ved hjelp av RT-PCR-analyse. Resultatet viste at mRNA-nivåene av hypofysetumor-transgenet en protein-veksel protein (PTTG1IP) og DNA (cytosin-5) metyltransferase 1 (DNMT1) er åpenbart redusert under ICAM1 knockdown tilstand, noe som er konsistent med den proteomikk resultat (fig 6B).
(A) p53 nivåer av CE146T i shGFP kontroll og under shRNA knockdown eller ICAM1 hemmer forhold ble analysert ved hjelp av western blot analyse. Det relative forhold av p53-nivåer ble normalisert med p-aktin nivåer. (B) Et mRNA-nivåene av p53-relaterte proteiner PTTG1IP og DNMT1 ble analysert ved hjelp av RT-PCR-analyse. GAPDH fungerte som kontroll.
ICAM1 og CD44 kunne utnytte en kompensasjon mekanisme for å opprettholde esophageal CSC egenskaper
I xenotransplantasjon eksperiment, mister ICAM1 knockdown sin hemming strøm på tumorigenesis ved høy celle nummer (10
4) injeksjon tilstand (figur 5B). Vi lurte på om korset regulering eksisterer i molekyler som påvirker CSC egenskaper, for eksempel ICAM1 og CD44. For å bevise dette spekulasjoner, vi gjensidig slått ned ICAM1 og CD44 og bestemt deres ICAM1 og CD44 uttrykk ved hjelp western blot. Resultatet viste at ICAM1 knockdown bruke både shRNA og farmakologisk hemming reduserer effektivt ICAM1 uttrykk og samtidig øker CD44 uttrykk i en omvendt korrelasjon måte (Fig 7A). I tillegg er CD44 knockdown også i stand til å øke ICAM1 ved omvendt korrelasjon på lignende måte (figur 7B). Dette funnet indikerte en mulig mekanisme som kreftceller kunne bruke en kompensasjon mekanisme for å opprettholde sine CSC egenskaper.
ICAM1 og CD44 uttrykk ble analysert ved hjelp av western blot analyse. (A) Både shRNA og farmakologisk hemming redusere ICAM1 uttrykk og samtidig øke CD44 uttrykk. (B) CD44 knockdown fører til økning ICAM1 nivåer i en kompenserte måte. CD44 uttrykk ble slått ned ved hjelp av tre typer shRNA, shRNA # 1 mål sekvens er: CGCTATGTCCAGAAAGGAGAA, er shRNA # 2 målsekvens: ATGGACTCCAGTCATAGTATA, og shRNA # 3 mål sekvensen er: GGACCAATTACCATAACTATT. β-actin tjente som lasting kontroll.
Diskusjoner
inter adhesjonsmolekyl 1 (ICAM1, CD54) er et 90 kDa glykosylert trans protein av immunglobulin super. ICAM1 spiller en viktig rolle i immunologisk synapse formasjon, T-celleaktivering, leukocytt trafikk, og tallrike cellulære immunresponser [32]. Tidligere studier observert at ICAM1 sterkt uttrykk i ulike stamceller inkludert benmarg, morkake, adipose, periodontal ligament, og Wharton gelé [33-36]. Nylig, ICAM1 ble identifisert til å tjene som en markør for leverkreft stamceller [37]. I denne studien ble ICAM1 identifisert til å uttrykke i høyere stemness egenskaper esophageal kreft CE146T cellene ved hjelp av en komparativ proteomikk tilnærming. Våre undersøkelser viste tilstedeværelse av ICAM1 medvirker til kreftcelle sfære dannelse, medikamentresistens, og tumorigenese i mus xenotransplantasjon modellen, noe som indikerer at ICAM1 kan brukes som en potensiell CSC markør for ESCC og derfor tjene som et terapeutisk mål for drug design og utvikling.
Systematisk meta-analyse påpekte positivt uttrykk av p53 representerer en gunstig prognostisk funksjon og er konsekvent assosiert med total overlevelse av ESCC [38]. Vår undersøkelse observerte at ekspresjon av ICAM1 omvendt korrelerer med p53-nivåer, noe som tyder på at høye ekspresjon av ICAM1 kan føre til kreft. I tillegg, sammenlignet med proteomikk endring av CE146T med og uten ICAM1 knockdown, identifiserte vi en undergruppe av proteiner relatert til ekspresjon og funksjon av p53. I samsvar med den proteomikk funn, både PTTG1IP og DNMT1 redusere sine mRNA nivåer sammen med ICAM1 knockdown. PTTG1IP kan fremme tumorvekst og invasjon evne, og dens høy ekspresjon uavhengig er assosiert med dårlig prognose og nedre sykdomsspesifikk overlevelse [39]. En ny studie viste at PTTG1IP er i stand til å redusere p53 stabilitet ved å forbedre ubiquitinering, som avhenger av E3 ligase aktiviteten av MDM2 [40]. Dette resultatet gir en forklaring til vår studie at ICAM1 knockdown reduserer PTTG1IP nivåer fører til stabilisere p53, og dermed øke p53 nivåer. DNMT1 er det viktigste enzymet som er involvert i å etablere genomiske metylering mønstre. DNMT1 overekspresjon ble identifisert i en rekke kreftformer, og det kan resultere i epigenetisk endring av multiple tumorsuppressorgener og til slutt føre til tumordannelse og dårlig prognose [41-46]. I tillegg ble DNMT1 overekspresjon vist å være forbundet med tap av undertrykkelse av p53 i cellulær og klinisk nivå [46]. Oppsummert vår observasjon og relaterte data tyder på en mulig mekanisme som ICAM1 kan regulere CSC egenskaper ved en ICAM1-PTTG1IP-p53-DNMT1 veien. Imidlertid gjenstår denne foreslåtte veien til å bli bevist av detaljerte eksperimenter.
signalveien krysstale, for eksempel mTOR /S6K1 og Hedgehog veier [47] eller EGFR og VEGF trasé [48], er godt kjent for å gi komplekst samspill og utstrakt kommunikasjon som svar på mobilnettet stimulering, og føre til synergi eller antagonistiske effekter og til slutt ønskelig biologiske resultater [49]. Enten kreft stamceller bruker en lignende mekanisme, molekylær krysstale, for å opprettholde sine CSC egenskaper forblir unnvikende. I denne studien, ble det observert en kompensasjon fenomen mellom ICAM1 og CD44 uttrykk nivåer, noe som reiser imidlertid også flere kritiske spørsmål. Gjør ICAM1 og CD44 dele felles signalnettverk for å opprettholde svulst stemness? Hva er det støkiometriske forholdet mellom ICAM1 og CD44 i å kontrollere CSC befolkningen og egenskaper? Omfattende etterforskning vil være nyttig i å avsløre de underliggende mekanismene som er involvert i vedlikehold av ICAM1 og CD44 i CSC av ESCC. Basert på en slik kompensasjon mekanisme, antyder vår studie kombinasjonen av flere målrettingsstrategiene bør være under vurdering for å skaffe seg et mer potent terapeutisk effekt på CSC av ESCC.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table.
doi: 10,1371 /journal.pone.0142834.s001 product: (PDF)
Takk
Dette arbeidet ble støttet av departementet for vitenskap og teknologi, Taiwan Grants NSC102-2320- B-039-050 og MOST 102-2911-I-002-303.
