Abstract
Ikke-småcellet-Lung-Cancer (NSCLC) representerer ca 85% av alle lungekrefttilfellene og er fortsatt dårlig forstått. Mens signalveier operative i løpet av organutvikling, inkludert Sonic Hedgehog (Shh) og tilknyttede Gli transkripsjonsfaktorer (Gli1-3), har nylig blitt funnet å bli reaktivert i NSCLC, forblir deres funksjonelle rolle uklar. Her hypotese vi at Shh /Gli1-3 kunne mekle NSCLC autonom spredning og epitel /stromal signalering i tumorvevet. I denne sammenheng har vi undersøkt aktiviteten av Shh /Gli1-3 signalisering i NSCLC i begge, kreft og stromale celler. Vi rapporterer her at inhibering av Shh signale induserer en signifikant reduksjon i proliferasjon av NSCLC-celler. Denne effekt medieres av Gli1 og Gli2, men ikke Gli3, gjennom regulering av cyclin D1 og D2 cyclin uttrykk. Mens eksogene Shh var ute av stand til å indusere signalering i enten A549 lunge adenokarsinom eller H520 lunge plateepitel karsinom celler ble begge cellene funnet å utskille Shh ligand, som indusert fibroblast spredning, overlevelse, migrasjon, invasjon, og kollagen syntese. Videre Shh utskilt av NSCLC medierer produksjonen av proangiogenic og metastatiske faktorer i lunge fibroblaster. Våre resultater gir dermed bevis for at Shh spiller en viktig rolle som formidler epitel /mesenkymale crosstalk i NSCLC. Mens autonom Gli aktivitet styrer NSCLC spredning, økt Shh uttrykk ved NSCLC er forbundet med fibroblast aktivering i tumor-assosiert stroma. Vår studie fremhever betydningen av å studere stromal-assosiert celler i sammenheng med NSCLC om ny prognose og behandlingsalternativer
Citation. Bermudez O, Hennen E, Koch jeg, Lindner M, Eickelberg O (2013) Gli1 som megler Lung Cancer Cell Proliferation og Sonic Hedgehog-Dependent Mesenchymale celle aktivering. PLoS ONE 8 (5): e63226. doi: 10,1371 /journal.pone.0063226
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 9. oktober 2012; Godkjent: 01.04.2013; Publisert: 07.05.2013
Copyright: © 2013 Bermudez et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Helmholtz Association. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den dødeligste kreft på verdensbasis. Foreløpig ingen effektive behandlingstilbud finnes for lungekreft og 5-års overlevelse er bare 14% for pasienter med behandlings [1] sikret mangel på effektiv langtidsbehandling er beslektet med kompleksiteten av lungekreft og dermed med behovet for bedre å forstå biologien til lunge kreftutvikling. Lite oppmerksomhet har hittil vært adressert til den tumor-mikromiljøet som omgir, som utgjør det tumorassosierte stroma og fungerer som aktiv deltaker i tumorgenese. I de siste årene har økende bevis påpekt viktigheten av stroma i startfasen, progresjon og metabolisme av mange typer kreft [2] – [7]. Likeledes, signalering i den stromale celler har vist seg å være avgjørende for den maligne transformasjon av epitelceller [2], [5], [6].
Pathways involvert i organogenese og lunge forgrening morfogenese, inkludert pinnsvin ( Hh) signalering, har nylig blitt identifisert som sentrale aktører i kreft hos mennesker [8]. Tre Hedgehog (Hh) gener finnes hos pattedyr, med Sonic Hedgehog (Shh) som den mest bredt uttrykt genet. Utskilt Shh binder seg til reseptorene Lappet (ptch) som er tilstede i den cytoplasmiske membranen av mottakercellen. Binding av Shh til ptch utgivelser undertrykkelsen som ptch utøver på glattes, en syv-trans-span reseptor som protein viktig for transduksjon av Hedgehog signalering. Glattes muliggjør interaksjon av forskjellige pinnsvin nedstrøms effektorer i den primære cilia, noe som resulterer i aktivering av transkripsjonsfaktorer Gli [9]. Hos mennesker, de tre Gli sink-finger-proteiner (Gli1, Gli2 og Gli3) orkestrere Hedgehog-spesifikk reaksjon i cellen ved å modulere genekspresjon. Gener av the Hedgehog veien selv inkludert Gli1 og Ptch1 er mål for Gli, som representerer en feedback loop som fungerer som avlesning av Hedgehog aktivitet [10]. Aktivering av menneskelig kanoniske Hh veien avhenger uttrykk for ptch reseptorer (Ptch1, Ptch2) og lokkefugl reseptoren Hhip (Hedgehog-samspill protein) [11]. Intracellulære proteiner som regulerer Gli stabilitet, som SUFU (Suppressor av Fused) og spop (prikk typen POZ protein) spiller også en viktig rolle i å bestemme Gli aktivitet og dermed aktivering av kanonisk Hedgehog vei [12]. I de siste årene har studier fremhevet at det finnes en ikke-kanonisk Hedgehog sti som ikke krever hele Hysj-ptch-SMO-Gli aksen. En ikke-kanonisk pinnsvin signale avhengig av SMO, men uavhengig av Gli, som regulerer tubulogenesis og apoptose, er blitt beskrevet i endoteliale celler [13] .Med tid, Gli transkripsjonsfaktorer vises som en integrerende plattform av mange signaliserings inngangene, å etablere et andre slag av ikke-kanoniske Hedgehog signalering, avhengig av Gli men uavhengig av SMO. Dette er tilfellet for bukspyttkjertel ductal adenokarsinom, hvor Gli transkripsjon er regulert av TGF-ß og K-ras [14].
The Hedgehog signalveien spiller en avgjørende rolle under virveldyr utvikling kontrollere cellevekst, overlevelse, skjebne og mønster av kroppen plan. Endringer i Shh sti under lunge utvikling påvirke epitel /mesenchymale interaksjoner og resultere i forgrening morphogenesis defekter, svekke lungefunksjonen. Mens Shh signalering er viktig for lunge utvikling, rollen som denne signalveien kan spille i voksen lungene forble uklart, og er akkurat nå i ferd med å bli etterforsket. Nyere studier har understreket betydningen av Hedgehog signalisering i idiopatisk lungefibrose, en dødelig sykdom av ukjent ethiology. Bolaños et al har rapportert at ulike deler av Hedgehog veien er overexpressed i IPF lungene og IPF fibroblaster. Videre ble fibroblaster fra IPF lungene funnet å svare på Shh og dette svaret korrelert med fibroblast aktivering
i
vitro product: [15]. En uavhengig undersøkelse gjennomført av Cigna et al [16] viste at primære humane fibroblaster fra normal og IPF lunge uttrykke de viktigste komponentene i Hedgehog signalveien, assosiert med celleproliferasjon og uttrykk for myofibroblastic markører i fibroblaster. Mens disse studiene hente ut betydningen av Hedgehog signalisering i lungefibrose, rollen av denne veien i ulike former for lungekreft er fortsatt uklart. Lungekrefttilfellene er klassifisert i henhold til histologisk Type: de to mest utbredte typer lungekreft ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og liten celle-karsinom (SCLC). NSCLC og SCLC ikke bare vise forskjeller i størrelse og utseende av kreftceller, men også forskjellig prognose og klinisk ledelse. På grunn av heterogeniteten av hver lungekreft undertype blir ytterligere histologisk og molekylær karakterisering er nødvendig for å velge en mer spesifikk behandling. Tradisjonelt NSCLC ble undersøkt og behandlet for EGFR og K-
ras
mutasjoner. Imidlertid har det utseendet av resistens mot disse behandlingene og beskrivelsen av nye molekylære signaturer understreket behovet for en bedre tumor molekyl-profil-rettet terapi. Noen studier har beskrevet sammenhengen mellom nye mønstre av genuttrykk i bestemte undergrupper av NSCLC [17], [18], og andre foreslår anvendelse av ny svulst molekylære profilering i fremtidige behandlinger. For eksempel har evaluering av MMP2 og b-catenin uttrykk blitt foreslått å ha et potensial i diagnose av NSCLC med forskjellige karakteristikker clinicopathologic [19]. I SCLC, en svulst med primitive nevroendokrine egenskaper, ble Shh funnet å være aktivert i neuroendokrine progenitorceller og i tumorceller i mus [20], [21]. Selv om disse studier støtter et juxtacrine /autokrin aktivering av Hh i SCLC, er det ikke klart hvordan denne veien er aktivert i NSCLC, den hyppigst forekommende undertype av lungekreft. Gitt de kliniske og biologiske forskjeller mellom NSCLC og SCLC, hypotese vi at mekanismen for aktivering av Shh i NSCLC er forskjellig fra SCLC. Vi forsøkte å undersøke aktiviteten av Shh signalering i NSCLC i både kreft og stromale celler. For å kunne vurdere betydningen av Shh signalisering i NSCLC-celler, har vi utført knockdown av de tre Gli transkripsjonsfaktorer (Gli1-3), som medierer intracellulær Shh signalering, og studerte virkningen av denne på NSCLC proliferasjon. Videre har vi vurdert hvordan NSCLC celler og lunge fibroblaster reagerte på eksogen Shh i form av spredning, cellemigrasjon, invasjon, og ekstracellulære matrise ombygging.
Resultater
Cyclopamine, et pinnsvin Sperre, Reduserer NSCLC spredning og levedyktighet
en av de mest ugunstige karakteristikker av kreft er dereguleringen i celleproliferasjon. Vi har derfor undersøkt rollen som Shh kunne ha i NSCLC proliferasjon, ved bruk av celler fra adenokarsinom og celler fra plateepitel carcinom, det første og nest hyppigste form for lungekreft respektivt. Til å begynne med brukte vi Cyclopamine, en plante-avledet steroid alkaloid som inhiberer glattet (SMO), en G-protein-koblet reseptor som transduces Shh signal i cellen, til å blokkere reaksjonsveien Shh i NSCLC-celler. Ved behandling med cyclopamine, A549 adenokarsinomceller og H520 squamous cell lungekarsinom viste en signifikant reduksjon i celletallet spesielt ved lengre tidspunkter (figurene 1A og B). Cyclopamine også redusert celleoverlevelse (metabolsk aktivitet bedømt ved MTT-analyse) (figur 1A og B), og denne effekten var enda viktigere med økende doser av inhibitoren (figur S1A og fig S3E). For å utelukke at cyclopamine ikke provosere en cytotoksisk uspesifikk effekt på NSCLC celler, ble apoptose bestemt på cyclopamine behandling. Selv om cyclopamine induserte en svak økning i omfanget av apoptotiske celler, er andelen av apoptotiske celler var ikke statistisk forskjellig mellom behandlede-celler og ubehandlede celler (figur S1B og Figur S3F). For å bekrefte den spesifikke effekten av cyclopamine på NSCLC proliferasjon og levedyktighet, ble SMO stanse utført. SMO knockdown induserte en nedgang i både A549 og H520 celleproliferasjon og levedyktighet (data ikke vist). Til sammen viser disse resultatene at blokkering av pinnsvin reaksjonsvei gjennom SMO hemming, reduserer NSCLC spredning og levedyktighet.
lungeadenokarsinom A549-celler (A) og lunge-skvamøs karsinom H520-celler (B) ble dyrket i nærvær eller fravær av 10 uM cyclopamine i 5 dager. Proliferasjon ble bestemt ved celletelling, og celleoverlevelse ved MTT-assay. * P 0,1; ** P 0,05. (C) The Hedgehog-responsive transkripsjonsfaktorer Gli1, Gli2 eller Gli3 ble slått ned med siRNA i A549 celler. RT-qPCR ble utført for å bekrefte den spesifikke stanse av hver Gli og å vurdere uttrykk for Hedgehog reseptoren Ptch1. Resultatene er presentert som gangers forskjeller i mRNA-nivåer (2
∧∧Ct) sammenlignet med celler transfektert med en negativ kontroll siRNA (NC siRNA) som har noe homologi i virveldyr transcriptome. ** P 0,05, *** p 0,01. Virkningen av stanse Gli1, Gli2 eller Gli3 i A549-celle proliferasjon ble bestemt ved celletelling (D) og i celleoverlevelse ved MTT-assay (E). Resultatene er angitt i prosent som relativ spredning og relativ overlevelse sammenlignet med celler transfektert med den negative kontroll siRNA (NC). * P 0,1. (F) Representant fase kontrast mikroskopiske bilder etter 72 timer med siRNA presenteres. (G) RT-qPCR ble utført for å evaluere effekten av siRNA av Gli1, Gli2 og Gli3 i ekspresjonen av det G1 /S fase cykliner D (Cyc D1, Cyc D2, Cyc D3) og Cyclin E (Cyc E1). Resultatene er presentert som fold av mRNA-nivåer (2
∧∧Ct) sammenlignet med celler transfektert med en negativ kontroll siRNA (NC siRNA) som har noe homologi i virveldyr transcriptome. * P 0,1; ** P 0,05. (H) Western blot av cyclin D2 i A549-celler transfektert med Gli siRNA eller med en negativ kontroll siRNA (NC). Blotting av ß-aktin ble brukt som lasting kontroll.
stanse av Gli1 Reduserer NSCLC spredning av Moduler Cyclin D Expression
Selv om Cyclopamine har vist seg å påvirke celledeling i andre typer kreftceller, den spesifikke mekanismen hvorved Shh signale regulerer NSCLC celle kreft spredning fortsatt ukjent. For eksempel er det ikke kjent hvor hver av de tre menneskelige Hysj-transkripsjon faktorer Gli bidrar til NSCLC spredning. For å løse dette spørsmålet, brukte vi små forstyrrelser RNA (siRNA) for å kneble Gli1, Gli2 og Gli3. Ved en spesiell og viktig reduksjon i mRNA nivåer av Gli1 som ikke påvirker enten Gli2 eller Gli3 mRNA nivåer (figur 1C), ble celledeling og celle levedyktighet redusert i A549 adenokarsinom celler (figur 1D-F). Oppsigelsestid, ved å stanse all Gli1 provosert en reduksjon i Ptch1 mRNA nivåer (figur 1C). På grunn av at transkripsjonen av Ptch1 avhenger Gli1, reduksjon av Ptch1 mRNA-nivåer tjener som en ytterligere kontroll som indikerer at stanse av Gli1 var biologisk effektiv. Den spesifikke stanse all Gli2, som reduserte Gli2 mRNA nivåer og ikke redusere enten Gli1 eller Gli3 mRNA nivåer (figur 1C), redusert litt A549 celle nummer og celle levedyktighet, men ikke i en statistisk signifikant måte (figur 1D og E). Endelig siRNA av Gli3 som provoserte en viktig reduksjon i Gli3 mRNA nivåer, men ikke en nedgang i Gli1 eller Gli2 mRNA nivåer (figur 1C), ikke redusere A549 adenokarsinom celleproliferasjon eller celle levedyktighet (figur 1D og E) og i stedet forårsaket en svak økning i celletall på A549 adenokarsinomceller (figur 1D) sammen med en økning i Gli1 mRNA-nivåer (figur 1C). I H520 squamous lunge carcinoma celler (figur S3) og i store celle carcinoma celler (data ikke vist), den spesifikke stanse av Gli1, Gli2 eller Gli3 hadde en lignende virkning på celleformering og cyclin uttrykk. Viktigere, ekspresjonen av Shh-relaterte gener og cykliner ved Gli1, Gli2 og Gli3 lyddemping var ikke på grunn av Hprt1 uttrykk fordi et lignende mønster av ekspresjon ble funnet når 3 uavhengige referanse gener ble brukt i A549 (fig S2) og i H520-celler ( Figur S4).
for å utforske hvordan stanse av Shh pathway konsekvenser lunge adenokarsinom spredning, har vi vurdert endringer i uttrykket av cykliner D og E involverte i G1 /S cellesyklus overgang, på Gli nedregulering. Av interesse, siRNA av Gli1 og Gli2 provosert en viktig nedgang i cyclin D2 og en svak reduksjon i cyclin D1 mRNA nivåer (figur 1G). Nedgangen i cyclin D2 uttrykk ved Gli1 og Gli2 knockdown ble observert i mRNA, men også på proteinnivå (figur 1 H). Tatt i betraktning at Gli2 kunne påvirke cyklin D uttrykk, hypotese vi at det i kombinasjon med Gli1, kan denne transkripsjonsfaktor regulere celleproliferasjon på en betydelig måte. For å bekrefte denne hypotesen har vi innsett dobbel stanse av Gli transkripsjonsfaktorer. Mens enkelt stanse av Gli2 ikke reduseres betydelig celle levedyktighet, den doble stanse av Gli1 og Gli2 gjorde (figur S1C). I H520 lunge-skvamøs karsinom-celler, ble den spesifikke knockdown av Gli1 og Gli2 ved siRNA funnet å avta på en lignende måte cyklin D1 og D2 cyclin uttrykket (fig S3A). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at blokaden av Shh signalveien, enten med cyclopamine eller forstyrrer transkripsjonsfaktor Gli1 minsker NSCLC spredning.
NSCLC Cells aktiverer ikke Shh Pathway Ved Eksogene Shh Behandling
Siden blokaden av Hysj veien synker NSCLC spredning undersøkte vi om eksogent Shh gir en økning i celle spredning i disse cellene. Lunge adenokarsinom A549 celler og H520 plateepitel karsinom celler behandlet med rekombinant humant Shh ikke viser en endring enten i celle nummer (figur 2A og D) eller i celleoverlevelse (Tall 2B og E). I tillegg gjorde cellene utgjør ingen morfologisk endring ved behandling (Tall 2C og F). Disse resultatene antydet at NSCLC cellene ikke svare på Shh. For å validere Shh behandling, brukte vi primære embryo museceller fra lem knopper, vev som har vist seg å være lydhør overfor Shh. Ved Shh behandling, disse cellene viste en betydelig økning i Gli1 og Ptch1 mRNA-nivåer (60 fold og 9-ganger økning henholdsvis sammenlignet med ikke-behandlede celler, figur S5). Når A549 celler ble behandlet med Hysj, en meget beskjeden økning (1,65 ganger) i Gli1 mRNA nivåer på 8 timer og Gli1 proteinnivåer på 24 timer ble oppdaget. Men på lengre tidspunkter det ble var ingen signifikante endringer i enten Gli1 eller Ptch1 uttrykk (figur 3A og B). For H520 celler, noen vesentlig endring i enten Gli1 eller Ptch1 på mRNA og proteinnivå ble observert (Tall 3C og D). Disse resultatene indikerer at
in vitro
, begge typer NSCLC celler, sammenlignet med kjente Hysj-responsive celler, ikke særlig svare på eksogene Shh.
Lung adenokarsinom A549 celler (A-C ) og lunge squamous H520 karcinomaceller (D-F) ble behandlet eller ikke med rekombinant Shh (500 ng /ml). Celleformering ble bestemt ved celletelling (A, D) og celleoverlevelse ved MTT-assay (B, E) ved de angitte tider. Representative fase-kontrast mikroskopiske bilder av A549-celler (C) og med H520-celler (F) er vist.
NSCLC-celler ble behandlet eller ikke med rekombinant Shh (500 ng /ml) ved de indikerte tider . RT-qPCR ble utført for å evaluere Gli1 og Ptch1 mRNA-nivåer etter behandling i A549-celler (A) og H520-celler (C). Resultatene er presentert som gangers forskjeller i mRNA-nivåer (2
∧∧Ct) sammenlignet med ikke-behandlede celler for hvert tidspunkt. Western blot ble utført for å evaluere Gli1 og Ptch1 proteinnivåer i A549-celler (B) og i H520-celler (D) som var behandlet eller ikke med Shh. ß-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Sekresjon av human Shh ble evaluert i supernatantene av A549 og H520-celler ved hjelp av ELISA (E) og bekreftet ved western blot ved anvendelse av et antistoff som gjenkjenner det utskilte aktive form av Shh (innfelt E). Den vestlige blot ble utført med H520 supernatant (H520 sup.) Og med rekombinant Hysj (Rec. Shh) brukt som positiv kontroll. (F) Den knockdown av Shh gen av siRNA ble realisert i H520 celler. Shh sekresjon ble evaluert ved hjelp av ELISA og er uttrykt i prosent i forhold sekresjon sammenlignet med celler transfektert med en negativ kontroll siRNA (NC) som ikke har noen homologi i virveldyr transcriptome. ** P 0,05 (G) Etter stanse av Shh, ble NSCLC celler behandlet eller ikke med rekombinant Shh (500 ng /ml). RT-qPCR ble utført for å evaluere Gli og Ptch1 mRNA nivåer. Resultatene er presentert som fold av mRNA forskjeller (2
∧∧Ct) hos behandlede celler sammenlignet med ikke-behandlede celler.
NSCLC cellene skiller Shh Ligand
Ved hjelp av en spesifikk ELISA test for menneske Shh, fant vi at A549 adenokarcinomceller og sterkere H520 plateepitel karsinom råvarer Shh (henholdsvis pg /ml 170 og 2800, Figur 3E). Dette sekret kan være assosiert med endogen Shh produksjon av disse NSCLC-celler fordi konsentrasjonen av Shh i mediet for hver celletype var meget lav, sammenlignes med bakgrunnen (vann).
For å underbygge disse resultater og å undersøke om disse NSCLC cellene også produsere andre former for Hedgehog ligand, har vi vurdert uttrykket av Sonic, Desert (DHH) og indisk Hedgehog (Ihh) i A549 og H520 celler. Selv om vi ikke kunne oppdage ved RT-qPCR DHH og Ihh, fant vi at Sonic Hedgehog ble uttrykt i A549 og H520 celler, blir mer til uttrykk i disse siste (data ikke vist). Basert på disse funnene, har vi derfor konsentrert oss om Shh gjennom hele studiet. I tillegg, fordi H520 cellene produserer og skiller ut betydelige mengder Shh ligand, bestemte vi oss for å fokusere på disse NSCLC celler for videre studier relatert med Shh sekret. For å vurdere nærværet av den aktive formen av Shh i H520 supernatant mer nøyaktig, ble western blot utført med et antistoff som gjenkjenner den prosesserte aktive form av Shh (N-Shh). Tilstedeværelsen av den N-terminale utskilt peptid Shh i supernatanten av H520-celler ble dermed bekreftet (innfelt Figur 3E).
Fordi H520 cellene skiller ut en betydelig mengde Shh, men ikke svare på eksogene Hysj, vi sikte for å undersøke om denne mangel på reaksjon var forbundet med metning av endogen pinnsvin-aktivitet i disse cellene. For dette har vi gjort ved å stanse all Shh genet i H520 celler. Ved knockdown av Shh, som reduseres med 70% utskillelsen av Shh i H520-celler (figur 3F), eksogene Shh øket Gli1 mRNA-nivåer i disse cellene (figur 3G). Denne økningen, samt en svak økning i Ptch1 mRNA nivåer (Figur 3G) indikerer at H520 celler kan svare på Shh når deres endogene nivåer av Shh er redusert.
lungefibroblaster reagerer sterkt på Eksogene Shh
Siden NSCLC celler kan utsondre Shh ligand men at de ikke reagerer sterkt på eksogene Shh, undersøkte vi om Shh kunne heller aktivere de tilstøtende stromale celler. Faktisk lungefibroblaster behandlet med mus Shh viste en sterk pinnsvin reaksjonsvei aktivering ved behandling: Gli1 mRNA-nivåer økes opp til 800 ganger og Ptch1 mRNA-nivåer hadde en fold økning opp til 250, særlig ved 48 og 72 timer (figur 4A). Lignende resultater ble oppnådd med human Shh (figur 4A). Shh behandling også økt Gli1 og Ptch1 på proteinnivå (figur 4B). For å vite om lunge humane fibroblaster fra NSCLC miljø kan også svare på eksogene Shh, ble primære humane lunge fibroblaster isolert fra en resected lunge plateepitel karsinom. Interessant, Gli1 og Ptch1 mRNA-nivåer ble også øket på Shh behandling i disse cellene (Figur 4C). Disse resultater indikerer at,
in vitro
, lungefibroblaster er meget Shh-responsive celler, i motsetning til NSCLC-epitelceller.
Mus lungefibroblaster CCL206 ble behandlet eller ikke med 500 ng /ml rekombinant mus Shh eller 500 ng /ml humant Shh for 24, 48 og 72 timer. (A) mRNA nivåer av Gli1, Gli2, Gli3 og Ptch1 ved behandling ble vurdert av RT-qPCR. Resultatene er presentert som gangers forskjeller i mRNA-nivåer (2
∧∧Ct) av behandlede celler sammenlignet med ikke-behandlede celler for hvert tidspunkt. * P 0,1; *** P 0,01. (B) Western blot ble utført for å evaluere endringer i Gli1 og Ptch1 proteinnivåer i CCL206 fibroblaster behandlet eller ikke med mus Shh (500 ng /ml). ß-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (C) Primære humane fibroblaster ble behandlet eller ikke med rekombinant humant Shh (500 ng /ml) i 24, 48 og 72 timer. RT-qPCR ble utført for å vurdere mRNA nivåer av Gli1, Gli2, Gli3 og Ptch1. Resultatene er presentert som fold av mRNA forskjeller (2
∧∧Ct) i behandlede celler sammenlignet med ikke-behandlede celler for hvert tidspunkt. * P 0,1; ** P 0,05; *** P. 0,01
For å undersøke om manglende respons på eksogene Shh hos NSCLC celler var på grunn av en feil mottak av Shh ligand i disse cellene, har vi vurdert uttrykk for reseptorene Ptch1, Ptch2 og av Hhip, ansett som en lokkedue reseptor, i A549, H520 celler og CLL206 fibroblaster. Ptch1 ekspresjon ble funnet å være høyere enn Hhip i begge NSCLC-celletyper (fig S6). I tillegg er den relative ekspresjon av Ptch1 var høyere i A549 og i H520-celler enn i CCL206 fibroblaster, mens den relative ekspresjon av attrappen reseptoren Hhip var mer viktig i lungefibroblaster enn i NSCLC-celler (Figur S6). Dermed gjør balansen mellom ptch og Hhip uttrykk ikke ut til å være relatert (på mRNA-nivå) med ikke-respons fra NSCLC til eksogen Shh. Som intracellulære proteiner som Sufu og spop regulere på en positiv og en negativ form Gli stabilitet henholdsvis, har vi deretter vurdert om en ubalanse mellom disse Gli regulatorer kunne redegjøre for den ikke-responsive NSCLC til eksogen Shh. Vi fant ikke forskjeller i den relative uttrykk for Sufu sammenlignet med uttrykk for spop for en samme celletype (figur S6). Til slutt har vi vurdert om den relative uttrykk for Hh reseptorer og Gli regulatorer var forskjellig mellom NSCLC og lunge fibroblaster ved Shh behandling. Ingen forskjeller ble funnet i uttrykket av Ptch1, Ptch2, Hhip, Sufu og spop på Shh behandling, på kort (1, 3, 8 t) eller lengre tidspoeng (24, 48 h) (data ikke vist).
lungefibroblaster Svare på Shh utskilt av NSCLC H520 Cells
for å teste om Shh utskilt av H520 plateepitel celler var bioaktive, lunge fibroblaster ble behandlet med H520 supernatant. Dette resulterte i økning i Gli1 og Ptch1 mRNA-nivåer i mus nyfødt (figur 5A) og i voksne humane lungefibroblaster (figur 5B). For å vurdere om denne responsen ble mediert av Shh utskilt av H520-celler og som er tilstede i supernatanten, ble siRNA av Shh utført i H520-celler. Det viktigste er redusert Shh mRNA-mengder og nærvær av N-Shh i supernatanten (figur 5C), og dessuten reduseres med 90% nivåene av Gli1 og ved 50% nivåene av Ptch1 i fibroblaster behandlet med H520 supernatant (figur 5D) .
. Lungefibroblaster var serum-sultet i 24 timer og deretter behandlet eller ikke med supernatanten av H520-celler for 24, 48 eller 72 timer. (A) RT-qPCR ble utført for å analysere Gli1, Gli2, Gli3 og Ptch1 mRNA nivåer i CCL206 behandlet med H520 supernatant. Resultatene er presentert som fold av RNA-nivåer i behandlede celler sammenlignet med ikke-behandlede celler for hvert tidspunkt. ** P 0,05; *** P 0,01. (B) Primære humane fibroblaster fra lunge-skvamøs karsinom var serum-sultet i 24 timer og ble behandlet eller ikke med H520 supernatant i de angitte tidsrom. RT-qPCR ble utført for å vurdere Gli1, Gli2, Gli3 og Ptch1 mRNA nivåer. Resultatene er presentert som fold av mRNA-nivåer i behandlede celler sammenlignet med ikke-behandlede celler for hvert tidspunkt. * P 0,1, ** p 0,05. (C) Den knockdown av Shh ble utført i H520-celler med siRNA. Effektiviteten av Shh knockdown i H520-celler ble bekreftet ved western blot realisert med supernatanten av H520-celler transfektert med negativ kontroll siRNA (NC) eller med den siRNA av Shh. (D) CCL206 fibroblaster ble behandlet i 24, 48 og 72 timer med supernatanten av enten H520-celler transfektert med en negativ kontroll siRNA eller med supernatanten av H520-celler transfektert med den siRNA av Shh. RT-qPCR ble utført for å evaluere endringer i Gli1, Gli2, Gli3 og Ptch1 mRNA nivåer. Resultatene er presentert som fold av mRNA-nivåer (2
∧∧Ct) i CCL206 celler behandlet med supernatanten av H520 transfektert med siRNA av Shh sammenlignet med fibroblaster behandlet med supernatanten av H520 transfektert med den negative kontroll siRNA. * P 0,1; ** P 0,05; *** P. 0,01
Shh Pathway Forbedrer Lung fibroblast spredning, Invasion og Collagen Nedfall
Vi har vist her at NSCLC cellene ikke markert svare på eksogene Shh men kan utsondre bioaktive Shh som induserer aktivering av Hedgehog signalisering i lunge fibroblaster. Disse resultatene viser at Shh spiller en viktig rolle som formidler kreft epitel-stromal crosstalk i NSCLC. I denne innstillingen, har vi undersøkt mulige biologiske effekter av Shh aktivering i lunge fibroblaster. Vi har fokusert på ulike aspekter av relevans i en kreft sammenheng som spredning, migrasjon, invasjon og ekstracellulære matrise ombygging. Mens rekombinant Shh øket celleoverlevelse og celleproliferasjon av lungefibroblaster (figurene 6A-C), redusert cyclopamine det (fig 6D-F). Denne effekten synes å være spesielt på grunn av inhibering av pinnsvin reaksjonsvei som cyclopamine behandling korrelert med en reduksjon i Gli1 og Ptch1 ekspresjon i CCL206 fibroblaster (fig S7A). Interessant, H520 supernatant også forbedret fibroblast celle lunge proliferasjon (figur S7b-D). Som fibroblaster har vist seg å være viktig i å tilrettelegge kreft migrasjon og invasjon, gikk vi på å undersøke virkningen av Shh i disse prosessene. Fibroblaster ble behandlet med enten Shh eller med cyclopamine, og deres migrering ble registrert opptil 72 timer etter behandling. Mens Shh økt avstanden til migrasjon av fibroblaster, cyclopamine betydelig redusert det (figur 7A). For å undersøke om Shh kunne påvirke fibroblast migrasjon etter en skade stimulus som kan bedre representere de endringer som skjer i tumorvevet, utførte vi sårheling analyser. I ikke-behandlede celler, fibroblast migrert inn i sårområdet på en progressiv måte, noe som resulterer i sårheling etter 30 timer. I Shh-behandlede celler, denne prosessen var raskere og førte til sårheling etter 26 timer (figurene 7B og C). Tvert imot, redusert cyclopamine fibroblast migrering inn i sårområdet, og førte ikke til sårheling (figurene 7B og C). Vi ønsket å undersøke om Shh kan påvirke fibroblast invasjon. For dette har vi brukt transwells belagt med kollagen som etterligner bedre den ekstracellulære matriks og således sammenheng vevet. Celler ble lastet på toppen av transwell og medium med Shh eller cyclopamine ble plassert i bunnen, slik at dannelsen av en gradient. Antall celler transmigrating øket i nærvær av Shh mens cyclopamine redusert fibroblast invasjon gjennom kollagenbelagt membran (figur 7D). Mens Shh signale regulerer lunge fibroblast migrasjon og invasjon, ble noen effekt funnet for enten Shh eller cyclopamine i fibroblast heft analyser (data ikke vist). Fordi uorden og endringer i arkitekturen av svulsten mikromiljøet er viktige kjennetegn på kreft, har vi undersøkt om aktivering av Hysj veien i lunge fibroblaster kan være assosiert med ekstracellulære matrise ombygging. Eksogene Shh økt uttrykk av matrisen metallopeptidase MMP9 (figur 7E), et proteolytisk enzym som spiller en nøkkelrolle i kreft progresjon. Interessant, Shh behandling økte også syntesen av kollagen i den ekstracellulære matriks dannet av fibroblast (figur 7F). Til sammen indikerer disse resultatene at Shh fremkalle en reaksjon i lungefibroblaster som kan være korrelert med migrasjon, invasjon og ekstracellulær matriks ombygging.
spredning av CCL206 lungefibroblaster ble bestemt ved celletelling (A, D) og celleoverlevelse
