Abstract
Bakgrunn
peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor delta (PPARD) er kjerne hormonreseptor involvert i tykk- og endetarmskreft ( CRC) differensiering og progresjon. Hensikten med denne studien var å fastslå utbredelsen og spekteret av varianter i
PPARD
genet i CRC, og deres bidrag til clinicopathological endepunkter.
Metoder og funn
Direkte sekvense av
PPARD
genet ble utført i 303 primære svulster i blodprøver fra 50 pasienter med ≥3 berørte førstegradsslektninger, 50 pasienter med to berørte førstegradsslektninger, 50 sporadiske pasienter, 360 friske kontroller, og i 6 tykktarmskreft cellelinjer. Mutasjon Analysen avdekket 22 forskjellige transversions, 7 av dem var romanen. Tre av alle varianter ble somatisk (c.548A G, p.Y183C, c.425-9C T, og c.628-16G A). To missense mutasjoner (p.Y183C og p.R258Q) var patogene bruker
i silico
prediktiv program. Fem tilbakevendende varianter ble påvist i /ved siden av eksoner 4 (c.1-87T C, c.1-67G A, c.130 + 3G A, og c.1-101-8C T) og exon 7 (c.489T C). Variant c.489C /C påvist i svulstene var korrelert til verre differensiering (
P
= 0,0397).
Konklusjoner
Vi fant 7 roman varianter blant 22 arvet eller ervervet
PPARD
varianter. Somatiske og /eller missense varianter oppdages i CRC pasienter er sjelden, men indikerer den kliniske betydningen av
PPARD
genet
Citation. Ticha jeg, Gnosa S, Lindblom A, Liu T, Sun XF (2013) Varianter av
PPARD
Gene og deres Clinicopathological betydning i tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (12): e83952. doi: 10,1371 /journal.pone.0083952
Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan
mottatt: 17 september 2013; Godkjent: 10 november 2013; Publisert: 31.12.2013
Copyright: © 2013 Ticha et al. . Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Grant Support : Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra svenske Cancer Foundation, Vetenskapsrådet, og ved helse Forskningsrådet i Sør-Øst-Sverige. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Worldwide, diagnostisering av tykk- og endetarmskreft (CRC) rangerer andre i hunner og tredje hos menn, og er den fjerde vanligste årsaken til kreftdødelighet. Videre er forekomsten av CRC på vei oppover [1]. Patogenesen av CRC er kompleks og fremdeles ikke fullt ut forstått. CRC er antatt å være en flertrinnsprosess som impliserer en opphopning av genomiske avvik, svikt av apoptose, og forandringer av flere signalveier [2]. En fersk studie fra svenske familier berørt av CRC viser signifikant effekt av genetisk bakgrunn av familiær CRC pasienter [3]. De gener som er involvert i initiering og progresjon av CRC er begrenset. Low-penetrant gener kan spille en viktig rolle i kolorektal tumorigenesis og trenger å bli identifisert.
I løpet av det siste tiåret, har stor oppmerksomhet blitt gitt til etterforskningen av den rollen peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor delta (PPARD) i CRC [4]. Tidligere Sun forskningsgruppe utførte mRNA og protein analyser i CRC vev og cellelinjer, som foreslo en hemmende rolle PPARD i kolorektal tumorigenesis [5] – [8]. Harman
et al
. [9] har også gitt sterke bevis for at PPARD demper tykktarmskreftutvikling, ved hjelp av genmodifiserte mus modeller. Nærmere bestemt, fremmer PPARD differensiering og undertrykker celleproliferasjon, som også er understøttet av andre [10]. Videre Sun og medarbeidere fant en sammenheng mellom høyere uttrykk av PPARD og gunstig overlevelse i endetarmskreftpasienter [6].
Dette ligand-aktiverte transkripsjonsfaktor tilhører atom hormonreseptor super, og er kodet av genet
PPARD plakater (MIM # 600409) som har ni eksoner, fem av disse er koding, og strekker seg over rundt 85 kb på kromosom 6p21.2 [11]. PPARD kan aktiveres av fettsyrer og deres derivater, og dens ekspresjon er relativt høy i mage-tarmkanalen sammenlignet med annet vev [12]. PPARD har vist seg å være involvert i regulering av lipid- og glukosemetabolisme og relaterte lidelser [13] – [15], og er ansett som en lovende legemiddel mål for behandling av metabolsk syndrom sykdommer [16]
Til tross for. den gryende enighet om at PPARD er en sentral aktør i CRC, avvikende funn komplisere den spesifikke rolle i tumorigenesis. Enten PPARD har en fremme eller hemme rolle i kolorektal kreftutvikling er fortsatt under debatt [17], [18]. Genetiske varianter i
PPARD
genet kan være ansvarlig for disse kontroversielle funn og hittil rollen
PPARD
varianter i CRC er ikke undersøkt. Bare noen få studier undersøkt sammenhengen mellom polymorfismer i
PPARD
genet og funksjoner i lipid og karbohydrat metabolismen [19], [20]. Koding eksoner 4-9 av
PPARD
genet ble sekvensert i den store menneskelige genom analyse av bryst- og tykktarmskreft [21], [22]. Men
PPARD
ble ikke validert som kandidat kreft genet i disse analysene. Variant c.489T C (rs2076167) var vedlagt i et søk etter kandidatlene mottakelige for CRC, men ingen sammenheng med risiko for CRC ble funnet [23]
PPARD har vist seg å være involvert i CRC utvikling. av vår gruppe og andre. Likevel, betydningen av
PPARD
genomisk endringer i CRC har ikke vært fullt opp. Målene for denne undersøkelsen var (
i
) for å bestemme frekvens og spekteret av varianter i
PPARD
genet i fire forskjellige årskull av CRC pasienter inkludert 303 vevsprøver fra CRC, og 150 blodprøver fra: 50 sporadiske CRC pasienter, 50 pasienter med to berørte førstegradsslektninger, og 50 arvelige pasienter med ≥3 påvirket førstegradsslektninger, og (
ii
) for å vurdere potensielle forholdet mellom varianter med clinicopathological variabler. Seks menneskelige tykktarmskreft cellelinjer, som vanligvis brukes som
in vivo
tykktarmskreft modeller i Sun laboratorium og av andre, ble inkludert i denne studien.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Denne studien ble godkjent av etiske komiteer av Universitetet i Linköping, Sverige og Karolinska Institutet, Sverige.
pasienter og friske kontroller
Denne studien inkluderte primær CRC vev, og, når det er tilgjengelig, fjernt normal slimhinne fra bærere av
PPARD
variant fra 303 pasienter (gruppe i) diagnostisert ved universitetssykehusene i Linköping og Vrinnevi-sykehuset i Norrköping. Vev ble samlet inn under primærkirurgi mellom 1989 og 2004, og lagret -70 ° C. Blodprøver var ikke tilgjengelig for dette kullet. Videre blodprøver fra ubeslektede CRC pasienter: 50 sporadiske CRC pasienter (gruppe II), 50 pasienter med to berørte førstegradsslektninger (gruppe III), 50 arvelige pasienter med 3 eller flere berørte førstegradsslektninger (gruppe IV), og 360 ikke-kreft-kontroller, ble undersøkt. Blodprøvene (gruppe II-III) ble oppnådd mellom 2004 og 2009 fra 14 forskjellige sykehus i midten Sverige. For å estimere befolkningen hyppigheten av
PPARD
varianter, kontrollerer ikke-kreft gruppen, som består av blodgivere rekruttert i løpet av året 2010 fra Uppsala-regionen i Sverige, ble brukt. Begge sakene og kontroller var av europeisk herkomst og fra Sverige. Skriftlig informert samtykke fra donor eller pårørende ble innhentet for bruk av sine prøver til forskningsformål. Karakteristikker av pasienter og kontroller, er vist i tabell 1. tumorer med bedre differensiering inkludert brønn og moderat differensierte tumorer, og verre differensiering inkludert dårlig differensiert, mucinous eller signet-ring-celler carcinoma. Tumor differensiering data kan ikke oppnås for grupper II til IV.
Cellelinjer
Mutasjon analyse ble utført også i 6 brukte tykktarm kreft cellelinjer. De SW480 og SW620-cellelinjer ble erholdt fra American Type Culture Collection. SW480-cellelinjen ble etablert fra en primær kolon adenokarsinom, og SW620 fra en lymfeknutemetastase, tatt fra samme pasient ett år senere [24], [25]. Den KM12C, KM12SM og KM12L4a cellelinjer ble vennlig levert av Prof. I.J. Fidler (M.D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas) [26], [27]. Den KM12C er avledet fra en pasient med stadium II tykktarmskreft. Den KM12SM er en spontan levermetastaser oppstått fra injeksjonen av KM12C inn i cecum av nakne mus. KM12L4a, en eksperimentell levermetastaser, er fremstilt ved gjentatt intra-milt injeksjon og høsting av levermetastaser i nakne mus. Den tykktarmskreft cellelinje HCT-116 var en slags gave fra professor B Vogel (Kjernen celle sentrum, Johns Hopkins University, Baltimore, MD) [28], [29]. De cellelinjer SW480, SW620, KM12C, KM12SM, og KM12L4a ble dyrket i Eagles minimale essensielle medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), og cellelinjen HCT-116 i McCoys5A (Sigma Aldrich) supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum albumin (GIBCO, Invitrogen, Paisley, UK), 0,5% L-glutamin (GIBCO), 1% av et penicillin og streptomycin cocktail (GIBCO) ved 37 ° C og 5% CO
2 i fuktet inkubator. For KM12-celler 2% vitamin-oppløsning (GIBCO) ble tilsatt. Cellene ble høstet ved 80% konfluens.
isolering av nukleinsyrer fra vev, blod og cellelinjer
DNA ble isolert fra friskt frosset tumorvevet, cellelinjer og hele perifert blod ved bruk av standard fremgangsmåter implementere Wizard genomisk DNA Purification System (Promega, Madison, WI) eller DNeasy Blood Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Total RNA fra bestemte vevsprøver og dyrkede celler ble isolert ved hjelp RNeasy Mini Kit (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner.
Mutasjon analyse
kodende område av
PPARD
gen ble screenet ved PCR og direkte DNA Sanger-sekvensering i 203 svulster, 150 blodprøver av CRC-pasienter (gruppe II-IV), og 6 cellelinjer. På grunn av tids- og kostnadseffektiviteten, ble ytterligere 100 tumorprøver, så vel som kontroller vist i to mest hyppig endrede områder som strekker seg over exon 4 og 7. Adenin av translasjons-initierings-kodonet er 102 base av exon 4. Derfor eksonene 4 til 9 og tilstøtende intronic sekvenser av
PPARD
genet ble forsterket ved hjelp av Faststart High Fidelity PCR System (Roche Applied Science, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. BigDye Terminator
v
3.1 Ready Reaction Mix (Applied Biosystems, Foster City) ble benyttet for sekvense reaksjon og separasjon ble utført på ABI 3500 genetisk analysator (Applied Biosystems). De innsamlede data ble analysert ved hjelp av sekvens analysator programvare (Applied Biosystems). Utformet primerne anvendt for amplifikasjon og sekvensering analyse er vist i tabell S1. Hver mutasjon eller mistenkelige fragmenter ble bekreftet av en annen uavhengig PCR forsterkning og sekvensanalyse.
revers transkriptase-PCR analyse ved hjelp av High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) ble utført i henhold til produsentens instruksjoner i 3 tilfeller bærer varianter c.130 + 3G A og c.1-101-8C T med tilgjengelige RNA fra tilsvarende svulst og normalt vev. Et 856 bp cDNA-fragmentet avgrenset av primerne RP_01 /02F 5′-CAGTGTTGTACAGTGTTTTG-3 «krysset forbindelsen mellom eksoner 1 og 2, og PRD_08R 5′-TCTGCCTGCCACAATGTCTC-3» ligger i ekson 8 ble PCR-amplifisert og direkte sekvensert (Fig. 1) . Det samme cDNA fragmentet ble sekvensert i SW480, SW620, KM12C, KM12SM, og KM12L4a cellelinjer
Representant sekvensanalyse av cDNA isolert fra normal slimhinne fra transportør av varianter c.130 + 3G . A (intron 4) og c.1-101-8C T (intron 3) viser mangler av exon 4; wt – villtype-sekvensen, mut – mutert sekvens. Exon krysset er markert med
stiplet linje
. Exon tre var fraværende i både villtype og mutert allel.
Nomenklatur av mutasjoner
Mutasjoner ble beskrevet i henhold til nomenklaturen system anbefalt av Human Genome Variasjon Society (HGVs) [30 ]. Betegnelse av genomisk endringer i
PPARD
gen er basert på GenBank referansesekvenser NG_012345.1 og NM_001171818.1. Mutasjoner som ikke ble funnet i litteraturen, den enkeltnukleotidpolymorfi Database (dbSNP, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/, vist 8. august 2013) [31], eller i Katalog somatiske mutasjoner i Cancer (COSMIC, https://www.sanger.ac.uk/cosmic, tilgang på 8 august 2013 [32], ble ansett som roman. det er inkonsekvens i beskrivelsen av variantene c.1-87C T (rs2016520) i 5′-utranslatert region (UTR) av ekson 4, og er synonymt substitusjon c.489C T (rs2076167; p.N163) i exon 7. i henhold til GenBank referansesekvensen (NCBI) i villtype-allelet er C, men ifølge den genotyping i kontrollgruppen (tabell 2) C-allelet er mindre for begge variantene. det er i overensstemmelse med to andre studier som er utført genotyping å inkludere disse to polymorfismer i større kullene [15], [19] . Av notatet, Skogsberg
et al product: [15] heter variant c.1-87T .. C som + 294T /C herved nevne vi disse variantene c.1-87T C og c.489T C.
i silikoaluminofosfater
Tips Verktøy for å vurdere effekten av Detected missense varianter
for vurdering av funksjonell betydning oppdages missense variantene vi ansatt flere utbredt
i silikoaluminofosfater
prediksjon programmer. Disse programmene foreslå mulig interferens med biologisk funksjon og stabilitet av protein: sile som en del av kommersiell Alamut 2,0 program (Interactive Biosoftware, Roven, Frankrike), PolyPhen-2 (https://genetics.bwh.harvard.edu/pph2 /), PROVEAN (https://provean.jcvi.org/index.php), Align GVGD (https://agvgd.iarc.fr), Mutation forsmak (https://www.mutationtaster.org), MUpro ( https://mupro.proteomics.ics.uci.edu).
Statistiske analyser
Analyser ble utført ved hjelp av STATISTICA 10 (SatSoft, Tulsa, Oklahoma). Chi-kvadrat test ble brukt for å bestemme forholdet mellom tilbakevendende
PPARD
varianter og clinicopathological variabler, for å vurdere forskjellene i forandringer frekvenser mellom gruppene II-IV og kontroller, og for å teste distribusjon av genotyper i kontroller for en avgang fra Hardy-Weinberg likevekt. Cox Proporsjonal Hazard modell ble brukt til å teste forholdet mellom PPARD varianter og pasienten overlevelse, og Kaplan-Meier metoden ble brukt for overlevelseskurver. Alle testene var tosidig, og en
P
-verdi mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Varianter av
PPARD
Gene i CRC pasienter, friske kontroller, og cellelinjer
Direkte DNA sekvensanalyse av
PPARD
genet viser 22 forskjellige single nucleotide varianter, av de fem var tilbakevendende og 7 var nye varianter (Tabell 2 og 3). Hyppigheten av fem vendende
PPARD
varianter i ulike CRC pasient kohorter, friske kontroller, og cellelinjer er vist i tabell 2. Genotypiske utdeling av arvelige tilbakevendende single nucleotide varianter var i samsvar med Hardy-Weinberg likevekt (data ikke vist ). Alle oppdaget varianter var overganger (4 missense, 3 stille, og 15 ikke-kodende varianter). For å evaluere de antatte effektene av missense varianter på protein funksjon, seks
i silikoaluminofosfater
prediksjon verktøy ble brukt. Faktisk ble somatisk mutasjon p.Y183C, og mutasjon p.R258Q kategorisert som skadelig (tabell 4).
Regelmessig
PPARD
Variant i forhold til Clinicopathological variabler
Foreningen for tilbakevendende varianter med clinicopathological egenskaper, herunder kjønn, alder, tumor plassering, scene og differensiering, ble undersøkt. Variant c.489C /C var signifikant relatert til verre differensiering i forhold til T /C og T /T genotyper (
P
= 0,0397, tabell 5). De clinicopathological data for pasienter med påvist variant c.489C /C er vist i tabell S3.
Det var ingen signifikant sammenheng med tilbakevendende
PPARD
varianter med andre clinicopathological variabler som kjønn , alder, tumor plassering og scene. (
P
0,05, data ikke vist)
Karakterisering av Vendende
PPARD
Varianter
totalt 196 varianter i 106 (35%) av pasientene ut av gruppe i, 28 varianter i 17 (34%) pasienter av gruppen II, 45 varianter i 22 (44%) av pasientene ut av gruppe III, og 22 varianter i 11 (22% ) pasienter av gruppen IV ble oppdaget. Fem germline vendende forandringer (tabell 2), fire plassert i eller tilstøtende til exon 4 (c.1-87T C, c.1-67G A, og felles varianter c.130 + 3G A og c.1-101 8C T) og en i ekson 7 (c.489T C) sto for storparten av alle identifiserte varianter, og ofte oppsto sammen uten et strengt mønster av variant kombinasjon. Flertall av bærere av minst en mindre C-allel i posisjonen c.1-87 ved 5′-UTR var også bærere av minst en mindre C-allel i posisjonen c.489. Bærere av varianten c.1-67G A på 5′-UTR av exon 4 gjennomføres også en annen variant, enten c.489T /C eller c.489C /C, med unntak av ett tilfelle (gruppe II) med varianter c. 1-101-8C T og c.130 + 3G A. Kimlinje intronic varianter c.1-101-8C T og c.130 + 3G A, som ligger åtte basepar oppstrøms og 3 basepar nedstrøms fra ekson 4, henholdsvis, alltid forekom sammen. Alle pasienter og kontroller med disse variantene var bærere av heterozygot variant c.489T /C, bortsett fra to pasienter (gruppe II) – en som bar variantene c.489C /C og c.1-67G /A, og en bærer av variant c .1-67G /A.
Mutasjon analyser i blodprøver viste at mengden av pasientene bærer arve endringer var lavere i gruppen IV sammenligne med gruppe II og III kombinert (
P
= 0,037 ), mens ingen forskjell ble observert mellom gruppe II og III (
P
= 0,305; tabell 2). Hyppigheten av tilbakevendende varianter i eksoner 4 og 7 var ikke signifikant forskjellig mellom kontroll befolkning og undergrupper II, III eller IV, med unntak av felles varianter c.1-101-8C T og c.130 + 3G A, som ble funnet i 10% av pasientene i gruppe III sammenlignet med 2,5% i kontrollgruppen (
P
= 0,003; tabell 2).
Joint varianter c.1-101-8C T og c.130 + 3G A er i nærheten av konsensus spleiseseter og har potensial til å endre posttranskripsjonelt spleising. For å evaluere effekten av disse variantene, ble RNA fra tumor og normalt vev av 3 berørte enkeltpersoner og upåvirket kontroll trukket ut og revers transkripsjon ble utført. Sekvensanalyse av PCR-fragmentet, som omfatter regionen fra enden av ekson 1 til ekson 8 av cDNA, viste hoppe av exon 4 (fig. 1). Alle analyserte prøvene ble mangler ekson 3. Sekvenseringen av det samme cDNA-fragmentet i cellelinjer også åpenbart mangler av ekson 3 (data ikke vist). Fem kjente alternative varianter av transkript PPARD er blitt beskrevet (https://www.ncbi.nlm.nih.gov, Gene ID: 5467), og bare en av disse variantene inneholder ekson 3 i mRNA sekvens. Alternative transkripsjon nummer 4 med fravær av exon 3 og 4 har alternative startkodon i exon 2 og uttrykke protein isoform 3, som skiller seg i N-enden på grunn av mangler en del av 5′-kodende sekvens. Andre transkripsjon varianter har startkodon i exon 4.
Analyse i tilfeldige 20 parede prøver (prøvene som var heterozygoter eller homozygoter av muterte varianten i det minste en av de polymorfe områdene c.1-87 eller c.489) avslørte lik heterozygositet i polymorfe områder c.1-87T /C og c.489T /C i 4 normalt vev, mens i matchet svulst DNA-prøver forskjellig andel av begge alleler ble observert flere ganger (figur 2).
N – normalt vev, T – svulstvev; # 516 er eksempel på sekvensanalyse med samme mønster i normal og svulstvev.
Karakterisering av Novel og /eller somatiske
PPARD
Varianter
Sju nye varianter ble påvist i pasienter, kontroller og /eller i cellelinjer (tabell 3). Av disse tre variantene var missense og 6 ligger i introner. En av disse nye intronic variantene var somatiske, en ble funnet i kontrollgruppen, og en i HCT-116-cellelinjen. Alle disse variantene var heterozygote og detektert bare en gang. Foruten nye varianter, ble ytterligere 2 sporadisk og 8 sjeldne varianter oppdaget. Kjennetegn på pasienter med påvist sjelden variant er rapportert i tabell S2
Interessant, to av tre oppdagede somatiske varianter, c.425-9C . T (syv basepar fra 3 «konsensus spleisesete) og c .548A G (i exon 7, som fører til endring av sterkt konservert aminosyren tyrosin til cystein ved kodon 183, og forekom sammen med ledd varianter c.1-101-8C T og c.130 + 3G A) ble påvist verken i to andre DNA-prøver hentet fra romlig ulike deler av tumor eller i tilsvarende normal slimhinne
missense mutasjon c.773G . A (p.R258Q) i ekson 8 ble oppdaget i SW480 ( cellelinje avledet fra kolon adenokarsinom), men ikke i SW620-celler (cellelinje avledet fra lymfeknutemetastase). Denne varianten forekommer i et ligandbindende domene og fører til endring av sterkt konservert aminosyre arginin til glutamin
Både missense varianter c.548A . G (p.Y183C) og c.773G A (s. R258Q) ble foreslått til å være sykdomsfremkallende ved hjelp av
i silico
prediktive programmer (Tabell 4).
Diskusjoner
Denne studien viser for første gang sekvensanalyse av
PPARD
genet i ulike grupper av CRC pasienter, friske kontroller, og tykktarmskreft cellelinje-modeller. Vi oppdaget fem gjennomgående og 17 sjeldne varianter, hvorav 7 ble rapportert for første gang i denne studien. To eller flere
PPARD
varianter, for det meste tilbakevendende endringer, skjedde sammen i flertallet av pasienter med påvist variant. To av fire som oppdages missense varianter (p.Y183C og p.R258Q) ble klassifisert av
i silikoaluminofosfater
prediksjon programmer som sannsynlig patogene.
Enda mer interessant, analyserer i en kohort av 303 CRC pasienter (gruppe i) viste at bærere av tilbakevendende variant c.489C /C hadde dårligere differensiert tumor sammenlignet med c.489C /T og c.489T /T. Det er imidlertid ikke klart om denne varianten driver utvikling av svulst, eller om det bare er en passasjer mutasjon uten direkte effekt på helsa av kreftceller.
Det er blitt foreslått at kreft i proksimale og distale tykktarmen kan være to forskjellige krefttyper med forskjellig genetisk og miljømessig risikofaktorer, og det ble beskrevet genetiske forskjeller mellom kreftformer som oppstår i den proksimale og den distale colon [33]. Likevel, vi viste ikke signifikante forskjeller i fordelingen av endringer mellom kolon og endetarms karsinom, verken mellom venstre og høyre ensidige svulster.
Videre tre somatiske
PPARD
varianter, c.425-9C T, c.548A G (p.Y183C), og c.628-16G A, ble påvist i tre sporadiske colontumorer (gruppe i). Vi observerte en heterogen somatisk variant som ikke var synlig i hver sekvensert svulst del. Varianten c.548A G har blitt annonsert i den kosmiske database av somatiske mutasjoner i en pasient påvirket av plateepitelkarsinom [32]. Oppdatert, inneholder den kosmiske 40 forskjellige
PPARD
somatiske varianter, spredt i hele genet, oppdaget i 43 unike pasienter. Av disse ble 3 tause og 7 missense varianter funnet i 10 mucinkjertler tykktarm adenokarsinomer, og en missense variant i endetarmstumorprøve. Somatiske
PPARD
varianter ble også beskrevet i lunge, bryst, eggstokk, endometria, lever, og prostata svulst, og neuroblastom. Tilstedeværelsen av somatiske varianter i CRC svulster støtter relevansen av
PPARD
i CRC tumorigenesis.
Screening i pasientblodprøver viste samme frekvens av de tilbakevendende variantene som ligger i, eller i tilknytning til, eksoner 4 eller 7, blant pasientgrupper II, III og IV sammenlignet med kontrollgruppen, med unntak av en høyere forekomst av felles varianter c.1-101-8C T og c.130 + 3G A i gruppe III. Interessant, observerte vi den høyeste frekvensen av germline varianter i den lave risikoen pasientpopulasjon med to berørte førstegradsslektninger (gruppe III), mens den laveste frekvensen ble observert i høyrisikogruppen for arvelige CRC pasienter (gruppe IV). Imidlertid er enhver vesentlig tolkning av dataene begrenset av små prøvesett og med lite, selv om statistisk signifikante forskjeller. Ytterligere analyser av større serie av pasienter er ønskelig for nøyaktige komparative analyser
Vi fant romanen missense mutasjon c.773G . A (p.R258Q) i primærtykktarmskreft cellelinje SW480 og ikke i lymfeknute metastatisk celle linjen SW620. En unik funksjon i SW480 og SW620 cellelinjer er at de er avledet fra primære og sekundære svulster resected fra samme pasient. En annen variant, c.1078 + 22G A, er til stede bare i primær tumorcellelinjer utvunnet KM12C men ikke i de eksperimentelle metastatisk cellelinjer KM12SM og KM12L4a. Tydelig mutasjonsstatus i primærtumorcellelinjer og metastatisk cellelinjer, samt påvisning av somatiske varianter bare i en del av svulsten (c.425-9C T og c.548A G) er i samsvar med modellen av klonal utviklingen av kreft og intratumor genetisk heterogen [34], [35]. Romlig fordeling av subkloner med ulike genomiske avvik innenfor tumor og metastase ble beskrevet nylig [36]. Forekomsten av
kan PPARD
mutasjon i primære cellelinjer, men ikke i metastatisk cellelinje skal også forklares ved sletting i
PPARD
loci under tumor og metastasedannelse. Videre har DNA-sekvensanalyse på de samsvarende prøver (gruppe I) viste i flere tilfeller forskjellig andel av alleler i to polymorfe områder, som ligger i ekson 4 og 7, sammenlignet med tumor normalt vev. Tatt i betraktning det faktum at
PPARD
genet ligger i den menneskelige leukocytt antigen (HLA) komplekset på kromosom region 6p, som ofte påvirket av slettinger og rearrangements i kreft hos mennesker [37], [38], vår observasjons kan foreslå tap av heterozygositet i
PPARD
loci i tumorcelle subkloner under svulst utvikling.
av notatet, aller fleste påviste endringer er transcriptionally tause, enten ligger i 5’eller 3 « -UTRs eller i introner. Flere linjer av bevis tyder på at noen nukleotid variant (intronic, tull, missense, synonymt) kan anses som potensielt skadelig fordi det kan endre normal pre-mRNA spleising
via
endringer i konsensus spleisesekvenser, opprettelse av nye kryptiske sekvenser, affeksjon av translasjonsforskning hastighet, eller endringer av mRNA eller protein stabilitet [39] – [41]. Slike tidligere forsømte varianter kan være utsatt for arvelige sykdommer. Dessverre, i vår undersøkelse var det umulig å teste alle varianter på mRNA-nivå på grunn av mangel av spesielle vev eller blodprøver for RNA-isolering. Likevel sekvensanalyse av cDNA i bærere av arvelig felles varianter c.130 + 3G A og c.1-101-8C T avslørte hoppe av exon 4, som kan føre til omregning av PPARD isoformen med endret N-terminalen protein sammenlignet med villtype form.
PPARD
varianter på 5′-UTR kan være av spesiell interesse, på grunn av en hypotese regulerende rolle av mRNA uttrykk. Men i kohort av 303 CRC pasienter, vi fant ikke en sammenheng mellom tilbakevendende varianter i 5′-UTR (c.1-87C T og c.1-67G A). Og clinicopathological variabler
Vi ønsker å styrke betydningen av karakteriseringen av den genetiske bakgrunn av cellelinjene som ble brukt som modellsystemer. For eksempel, to laboratorier viste at PPARD protein ekspresjon var avhengig av APC /
beta
-catenin pathway [42], [43]. Deres konklusjon var basert på observasjon at relative uttrykk for PPARD var enten lik eller lavere i SW480 celler som har en mutant
APC
genet og en villtype
beta
-catenin genet. I denne studien oppdaget vi missense
PPARD
mutasjon (p.R258Q) i SW480 celler som kan påvirke tolkningen av disse resultatene og viser begrenset bruk av SW480 cellelinje for
in vivo
studier . Videre omfattende analyse av
PPARD
genet kan være nyttig i drug design, siden PPARD gir et attraktivt mål for terapeutisk intervensjon så langt i pasienter med metabolsk syndrom [16].
I konklusjonen, vi identifisert 22
PPARD
varianter, selv om potensielt funksjonelle varianter oppdaget i
PPARD
genet er sjeldne. Synonymt variant c.489T C (p.N163N; rs2076167) kunne være av klinisk interesse om sin tilknytning til verre differensiert CRC. Til syvende og sist, vil fremtidige studier i en selvstendig klinisk prøve serien bidra til å avgjøre om noen av de
PPARD
varianter er mulige modifiserings av CRC følsomhet eller prognose.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1. .
Primere som brukes til PCR forsterkning og sekvensanalyse
doi: 10,1371 /journal.pone.0083952.s001 plakater (docx)
Tabell S2.
Sjeldne
PPARD
varianter i forhold til de clinicopathological egenskaper
doi:. 10,1371 /journal.pone.0083952.s002 plakater (docx)
tabell S3.
Homozygotic variant c.489C i forhold til clinicopathological egenskaper
doi:. 10,1371 /journal.pone.0083952.s003 plakater (docx)
Takk
Vi takker til klinikere og pasienter for deres samarbeid. De spesielle takk tilhører Dr. Gunnar Arbman (Kirurgisk avdeling i Östergötland, Norrköping, Sverige) for å samle inn prøver og data, Assoc. Prof. Zdenek Kleibl MD, Ph.D (Institutt for biokjemi og eksperimentell onkologi, Charles University i Praha, Tsjekkia) for de kritiske diskusjonene, Brandon R. Macias Ph.D (UCSD Medical Center, University of California, San Diego, CA ) og Veronika Patcha Brodin Ph.D (Division of Oncology, Institutt for klinisk og eksperimentell medisin, det helsevitenskapelige fakultet, County Council of Östergötland, Universitetet i Linköping, Linköping, Sverige) for korrekturlesing av manuskriptet, og Birgitta Holmlund (Department for klinisk og eksperimentell medisin, Universitetet i Linköping, Linköping, Sverige) for utmerket teknisk assistanse under DNA.
