Abstract
Til tross for at nye behandlingsregimer har forbedret total overlevelse av pasienter utfordret av tykk- og endetarmskreft (CRC ), er prognosen i metastatisk situasjon fortsatt begrenset. Den BCL-2 familie av proteiner har blitt identifisert som lovende anti kreft narkotika mål. Selv om små molekyler rettet mot BCL-2 proteiner er i kliniske studier, er lite kjent om deres virkninger på CRC. Målet med denne studien var å preklinisk undersøke verdien av ABT-737 og Obatoclax som kreft narkotika for CRC behandling. Virkningene av BH3-mimetika ABT-737 og Obatoclax på CRC-celler ble vurdert ved hjelp av levedyktighet og apoptose-analyser. Sårtilheling migrasjon og Boyden kammer invasjon analyser ble brukt. Tre-dimensjonale cellekulturer ble brukt til langtids vurdering av invasjon og proliferasjon. Klinisk relevante konsentrasjoner av pan-BCL-2-hemmer Obatoclax ikke indusere celledød. I motsetning til dette BH3-mimetiske ABT-737 indusert apoptose i en doseavhengig måte. Obatoclax forårsaket en cellelinje bestemt nedgang fra CRC cellevekst. Videre Obatoclax, men ikke ABT-737, gjenvunnet E-cadherin uttrykk og førte til svekket migrasjon og invasjon av CRC celler. Den proliferative kapasitet og invasivitet av CRC-celler ble hemmet av påfallende lav dose Obatoclax i langtids tre-dimensjonal cellekulturer. Obatoclax, men ikke ABT-737, forårsaket en G1-fase arrest ledsaget av en nedregulering av cyclin D1 og oppregulering av p27 og p21. Overekspresjon av Mcl-en, Bcl-x
L eller BCL-2 reverseres hemmende effekt Obatoclax om migrasjon, men ikke klarte å gjenopprette den proliferative kapasitet på Obatoclax-behandlede CRC celler. Dataene som presenteres indikerer bred og mangefasettert antitumor effekter av pan-BCL-2-hemmer Obatoclax på CRC celler. I motsetning til ABT-737, Obatoclax hemmet migrasjon, invasjon og spredning i subletale doser. Oppsummert denne studien anbefaler pan-BCL-2 hemming som en lovende metode for kliniske studier i CRC
Citation. Koehler BC, Scherr AL, Lorenz S, Elssner C, Kautz N, Welte S, et al . (2014) Pan-BCL-2-hemmer Obatoclax Utsetter cellecyklusprogresjonen og blokker Migrering av tykktarmskreftceller. PLoS ONE ni (9): e106571. doi: 10,1371 /journal.pone.0106571
Redaktør: Andrei L. Gartel, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 23 mars 2014; Godkjent: 30 juli 2014; Publisert: 05.09.2014
Copyright: © 2014 Koehler et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle data er inkludert i papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en Postdoktor-Fellowship gitt til BCK fra Det medisinske fakultet ved Universitetet i Heidelberg, Tyskland (http: //www.medizinische-fakultaet- hd.uni-heidelberg.de), og tilskudd til HSB fra den tyske Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft, https://www.dfg.de/, DFG Schu 1443 /4-1). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Colorectal karsinom (CRC) representerer den fjerde vanligste årsaken til død av kreft [1]. Forekomsten øker over hele verden og 40% av alle pasienter har fjernt organ metastaser ved tidspunktet for første diagnose. Systemisk terapi tilnærminger og kirurgi har forbedret total overlevelse, men prognosen i UICC stadium IV er fortsatt dårlig. Den BCL-2 protein serien inneholder viktige regulatorer av apoptose skuespiller på mitokondrie overflaten. Antiapoptotic medlemmer av familien loven ved å binde sine proapoptotiske slektninger, og dermed beskytter cellen fra døden. De antiapoptotic proteinene MCL-1, Bcl-2 og Bcl-x
L har vært vist å være oppregulert ved flere faste og hematologiske kreft enheter, inkludert CRC [2] – [4]. Disse observasjonene førte til etterforskningen av flere forbindelser direkte rettet mot antiapoptotic BCL-2 proteiner. Såkalte BH3-mimetika virker ved binding til BH3 kløften antiapoptotic proteiner [5]. Denne interaksjonen fører til utgivelsen av proapoptotiske BCL-2 proteiner endelig fremme celledød. Kliniske studier har vist sikkerhet og effekt av BH3 etterligninger i ulike hematologiske og noen solide maligniteter [6]. Til tross for kliniske undersøkelser, gyldige prekliniske data på styrken av BH3 etterligninger som et behandlingsalternativ for CRC er begrenset. I denne studien undersøkte vi antitumor aktivitet av Obatoclax og ABT-737 på CRC celler. Begge er små molekyl hemmere av antiapoptotic BCL-2 proteiner. De skiller seg i profilen sin hemming, siden ABT-737 ikke hemmer Mcl-en mens Obatoclax er en pan-BCL-2-hemmer. Vår studie viser at ABT-737 induserer celledød i ulike CRC cellelinjer. I motsetning til dette er celledød induserende kapasitet på Obatoclax begrenset og varierer mellom CRC-cellelinjer.
kapasitet til å migrere og for å invadere fremmed vev er et felles trekk ved kreftceller dramatisk bidrar til malignitet av sykdommen. Vår gruppe har nylig vist at nedregulering av Mcl-en, Bcl-x
L eller BCL-2 fører til en slående svekkelse av migrasjon og invasjon av CRC celler [7]. Her undersøker vi relevansen av BH3-etterligninger Obatoclax og ABT-737 for de ondartede funksjoner. I motsetning til ABT-737, subletale doser av Obatoclax blokk migrasjon og invasjon av CRC celler i en BCL-2 protein avhengig måte.
I tillegg skal denne studien å vurdere den proliferative kapasitet på CRC celler behandlet med Obatoclax og ABT-737. Lavdose Obatoclax, men ikke ABT-737, har imponerende hemmende virkning på cellesyklusprogresjon og proliferasjon. Her beskriver vi antiproliferative effekter av Obatoclax uavhengig av BCL-2 proteiner.
I konklusjonen, våre data viste at pan-BCL-2-hemmer Obatoclax utøver ulike antitumor aktiviteter uavhengig av celledød induksjon, anbefale pan-Bcl- 2 hemming for videre kliniske utviklingen i tykk- og endetarmskreft.
Resultater
ABT-737, men ikke Obatoclax mesylate induserer apoptose i CRC celler
for å vurdere celledød etter behandling av CRC celler med Obatoclax og ABT-737 i 48 timer, analyserte vi DNA-fragmentering ved strømningscytometri. ABT-737 forårsaket celledød i alle cellelinjene ble undersøkt i en doseavhengig måte. Den mest slående virkning ble observert i Colo205-celler (mer enn 90% apoptotiske celler etter 48 timers behandling med 10 uM ABT-737, fig. 1A). I motsetning til dette, økende konsentrasjoner av Obatoclax bare svakt indusert celledød i SW480, Colo205 og CaCo2-celler
(A og B) Strømningscytometrisk analyse av DNA-fragmentering som en indikator for apoptotisk død i fire CRC-cellelinjer.; 48 h behandling med ABT-737 eller Obatoclax. (C) MTT-analyse av HT29-celler etter 72 timer av Obatoclax og ABT-737 behandling. (p-verdier: Oba 0,25 mikrometer: 0.003, Oba 0,05 mikrometer: 0.004, ABT-737 5 mikrometer: 0,589) (D) Representant Western blot for kløyvde PARP etter 24 timer av Obatoclax behandling. Tubulin tjente som lasting kontroll. 2 uM behandling med Staurosporin i 24 timer tjente som en positiv kontroll for celledød induksjon. Analyser ble utført i tre paralleller. Barer representerer gjennomsnitt ± SD. Analyser som er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. Oba = Obatoclax, STS = Staurosporin.
HT29 celler viste ingen apoptotiske DNA fragmentering (Fig. 1B).
Vi ytterligere bekreftet våre funn ved Western blotting for kløyvde PARP. I tråd med flowcytometri data, var det ikke spaltede PARP påvises i alle CRC-cellelinjer som er vist som eksempel for HT29 og SW480 i fig. 1D.
For å undersøke effekten av Obatoclax på spredning, vi fulgte cellevekst av HT29 celler over tid (72 timer). Cellevekst ble hemmet selv under lav dose Obatoclax, mens ubehandlede og ABT-737 behandlede cellene fortsatte å spre seg. Dette resultatet er veiledende for en sterk effekt av Obatoclax på proliferative kapasitet (fig 1C).
Neste, vi forsøkte å vurdere styrken av Obatoclax sammen kjemoterapeutika godkjent for CRC behandling. Vi observerte at oksaliplatin er cytotoksisitet ble økt når den kombineres med Obatoclax. Effekter vises for en behandlingsperiode på 48 timer i vanlig cellekultur, og videre validert for en behandlingsperiode på 7 dager i 3D-cellekultur (fig. S3). Verken Obatoclax eller oksaliplatin alene var i stand til å indusere celledød i SW480 celler (Andel spaltet PARP positive celler: 1,3% [ubehandlet] 1.7 [0,25 mikrometer Obatoclax] og 1,6% [20 mikrometer Oxaliplatin]). I slående motsetning til dette 22,7% av celler som gjennomgikk apoptose som vist ved PARP-spaltede farging når Obatoclax og oksaliplatin ble slått sammen (fig. S3C). Viktigere var det ingen sensibiliserende virkning for kombinasjonen av Obatoclax med 5-FU (data ikke vist). Tatt sammen, våre observasjoner tyder på en doseavhengig celledød induksjon av ABT-737 og en dose og celletype avhengig effekt på proliferasjonen av Obatoclax. Kombinasjonen av BCL-2-hemmere med kjemoterapi, f.eks oksaliplatin, bør analyseres som en potensiell behandling tilnærming i fremtidige studier.
Obatoclax gjen E-cadherin i CRC celler, men etterlater antiapoptotic BCL-2 protein nivåer uendret
Vi har nylig vist at siRNA -mediert nedregulering av antiapoptotic BCL-2 proteiner svekker migrasjon og invasjon av CRC celler [7]. E-cadherin er et primært membranbundet protein med en nøkkelfunksjon for etterlevelse veikryss og Wnt-signal. Det har vist seg å være tapt i løpet av malign transformasjon [8]. Imponerende, fant vi en fremtredende utvinning av E-cadherin i alle cellelinjer, med unntak av SW480 celler, etter Obatoclax behandling (Fig. 2A). Av notatet, N-cadherin, som har blitt rapportert som en formidler av migrasjon, var ikke påvises i de fire cellelinjer undersøkt (data ikke vist) [9].
(A) Western blotting for E-cadherin i fire CRC cellelinjer etter 24 timers behandling med Obatoclax i økende doser (til venstre). Tilsvarende densitometrisk analyse i forhold til ubehandlede kontroller og justert til Tubulin som lasting kontroll. (B) Western blotting for Mcl-en, Bcl-2 og Bcl-x
L i HT29 celler (til venstre) og SW480 celler (høyre) etter 24 timers behandling med Obatoclax. Tubulin fungerte som en lasting kontroll. Western blot er representative for minst tre blotter fra uavhengige eksperimenter.
Andre rapportert at antiapoptotic BCL-2 proteiner, f.eks MCL-1, ble raskt og fullstendig nedbrutt i kreftceller behandlet med Obatoclax [10]. I skarp kontrast til våre data viser ingen reduksjon av Mcl-1, Bcl-2 eller Bcl-x
L nivåer. Helt i strid, hel-celle proteinet immunblotting viste et øket nivå av Bcl-x
L, og en viss økning av Bcl-2-nivåer i HT29-celler for alle Obatoclax konsentrasjoner anvendt (Fig. 2B, til venstre). I SW480 celler, Bcl-2 og Bcl-x
L nivåene øker under lav dose Obatoclax, men viste nivåer tilsvarende ubehandlede celler ved høyere Obatoclax doser (Fig. 2B, høyre). MCL-1-nivåer viste en mer fremtredende utvidelse under Obatoclax behandling sammenlignet med BCL-2 og Bcl-x
L i HT29 celler (Fig. 2B, venstre). ble påvist noen bemerkelsesverdige endringer i MCL-1-nivå for SW480 celler (Fig. 2B, til høyre).
Lav dose Obatoclax påfallende svekker migrasjon og invasjon av CRC celler
For ytterligere å undersøke virkningen av Obatoclax på CRC celler, utførte vi sårheling migrasjon analyser. Selv subletale doser var i stand til å svekke massivt vandrende kapasitet på HT29-celler over tid. Etter 48 timer ble målt gapet lukke var 650 um i kontrollcellene sammenlignet med 263 um i Obatoclax behandlede celler (figur 3A og B, p. 0,001). I tillegg, CaCo2-celler migrert betraktelig mindre under behandling med 0,25 uM Obatoclax. Gap nedleggelsen var 901 vs 744 mikrometer (Fig 3C, p. 0,05). Av notatet, ABT-737 mislyktes i å hemme migrering selv i en dose på 5 pM, som vist i fig. S1.
(A) Representative bilder av sår helbredelse skrape analyser av kjøretøy (øverst) og Obatoclax (lavere) behandlet HT29 celler. Scale bar gjelder for alle bilder. (B) Gap nedleggelse av HT29 celler etter 48 timers behandling med Obatoclax. (C) Gap nedleggelse av CaCo2 celler behandlet 48 timer med Obatoclax. Analyser ble utført i tre paralleller. Barer representerer gjennomsnitt ± SD. Analyser som er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, *** p 0,001. Oba = Obatoclax.
Tredimensjonal cellekultursystemer bedre reflektere fysiologiske cellevekst samt morfologi og fostre celle-celle interaksjoner [11]. Videre reiser et tredimensjonalt system mulighet for å utføre lang tid cellekultureksperimenter inkludert legemiddeleksponering å få mer informasjon enn konvensjonelle cellekultur. Derfor brukte vi Polystirol stillaser for 7 dager Obatoclax behandling etterfulgt av vurdering av invasjonen, spredning og apoptose. HT29-celler viste ingen induksjon av apoptose etter behandling med Obatoclax (Fig. 1 B og D). Påfallende var det en massiv blokade av invasjonen i 3D langsiktig cellekultur (Fig. 4A og B). I tillegg, Colo205 viste et dypt nedsatt migrasjon i lang sikt cellekultur som indikert ved en reduksjon av invasjon dybde (fig. S2). Ingen apoptoseinduksjon men en svekkelse av spredning, som indikert av en reduksjon av Ki67 positivitet, ble observert (fig. S2). Denne observasjonen understreker ytterligere den brede antitumoreffektivitet av Obatoclax med hensyn til en migrerings hemmende fenotype kombinert med en antiproliferativ virkning, uavhengig av celledødsinduksjon.
(A) Representative bilder av HT29-celler i stillasene etter 7 dagers behandling med Obatoclax (Hematoxylin og eosin farging. Scale bar gjelder for både bilder) (B) Tilsvarende analyse av invasjonen dybde i stillaser. Analyser ble utført i tre paralleller. Barer representerer gjennomsnitt ± SD. Analyser som er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. *** P 0,001. Oba = Obatoclax.
Deretter undersøkte vi invasivitet av SW480 celler behandlet med lavdose Obatoclax i en matrigel inneholder Boyden kammeret analysen. For å bevise passende festing av celler i Obatoclax inneholdende medium, ble cellene sådd ut på tidligere Polystirol plater fulgt av MTT-analyse etter 24 timer. Det var ingen svekket feste observert i nærvær av Obatoclax (data ikke vist). Invasjonen var påfallende hemmet i celler behandlet med 0,25 mikrometer Obatoclax (293 invadert kontrollceller kontra 89 invadert Obatoclax behandlede celler, s. 0,001, figur 5) og ble ytterligere opphevet i celler behandlet med 0,5 mikrometer Obatoclax (293 invadert kontrollceller vs. 59 invaderte Obatoclax behandlede celler, p .. 0,001, figur 5)
SW480 celler ble sådd i den øvre kammer av en transwell. 48 timer etter utsåing, ble kjernene på den nedre overflate visualisert ved farging Hoechst. (A) Representative bilder av lavere innsats overflaten etter Hoechst farging (skala bar indikere forstørrelse for alle paneler). (B) Fem synsfelt per innsats ble talt opp. N = 5 per gruppe. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Analyser som er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. *** P 0,001. Oba = Obatoclax, ctrl = kontroll.
Overuttrykte antiapoptotic BCL-2 proteiner gjenoppretter migrasjon av Obatoclax behandlet CRC celler
Neste, vi forsøkte å utforske engasjement av antiapoptotic BCL-2 proteiner til migrasjon hemmende fenotype forårsaket av Obatoclax. Vi fant en imponerende utvinning av migrasjon i HT29 celler behandlet med 0,25 mikrometer Obatoclax men overekspresjon antiapoptotic BCL-2 proteiner. Dette fenotype rever effekt ble observert for Mcl-1 (p 0,05), Bcl-x
L (p 0,001) og BCL-2 (p 0,001), med størst effekt for BCL-2 (fig. 6A-D). Overekspresjon av antiapoptotic proteiner stadig blokkerte inhibering av migrering henhold Obatoclax behandling i løpet av 72 timer. Det er av stor betydning i denne sammenheng for å sikre at en gjenopprettelse av migrasjon er noen sekundær funksjon i en økt spredning på grunn av en overekspresjon av antiapoptotic Bcl-2-proteiner. Derfor undersøkte vi spredning i celler overekspresjon Mcl-en, Bcl-2 eller Bcl-x
L. Vi observerte ingen effekt på proliferasjonen for noen av proteinene undersøkt som vist i detalj i fig. S4. (A-D).
(A-D) Gap lukking av sårtilheling migrasjon undersøkelser av HT29-celler behandlet med Obatoclax. (A) og Vector Mcl-1 transfekterte celler (B) vektoren og Bcl-xL transfekterte celler og (D) -vektor og Bcl-2-transfekterte celler. (C) Representative bilder av sårtilheling av vektor og Mcl-1 transfekterte celler behandlet med Obatoclax. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Analyser som er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. *** P 0,001. Vec = vektor.
Lav dose Obatoclax hemmer spredning via G1-fase arrestasjon ledsaget av en oppregulering av p27 og p21 samt nedregulering av cyclin D1
Siden CRC celler i 3D stillaser viste en svekkelse av spredning ved langtidsbehandling med Obatoclax, bestemte vi oss for ytterligere å dissekere cellesyklus regulering. Farging av DNA-innhold i henhold til Obatoclax behandling viste en massiv skifte fra G2- i G1-fasen av cellesyklusen som er indikativ for G1-fase rest eller en avbrutt G1-faseovergang. Andelen av celler i G2-fasen ble redusert fra 37% i kontrollcellene til 13% i HT29-celler behandlet med 0,25 uM Obatoclax (figur 7A og B, p. 0,001).
(A) Representative strømnings cytomeric analyser for DNA-innhold i HT29-celler behandlet med 0,25 uM Obatoclax. 2N = diploide celler i G1-fasen, 4N = tetraploide celler i G2-fase. (B) grafisk analyse av cellesyklus fasefordeling svarende til (A). Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. *** P 0,001. (C) Rel. mRNA-nivåene av Cyclin D1, p21 og p27 i HT29 og Caco 2-celler etter 24 timers behandling med Obatoclax. mRNA nivåer ble kvantifisert ved QRT-PCR og normalisert til GAPDH som husholdningsgenet. Analyser som er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. (D) Representative Western blot for Cyclin D1, p21 og p27 i HT29 og CaCo2-celler behandlet med Obatoclax i 24 timer. Tubulin fungerte som en lasting kontroll. Oba = Obatoclax, ctrl = kontroll.
I tillegg ønsket vi å kvantifisere sentrale cellesyklusregulerende proteiner etter Obatoclax behandling. Cyclin D1 (CD1) representerer nøkkel Cyclin for G1-fase overgang [12]. CD1 ble markert nedregulert etter Obatoclax behandling på både mRNA og proteinnivå i HT29 (0,5 ganger endring) og CaCo2 celler (mer enn 0,5 ganger endring, Fig. 7C og D). p27 er et cyklinavhengig kinase inhibitor (CDKI) og dens oppregulering indikerer cellesyklus-stans [13]. Vi observerte en oppregulering av p27 på mRNA og proteinnivåene i HT29 og CaCo2-celler behandlet med Obatoclax (Fig. 7C og D). I tillegg observerte vi en bemerkelsesverdig og doseavhengig økning av cyklinavhengig kinase inhibitor p21 på mRNA og proteinnivåene i HT29 og CaCo2-celler (Fig. 7C og D). Samlet utgjør disse dataene er veiledende for en cellesyklus regulering av Obatoclax via viktige regulatoriske proteiner av cellesyklus overgang, for eksempel cyclin D1, p27 og p21.
Diskusjon
Anitapoptotic medlemmer av Bcl -2 protein familien er ofte overexpressed i humane kreftformer inkludert CRC [3]. Høye nivåer av antiapoptotic proteiner har vist seg å bidra til dårlig behandling respons, og for å fremme tumorprogresjon. For eksempel, korrelerer Bcl-x
L uttrykk med lymfeknutemetastaser, dårlig differensiering og høyere Duke etappe i CRC [14]. Expression mønstre av Mcl-en er prediktiv for terapi respons hos pasienter diagnostisert med spredning CRC [15]. Derfor har store anstrengelser er gjort for å målrette antiapoptotic BCL-2 proteiner som tar sikte på kreft celledød induksjon [16]. Viktigere, dypere mekaniske og strukturelle innsikt har ført til utvikling av lavmolekylære inhibitorer av antiapoptotic Bcl-2-proteiner. Denne klassen av små molekyler som virker ved å binde seg til den hydrofobe BH3-kløften antiapoptotic Bcl-2-proteinene for derved å etterligne proapoptotiske Bcl-2-protein og fremmer celledød [17]. Sikkerhet og doseresponsstudier med Obatoclax er utført i solide maligniteter og lymfom [18], [19]. Til tross for at BH3-etterligninger har allerede lagt inn tidlige kliniske studier, er bare noen få kjent om effekten av BCL-2 protein hemming bortsett fra celledød regulering [18], [19]. Vi har nylig vist at en knockdown av Mcl-en, Bcl-2 eller Bcl-x
L påfallende hemmer invasivitet av CRC celler. I denne tidligere studie, en knockdown av en enkelt Bcl-2-protein (Mcl-1, Bcl-2 eller Bcl-x
L) var tilstrekkelig til å blokkere migrering og invasjon [7].
Ut disse tidligere rapporter, vår studie for å undersøke potensialet i BCL-2 hemmer små molekyler som legemiddelkandidater for CRC behandling
in vitro
. Først sammenlignet vi effekten av Bcl-2 og Bcl-x
L inhibitor ABT-737 med pan-Bcl-2-inhibitor Obatoclax. En direkte sammenligning av de to-hemmere kan skille effektene av en bred pan-BCL-2 hemming av Obatoclax fra en mer konkret måte ved hjelp av ABT-737. Til tross for at begge hemmere viste signifikant toksisitet i kliniske studier, kan disse forbindelsene brukes som verktøy for preklinisk
in vitro
-testing av BCL-2 hemming [19] – [22]. ABT-737 er blitt vist å virke synergistisk med oksaliplatin og Celecoxib i dreping av CRC-celler [23], [24]. Vi observerte doseavhengig apoptoseinduksjon forårsaket av ABT-737 i alle cellelinjer undersøkt. Det er godt dokumentert at en motstand mot ABT-737 kan drives ved høye nivåer av Mcl-en via hemming av proapoptotiske NOXA [25]. Ganske nylig er det blitt vist at kreftceller i hypoksiske betingelser er resensitized til ABT-737 ved et tap av Mcl-1 [26]. Siden effekten av ABT-737 er helt klart proapoptotiske og determinanter for følsomhet i CRC er godt dokumentert, har vi besluttet å ytterligere fokusere på antitumor effekter av Obatoclax.
I skarp kontrast til ABT-737, Obatoclax førte ikke til betydelige celledød induksjon i CRC celler. I vår studie, Obatoclax doser, anvendt var klinisk relevant, som angitt i fase I-studier, og nådde ikke Compound IC
50 rapportert for Obatoclax [19], [27] Interessant, Obatoclax behandling resulterte i stabile eller økende uttrykk nivåer av alle antiapoptotic BCL-2 proteiner undersøkt. En annen studie viste nedregulering av antiapoptotic BCL-2 proteiner etter Obatoclax behandling i lymfom celler [10]. Etter denne studien viser apoptose av lymfomceller forårsaket av Obatoclax, reduserte nivåer av antiapoptotic proteiner kan være sekundært i løpet av celledød i stedet for å utløses ved en direkte binding virkning av Obatoclax.
knockdown eller overekspresjon av Mcl-1 , Bcl-2 eller Bcl-x
L ikke forsinke cellecyklusprogresjonen og spredning i CRC celler [7]. I motsetning lav dose Obatoclax behandling forårsaket forsinket spredning i vår studie. Vi oppdaget en G1-fase arrest ledsaget av tap av cyclin D1 uttrykk og oppregulering av p21 og p27. Cyclin D1 (CD1) er den mest fremtredende G1-fasen cyclin og har blitt rapportert som en onkogen driver i kreftceller. CD1 ekspresjon er assosiert med neoplastisk transformasjon og øket kreftform i kreft [12]. G1 /S-faseovergangen er strengt regulert ved CDKIs slik som p21 og p27 gjennom inaktivering av G1 syklin-cyklinavhengige kinaser (CDK) komplekser [13], [28]. Til sammen våre data viser en ny cellesyklus regulere eiendommen til Obatoclax via G1-fasen arrest. Denne effekten ble ikke motvirket av overekspresjon av antiapoptotic BCL-2 proteiner. Videre verken overekspresjon av antiapoptotic BCL-2 proteiner eller ABT-737 berørte cellecyklusprogresjonen. Forsinke cellesyklus og svekke ukontrollert vekst av CRC celler er tilsynelatende en BCL-2 protein selvstendig effekt av Obatoclax. Selv om nøyaktige underliggende mekanismene og relevante mål står unnvikende, kan det være mulig at mTOR signal spiller en rolle i denne sammenhengen. En bindingsaktiviteten til Obatoclax til mTOR samt et sent stadium autofagi inhibering har nylig blitt rapportert, og kan spille en forårsakende rolle for de beskrevne antiproliferative effekter [29], [30]. Ytterligere anstendig molekylære analyser er garantert å dissekere Obatoclax relevant effekt på cellesyklus regulering. For eksempel kan CDK bli undersøkt som potensielle mål av Obatoclax i fremtidige studier.
Vanlige kjemoterapeutika er mest effektive på replikere kreftceller. Selv om vi tydelig at Obatoclax reduserer proliferative egenskapene til CRC celler, viser vår data Obatoclax evne til å overvinne celledød motstand mot oksaliplatin i SW480 celler. Den terapeutiske potensialet i å kombinere platinabasert kjemoterapiregimer med Obatoclax for å overvinne apoptoseresistens har allerede blitt rapportert, og er ytterligere aktualisert av våre data [31], [32]. I spiserøret karsinomceller, Obatoclax hadde synergistiske aktiviteter sammen med 5-FU [32]. I vår studie ble synergieffekter av Obatoclax begrenset til Oxaliplatin peker på en kreftcelletype avhengig effekt. Sterke effekter av Obatoclax på autofagi har blitt vist i flere nyere studier [32] – [34]. Det gjenstår imidlertid relevansen av Obatoclax-indusert autofagi signale unnvikende for CRC
Migrasjon og invasjonen er en forutsetning for kreft celle spredning, noe som fører til lokal invasjon og fjernt organ metastase [35] -. [37]. Vår gruppe nylig demonstrert regulatoriske funksjoner av antiapoptotic BCL-2 proteiner om migrasjon og invasjon av CRC cellene uavhengig av celledød og spredning [7]. I lys av det faktum at Obatoclax ikke kunne tilstrekkelig indusere død i CRC-celler, undersøkte vi migrering og invasjon av CRC-celler i henhold til Obatoclax behandling. Påfallende, lav dose Obatoclax blokkert migrasjon og invasjon i alle cellelinjer undersøkt. Langtids 3D-cellekultur av CRC cellene under Obatoclax behandling bekreftet denne blokade av migrering til tross for en mangel på celledød induksjon. Viktigere, migrasjon ble blokkert av Obatoclax i resistente cellelinjer som Colo205 og CaCo2. Cadherins er viktige regulatorer av cellebinding og er involvert i store signal nettverk som Wnt. Det har vist seg at en betinget tarm spesifikk knockout av E-cadherin forårsaket økt migrasjon og proliferasjon i tarmen [38]. På den annen side, ekspresjon av E-cadherin redusert migrering og proliferasjon i intestinal krypter [39]. I kolorektal kreftutvikling, funksjonell eliminering av E-Cadherins representerer et viktig steg i oppkjøpet av invasivitet [40]. Vi har derfor som mål å undersøke endringer i E-cadherin uttrykk. Vi demonstrerer en dyp restaurering av E-cadherin i CRC celler etter behandling med Obatoclax. Imidlertid kan E-cadherin oppreguleringen representerer molekyl bryteren tilbake til en mindre invasive fenotype av CRC celler forårsaket av Obatoclax.
Viktigere, og i motsetning til den vekstinhibitoriske funksjon av Obatoclax, migrasjon ble fullstendig gjenopprettet i CRC cellene overekspresjon Mcl-en, Bcl-2 eller Bcl-x
L. I sammenheng med invasivitet, antiapoptotic Bcl-2-proteiner synes som hovedmålene påvirket. Dette er i tråd med vår tidligere rapport som viser en regulerende funksjon av antiapoptotic BCL-2 proteiner på CRC celle invasivitet uten at det påvirker spredning eller celledød [7]. Andre studier støtter hypotesen om at BCL-2 proteiner er relevant for metastasering [41] – [43]. Omvendt er ABT-737 behandling ikke er tilstrekkelig til å blokkere migrering og invasjon av CRC-celler. I vår studie viser vi at Obatoclax er i stand til å inhibere begge, migrering og invasjon, selv i meget lave doser. Denne effekten av Obatoclax er ny og betydelig, til og med i hovedsak resistente celler. Siden ABT-737 ikke hemmer migrasjon, foreslår vi en agent-spesifikke og unike med Obatoclax innenfor gruppen av forbindelser målretting BCL-2 proteiner.
Konklusjon
Basert på data fra vår studien konkluderer vi med at Pan-BCL-2-hemmer Obatoclax motvirker ulike biologiske prosesser som er relevante for tumorprogresjon. Effekten av Obatoclax på CRC celler er bred og omfatter en celledød uavhengig men BCL-2 protein avhengige hemming av migrasjon. Den andre hovedeffekt påvirker cellesyklusprogresjon og er uavhengig av Bcl-2-protein målretting. Dermed pan-BCL-2 hemming, herunder utvikling av spesifikke og mindre giftige hemmere, er en lovende metode for CRC behandling og skal videre analysert, f.eks i kombinasjon med kjemoterapi.
Materiale og metode
Reagenser og cellelinjer
CRC cellelinjer HT29, SW480, CaCo2 og Colo205 ble kjøpt fra ATCC. Celler ble dyrket i en fuktig atmosfære (37 ° C, 5% CO
2) i RPMI + Glutamax (Gibco, Karlsruhe, Tyskland) supplert med 10% FCS (PAA Laboratories, Cölbe, Tyskland), 1% Pen /Strep (PAA Laboratories), 1% HEPES (Gibco) og 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA, Gibco). Obatoclax og ABT-737 ble kjøpt fra Selleckchem (München, Tyskland), Oxaliplatin fra Sigma-Aldrich (München, Tyskland).
Livskraftig og cellevekst test
Celler ble sådd på 12 brønners plater og 24 timer etter utsåing transfektert eller behandles som angitt. Cellevekst ble bestemt ved anvendelse av en kolorimetrisk 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse som beskrevet [7].
Kvantitativ sanntids-polymerase kjedereaksjon (q-RT PCR)
Isolering av total RNA og cDNA-syntese ble utført som tidligere beskrevet [44]. Q-RT-PCR ble utført ved anvendelse av primer assay kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Datainnsamling og bestemmelse av genekspresjon ble utført ved hjelp av LightCycler programvarepakke (Roche, Mannheim, Tyskland). Hver PCR-reaksjon ble utført i duplikater. mRNA-ekspresjon ble normalisert til ekspresjonen av husholdningsgenet GAPDH.
Påvisning av apoptose og cellesyklus fasefordeling
På dag en etter transfeksjon ble cellene behandlet som indikert i 48 timer. Supernatanten ble overført til FACS rør og cellene ble deretter forsiktig frittliggende ved hjelp av Accutase. Etter sentrifugering ble cellene resuspendert i en hypotonisk buffer inneholdende 0,1% (vekt /volum) natriumcitrat, 0,1% (v /v) Triton X-100 og 50 ug /ml propidiumjodid (Sigma-Aldrich). Etter 1 time inkubering ved 4 ° C, ble samlet DNA-innhold av celler målt i henhold til protokollen til Nicoletti
et al.
Ved hjelp av flow cytometri [45]. Cellesyklus analyse ble utført ved hjelp FACS Diva 6 (Becton Dickinson) og FlowJo 7.6.5. (Tre stjerners Inc.). Celler som representerer den sub-G1 fraksjon ble avbildet som apoptotisk.
Cell lyse, SDS-PAGE, Western blotting og densitometry
Celler ble sådd inn i 6 brønners plater, dyrket i 24 timer og behandlet som indikert. Cellelyse, SDS-PAGE og Western blotting ble utført som beskrevet tidligere [46].
