Abstract
Bakgrunn
Aktivering somatiske mutasjoner i
epidermal vekstfaktor reseptor product: (
EGFR
) konferere unike biologiske egenskaper til ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler, men transkripsjonsmediatorer av EGFR i denne undergruppen av NSCLC er ikke fullstendig klarlagt.
metodikk /Principal funn
Her brukte vi genetiske og farmakologiske tilnærminger for å belyse transcriptomes av NSCLC cellelinjer. Vi transkripsjonelt profilert et panel av
EGFR
-mutant og -wild-type NSCLC cellelinjer dyrket i nærvær eller fravær av en EGFR-tyrosinkinase-inhibitor. Hierarkisk analyse viste at cellelinjene segregert på basis av
EGFR
mutasjonsstatus (mutant versus villtype), og uttrykk signaturer ble identifisert ved analyse overvåket som skilte cellelinjene basert på mutasjonsstatus (villtype versus mutant) og type mutasjon (L858R versus Δ746-750). Ved hjelp av en
EGFR
mutasjonsspesifikke uttrykk signatur som en sonde, utvunnet vi genuttrykk profiler av to uavhengige kohorter av NSCLC pasienter og fant signaturen i en undergruppe. EGFR tyrosinkinasehemmer behandling regulert uttrykket av flere gener, og farmakologisk hemming av proteinprodukter av to av dem (
PTGS2 Hotell og
EphA2
) hemmet forankringsuavhengig vekst i
EGFR
-mutant NSCLC celler.
Konklusjon /Betydning
Vi har belyst gener ikke tidligere knyttet til
EGFR
-mutant NSCLC, hvorav to forbedret clonogenicity av disse -celler, som skiller disse mediatorer fra andre tidligere vist å opprettholde celleoverlevelse. Disse funnene har potensial klinisk relevans gitt tilgjengeligheten av farmakologiske verktøy for å hemme proteinprodukter av disse genene
Citation. Choi K, Creighton CJ, Stivers D, Fujimoto N, Kurie JM (2007) Transkripsjonell Profilering av Non -Små Cell Lung Cancer Celler med Aktivering
EGFR
somatiske mutasjoner. PLoS ONE 2 (11): E1226. doi: 10,1371 /journal.pone.0001226
Academic Redaktør: Janet Kelso, Max Planck Institute for Evolutionary Anthropology, Tyskland
mottatt: 06.09.2007; Godkjent: 01.11.2007; Publisert: 21.11.2007
Copyright: © 2007 Choi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Institute gir P50 CA70907, P30 CA125123, og R01 CA117965
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Behandling med epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) tyrosinkinase-inhibitorer (TKI) fører til rask og vedvarende reduksjon av svulster i en undergruppe av pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [1] – [3]. Kreftceller i disse pasientene har somatiske mutasjoner i
EGFR
kinase domene som konstitutivt aktiverer EGFR [1] – [3]. De aktiverende mutasjoner identifisert hittil klynge i regionen som koder for kinasedomenet (eksoner 18-21), og er som oftest enten Δ746-750 delesjon eller L858R punktmutasjoner [1] – [3]. Musemodeller konstruert for å undersøke onkogenisitet av mutant
EGFR
utvikle invasiv lunge adenokarsinomer at regress etter behandling med EGFR TKI [4, 5]. Udødeliggjort menneskelige bronkial epitelceller skaffe maligne egenskaper etter transfeksjon med mutant
EGFR product: [6]. Behandling med EGFR TKI induserer apoptose av disse
EGFR
-transfected celler og NSCLC celler med somatiske mutasjoner i
EGFR product: [7, 8]. Dermed bevis fra menneske, mus, og cellulære modeller indikerer at mutant
EGFR
er onkogene og overfører avhengighet av EGFR for NSCLC celle overlevelse.
Styrken på mutant
EGFR
som et onkogen understøttes av bevis at dets biokjemiske egenskaper avviker sterkt fra de av villtype-EGFR. EGFR kinase domene blir konstitutivt aktivert av de somatiske mutasjoner, og viser forbedret binding og følsomhet til EGFR TKI [9] – [11].
EGFR
-mutant NSCLC-celler som vanligvis uttrykker høye nivåer av EGFR og dens dimer partnere ErbB2 og ErbB3 og flere ErbB-ligander, som alle forsterker EGFR-avhengig signalisering [8]. Flere signalveier er konstitutivt aktivert i disse cellene, noen som har vist seg å fremme celle overlevelse. For eksempel, danner EGFR et heterodimerisk kompleks med ErbB3, som binder seg til og aktiverer direkte fosfatidylinositol 3-kinase og opprettholder celleoverlevelse gjennom AKT-avhengige mekanismer [12]. Andre pro-overlevelse signaler formidles gjennom Src-familie kinaser, som er konstitutivt aktivert i
EGFR
-mutant NSCLC celler [13, 14].
I motsetning til de framskrittene som er gjort i belyse formidlere av celleoverlevelse, har mindre vært framgang i å forstå mekanismene som mutant
EGFR
overfører andre neoplastiske egenskaper, for eksempel muligheten til å migrere, invadere, sprer i en anker-uavhengig måte, og fremme angiogenese. Her søkte vi å identifisere de meklere etter avhør de transcriptomes av et panel av NSCLC cellelinjer som har vært preget av tilstedeværelsen av
EGFR
mutasjoner. Vi har funnet en transkripsjons profil
EGFR
-mutant NSCLC-celler som inneholdt gener som ikke tidligere har vært kjent for å være EGFR-avhengig. Selv om omfanget av cellulære funksjoner knyttet til disse genene er bred, er mange av dem knyttet sammen gjennom kjente eller antatte protein interaksjonsnettverk. I konklusjonen, transkripsjons profilen identifisert i
EGFR
-mutant NSCLC celler har informert oss om biologiske prosesser og potensielle terapeutiske mål som kan være effektive for pasienter med denne sykdommen.
Resultater
Transkripsjonell Analyse av NSCLC-cellelinjer
Vi brukte et panel på åtte NSCLC-cellelinjer (tabell 1) som hadde blitt karakterisert med hensyn til nærvær eller fravær av somatisk
EGFR
mutasjoner (fem cellelinjer med slike mutasjoner og tre uten) og
Ras
mutasjoner (to cellelinjer med slike mutasjoner og seks uten). Av de fem
EGFR
-mutant cellelinjer, tre hadde exon 19 delesjonsmutasjoner (Δ746-750) (HCC827, HCC2279, H4006), en hadde en ekson 21 punktmutasjon (L858R) (H3255), og en hadde L858R i kombinasjon med T790M gatekeeperen mutasjon som gir resistens mot EGFR TKI (H1975). Av de tre
EGFR
-wild-type cellelinjer, en hadde en somatisk mutasjon i
N-ras plakater (H1299), og man hadde en
K-ras
mutasjon (H460). RNA ble ekstrahert og fremstilt fra celler etter at de var blitt dyrket i 2 timer ved 70% konfluens i nærvær eller fravær av EGFR TKI gefitinib (1,0 uM). Denne varighet av TKI behandling ble valgt for å identifisere de tidligste transkripsjonelle hendelser indusert av EGFR inhibering og for å minimalisere detekteringen av genekspresjon endringer som skyldes apoptose. RNA ble utsatt for Affymetrix genekspresjon profilering, og profilene ble undersøkt for forskjeller i genuttrykk ved baseline og etter TKI behandling.
Vi først undersøkt
EGFR
mutasjonsstatus som en klassifikator av transkripsjons profiler. Hierarkisk analyse viste gruppering av cellelinjer basert på mutasjonsstatus;
EGFR
-mutant cellelinjer klart adskilt fra de -wild-type cellelinjer (Fig. 1). Men det var ingen klart skille mellom de to typene av mutasjoner (L858R versus Δ746-750) (Fig. 1). Kontrollert analyse ved hjelp av bestemte kriterier (minst 2,0 ganger økning eller en 50% reduksjon i
EGFR
-mutant cellelinjer i forhold til det av villtype,
P
0,05) , 194 unike gener ble identifisert som skilte
EGFR
mutantcellelinjer fra -wild-type cellelinjer. Disse genene er oppført i File S1 og illustrert i et klynge varmen kartet i fig. 2
A
. Vi undersøkte 29 av de 194 gener ved kvantitativ PCR og validert som 19 (68%) av dem ble uttrykt forskjellig mellom
EGFR
-mutant og -wild-type cellelinjer (Fil S2).
Dendrogrammet illustrerer relasjonen mellom ekspresjonsprofiler fra cellelinjer behandlet med (+) eller uten (-) gefitinib. Tilstedeværelsen eller fraværet av
EGFR
somatiske mutasjoner og typen av mutasjoner, inkludert L858R punktmutasjon (P) eller Δ746-750 slettingsmutasjon (D), er indikert. WT, vill-type.
(A), En 194-gen signatur som skiller
EGFR
-wild-type (WT) fra -mutant NSCLC celle linjer (behandlet med [+] eller uten [-] gefitinib) er på linje med uttrykk profiler fra
(B)
Michigan kohort (86 pasienter) og Harvard kohort (84 pasienter) og
( D)
MCF-7-celler transfektert med de indikerte gener. En liste over de genene som overlappes i alle tre datasettene er angitt på helt til høyre. (
C
) antall pasienter i Michigan og Harvard kohorter manifesting mutant
EGFR
uttrykk mønstre (
P
0,05, Pearsons korrelasjon), sammen med nummer manifestere et tilfeldig generert mønster (SD basert på 100 simuleringer). (
E
) Venn-diagram som illustrerer overlapping mellom underskrifter fra
EGFR
-mutant NSCLC celler og
EGFR
-transfected MCF-7 celler.
Identifikasjon av Mutant
EGFR
signatur i kohorter av pasienter med NSCLC
neste spørres offentlig tilgjengelige genuttrykk databaser av svulst biopsiprøver som stammer fra to uavhengige kohorter av pasienter med NSCLC fra USA (15, 16) for å bestemme hvorvidt en undergruppe av tumorer uttrykte denne genetiske signatur. Av de 194 genene, ble 102 (53%) representert i profilering plattformen som brukes i Harvard-kullet, og 65 (34%) var representert i Michigan kohort. Basert på et varmekart representasjon av sine genuttrykksmønster, de menneskelige lungesvulster var heterogene i sine uttrykk mønstre; imidlertid, en undergruppe av tumorer (9 av 84 [11%] i Harvard kohort og 10 av 86 [12%] i Michigan kullet) oppviste et uttrykk mønster som ligner på den for
EGFR
-mutant NSCLC gen signatur (fig. 2
B
).
for å avgjøre om likheter observert av varmen kartanalyse nådde statistisk signifikans, ble parametere opprettet som definert likheten som en positiv Pearsons korrelasjon av
P
0,05 (tosidig) mellom mutant
EGFR
signatur mønster og genuttrykket verdier av svulsten, tar hensyn til både over- og under-uttrykte gener i signaturen. Ved denne definisjonen, ville svulster manifestere denne signaturen rekapitulere mønstre av over-og under-uttrykk observert i
EGFR
-mutant cellelinjer. Forekomsten av svulster manifestert signaturen var statistisk signifikant (
P
0,01 for hver kohort). Basert på simuleringer ved hjelp av 100 tilfeldig valgte gen signaturer generert fra hver av gruppene (Fig. 2C)
Selv om
EGFR
mutasjonsstatus av svulster fra disse pasient kohortene har, så vidt vi vet, ikke er rapportert,
K-ras plakater (kodon 12, 13 eller 61) er kjent for å muteres i 29% og 45% av svulstene fra Harvard og Michigan kohortene, henholdsvis [15; 16]. Somatiske mutasjoner i
EGFR Hotell og
K-ras
er gjensidig utelukkende i NSCLC [17], noe som har ført etterforskerne til hypoteser om at disse hendelsene er genetisk overflødig og at en endring i både gener gjør ikke gi en ytterligere fordel når disse hendelsene opptrer sammen i den samme celle [17]. Vi postulerte at hvis disse somatiske hendelsene er genetisk overflødig, så har
K-ras
mutasjon vil konferere mutant
EGFR
transkripsjonen profil. I samsvar med denne ideen, bemerket vi at
K-ras
mutasjonsstatus korrelert, om enn svakt, med mutant
EGFR
gen signatur (fig. 2
B, P
= 0,07 og
P
= 0,04 i Harvard og Michigan kohortene, henholdsvis ved Wilcoxon rank-sum tester av kohorten profiler bestilt av gjennomsnittlig uttrykket av gener som ble økt i
EGFR
-mutant celle linjer).
Mutant
EGFR
signatur Beriket med EGFR-Dependent gener
for å undersøke om noen av genene i 194-genet signatur ble regulert i en EGFR-avhengige måte, spørres vi en offentlig tilgjengelig database over MCF-7 brystkreft celler som hadde blitt stabilt transfektert med konstitutivt aktive kinaser (
Raf1
,
MEK1
,
ErbB2
) eller med villtype
EGFR
, som ble aktivert ved korttids EGF behandling [18]. Vi undersøkte overlapping mellom gen signaturer fra
EGFR
-transfected MCF-7 celler og
EGFR
-mutant NSCLC celler. Av de 194 genene i mutant
EGFR
signatur, 139 (72%) var representert på profilering plattform for MCF-7 celletransfektanter (11079 gener i alt var representert både i MCF-7 og NSCLC datasett ). Analyse av disse genene 139 viste at undergrupper av genene som ble økt i MCF-7-celler på grunn av MEK, Raf1, eller EGFR transfeksjon overlappet med de i det mutante
EGFR
ekspresjon signatur i NSCLC-celler (Fig. 2
D
).
av de 119 gener som ble begge representert i MCF-7 datasett og økte i
EGFR
-mutant NSCLC celler, 44 (31%) var økt med
P
0,05 i
EGFR
-transfected MCF-7 celler, som representerte en svært betydelig overlapping (
P
1E-12, ensidig Fishers eksakte test, fig. 2
E
). Ved en tilfeldighet, vil 14 av de 119 genene forventes å overlappe, noe som indikerer at mengden overlapping vi observerte skredet hva som forventes hvis
EGFR
-transfected MCF-7 celler og
EGFR
-mutant NSCLC celler ingenting biologisk felles med hverandre. Når vi brukte en strengere klippepunktet av
P
0,01 i stedet for
P
0,05 definere gener som ble økt i
EGFR
-transfected MCF-7 celler (576 gener i det hele tatt), 28 overlappet med mutant EGFR NSCLC signatur (sjanse forventet av sju gener,
P
1E-10, ensidig Fishers eksakte test). Vi konkluderte med at, basert på sine fellestrekk med signaturen fra
EGFR
-transfected MCF-7 celler, signaturen fra
EGFR
-mutant NSCLC-celler ble beriket for gener transcriptionally up-regulert av EGFR .
Identifikasjon av
PTGS2
som et gen som kreves for forankringsuavhengig vekst
De genene som ble forskjellig uttrykt i
EGFR
-mutant NSCLC cellelinjer falt i et bredt spekter av funksjonelle klasser (kategorisert i Gene Ontologi Molecular funksjoner, www.geneontology.org) (filer S3 og S4). Kategoriene med høyest representasjon var signaltransduksjon, metabolisme, immunrespons, ion transport, og cellesyklus og spredning. Gener i disse kategoriene som ble høyt uttrykte inkludert de som koder ErbB ligander (
TGFa, AREG
, og
EREG
), cyklooksygenase-2 (
PTGS2
), en ligand for den CX3CR1 chemokine reseptor (
CX3CL1)
, intracellulære og transmembrane kinaser (
TRIB2, MET, Mylk, STK39, ACVR1, TAOK3, og IFIH1
), protein fosfataser (
PTPN22, DUSP10 , PPAP2B, PTPRR, etter og
PTPRE
), et lipid fosfatase (
SGPP2
), adhesjonsmolekyler (
CEACAM6, ITGAV, PCDH7, etter og
THBS1
), og kalsium ion-bindende proteiner (
S100A14 Hotell og
S100A16
).
For å undersøke om disse forskjellig uttrykte gener, som har ulike biologiske funksjoner, var en del av en eller flere signaloverføringsnett, analyserte vi sine posisjoner innenfor kjente eller antatte globale protein interaksjonsnettverk (interactomes) ved hjelp av HiMAP program (https://www.himap.org/index.jsp). Interactomes identifisert av denne tilnærmingen er organisert i en serie av modulære strukturer preget av sentralt beliggende noder (kalt huber) som har flere forbindelser med andre proteiner [19]. Selv om denne tilnærmingen er rent utforskende og bærer ingen statistisk vekt, funn i gjær viser at sentralitet i et protein interactome spår et protein biologiske betydning [20].
Av de 194 differensielt uttrykte gener, hadde 118 blitt kommentert i Gene ontologi, hvorav 102 var inkludert i HiMAP programmet (19). Av de 102 genene, 52 kartlagt innenfor et enkelt nettverk (Fig. 3). Navene i nettverket med høyest antall linker (≥ 10) inkludert
CD44, MET, IRS1, GRB10, ITGA2, PTGS2, og THBS1, etter som alle ble sterkt uttrykt i
EGFR
-mutant NSCLC-celler, noe som indikerer at noen av de differensielt uttrykte gener var i det sentrale stillinger av denne signaleringsnett.
Teoretisk protein-protein fysisk og funksjonelt samvirke kart (interactome) ble trukket ved hjelp av HiMAP programvare. Gener fra signaturen er angitt i rødt.
I lys av sentralitet
PTGS2
genet i interactome nettverket og den kjente betydningen av dets genprodukt cyklooksygenase-2 (COX -2) i overlevelse og metastasering av kreft celler og dens potensielle klinisk betydning, gitt tilgjengeligheten av farmakologiske verktøy for å hemme sin enzymatisk funksjon [21], forsøkte vi å undersøke sin rolle i
EGFR
-mutant NSCLC celler. Vi undersøkte hvorvidt den syklooksygenase-2-inhibitor celecoxib avskaffet evnen til disse cellene til å proliferere i monolagskulturer og til å danne kolonier i bløt agar. Ved hjelp av celecoxib ved lave doser (0,5 uM og 1,0 uM) for å minimalisere ikke-spesifikke effekter, kolonidannelse i bløt agar ble redusert på en doseavhengig måte (fig. 4), mens spredning i monolag ikke endret (data ikke vist).
Representative bilder av kolonier av NSCLC-cellelinjer (øvre paneler) ble kvantifisert (lavere panel) etter å dyrke dem i bløt agar i nærvær eller fravær av celecoxib. Resultatene er de hjelp av minst tre uavhengige eksperimenter.
cellelinjer med
EGFR
sletting og punktmutasjoner har forskjellige uttrykk Profiler
Blant pasienter med
EGFR
-mutant NSCLC, forskjeller i overlevelse varighet og reaksjonsevne til EGFR-TKI behandling har blitt observert, avhengig av type
EGFR
somatisk mutasjon (ekson 21 punktmutasjoner kontra exon 19 slettinger) [22; 23] , noe som tyder på at disse to typer somatiske mutasjoner gi forskjellige biologiske egenskapene til NSCLC celler. Støtte denne muligheten er bevis for at disse to typene av somatiske mutasjoner gi forskjellige biokjemiske egenskaper til EGFR [9] – [11]. Selv om det hierarkiske clustering ikke skille de to typer mutasjoner i to distinkte undergrupper (fig. 1), en hypotese vi at administrerte analyse ville avsløre transkripsjonelle forskjeller mellom de to typer mutasjoner. Faktisk var klare transkripsjons forskjeller observeres. Ved hjelp av bestemte kriterier (
P
0,01, minst to ganger endring), identifiserte vi en 270-gen signatur i
EGFR
-mutant cellelinjer (som ikke var til stede i
EGFR
-wild-type cellelinjer) som skilte de to typer mutasjoner. Disse genene er oppført i File S5 og illustrert i et klynge varmen kartet i fig. 5. Vi undersøkte 7 av de 270 gener ved kvantitativ PCR og validert som 4 (57%) ble uttrykt forskjellig mellom cellelinjer med L858R mutasjoner versus de med Δ746-750 mutasjoner (Fil S6). Den 270-genet signaturen ble analysert for anriking i bestemte genet funksjoner som definert av Gene ontologi signaturdatabasen. L858R-mutant celler ble beriket for gener i syklisk AMP-avhengig protein kinase-, protein fosfatase-2ε-, Ras-familiemedlem RAB3D-, og fosfolipase-Cβ1 avhengig trasé, mens Δ746-750 mutantene ble beriket for gener i CXC kjemokin ligander (2 og 3) -, integrin α6-, guanylat bindende proteiner (1, 2, og 3) -, og interleukin-7 og 10-avhengige baner (Fil S7), noe som bekrefter at gensettene aktivert av to mutasjonstyper er funksjonelt distinkte.
En 194-gen signatur til stede i
EGFR
-mutant men ikke EGFR-wild-type cellelinjer skiller L858R (PM [punkt mutasjon]) fra Δ746- 750 (sletting). Celler ble behandlet med (+) eller uten (-) gefitinib. En delvis liste over de gener som er forskjellig uttrykt i de to gruppene er angitt til høyre.
Gener Regulert av EGFR-TKI behandling
For å identifisere genuttrykk endringer som gikk forut, og muligens bidratt til, de biologiske effektene av EGFR-TKI behandling på
EGFR
-mutant NSCLC celler, cellene ble utsatt for kortvarig behandling med gefitinib. Som en negativ kontroll i dette forsøk brukte vi TKI-resistente H1975-celler, som har et T790M mutasjon som blokkerer binding til EGFR TKI [17]. Ved hjelp av bestemte kriterier (
P
0,05), fant vi at 54 gener ble regulert av TKI utelukkende i TKI-sensitive cellelinjer (HCC827, H3255 og H4006) (Fil S8), og ingen av disse har til vår kunnskap, blitt rapportert å være EGFR-avhengige gener. Blant disse genene, undersøkte vi 14 av kvantitativ PCR og validert at 10 (71%) ble ulikt regulert i TKI-sensitive og resistente celler (File S9). Gener som økte i respons til TKI inkludert, blant annet cellesyklus regulatorer (
CCNG2, CDKN1B, ID2, og KNTC2
) og en ligand for EphA2 (EFNA1). Gener som redusert inkludere
EphA2
reseptortyrosinkinasehemming, cytokiner (
LIF, CCL20, etter og
IL17B
), transkripsjonsfaktorer (
FOXD1 Hotell og
POU1F1
), og protein fosfataser (
DUSP4 Hotell og
DUSP6
).
Gjensidig regulering av EphA2 og EFNA1 er EGFR-Dependent
i lys av viktigheten av EphA aksen i tumorigenesis [24; 25], vi videre undersøkt effekten av TKI behandling på uttrykk for EphA2, andre EphA familiemedlemmer, og deres ligand EFNA1. Kvantitativ PCR og western analyser bekreftet at gefitinib gjensidig regulert uttrykk for EphA2 og dens ligand EFNA1 i TKI-sensitive cellelinjer (HCC827, H4006 og H3255), men ikke i TKI-resistente H1975 celler (Fig. 6
A- C
). EphA1, gjorde EphA5, og EphA6 ikke endres med gefitinib behandling (figur 7
A, E og F
.); EphA4 redusert i bare en undergruppe av TKI-sensitive celler (H4006 men ikke HCC827) (figur 7
C
.); og EphA3 ble hemmet i en EGFR-uavhengig måte (indikert av TKI-indusert undertrykkelse i H1975 celler) (Fig. 7
B
). Til mer fullstendig vurdere om undertrykkelse av EphA2 uttrykk ble EGFR-mediert, undersøkte vi effekten av en annen EGFR TKI, erlotinib, og funnet ut at det også hemmet EphA2 uttrykk i TKI-sensitive celler, til en viss grad sammenlignes med gefitinib (Fig . 7
F
).
Kvantitativ PCR-analyse
(A, B) Hotell og western blotting
(C)
av EphA2
(A C) Hotell og EFNA1
(B, C)
i cellelinjer behandlet i 6 timer med (+) eller uten (-) gefitinib. Kvantitative PCR-resultater representerer hjelp av minst tre uavhengige eksperimenter og ble normalisert på grunnlag av ekspresjon av husholdningsgenet L32. Tallene under båndene er resultatene av densitometrisk analyse etter normalisering for lasting forskjeller basert på aktin.
Cellene ble behandlet i 6 timer med bærer, 1 uM gefitinib (A-E), eller 1 uM erlotinib (F). RNA ble ekstrahert og underkastet kvantitativ PCR. Resultater representerer hjelp av minst tre uavhengige forsøk og ble normalisert basert på L32 uttrykk.
EphA2 aktivering er nødvendig for Anchorage-Uavhengig Vekst
Vi postulert at EphA2 signaleopprett neoplastiske funksjoner av NSCLC-celler og testes denne hypotesen ved å behandle HCC827 celler med EphA2-Fc, et rekombinant peptid inneholdende det EphA2 ekstracellulære domenet fusjonert til F
c fragment av IgG, noe som forhindrer interaksjon av Efrin A-ligander med endogen EphA, effektivt blokkerer EphA aktivering [26]. I forhold til den av kontrollene, EphA2-Fc-behandlede celler utviste redusert kolonidannelse i bløt agar (fig. 8), mens deres proliferasjon i monolagskulturer ikke endret (data ikke vist), som indikerer at EphA var nødvendig for den forankrings-uavhengig spredning av disse cellene.
Representative bilder av kolonier av NSCLC-cellelinjer (øverst) med kvantifisering av kolonier (bunn) etter vekst i myk agar i nærvær eller fravær av EphA2-Fc. Resultatene er de hjelp av minst tre uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
Her er vi rapportere at NSCLC celler med somatisk
EGFR
mutasjoner har en unik transkripsjonen profil og at cellelinjer med de to vanligste typene av
EGFR
mutasjoner har klart transkripsjons forskjeller. Ved gruvedrift genuttrykk databaser med en mutant
EGFR
-spesifikk signatur som en sonde, fant vi at mange av genene i dette uttrykket signatur var EGFR-avhengig, konvergerte til vanlige nettverk på grunnlag av kjent eller antatt protein interactomes, og ble uttrykt i tumorer fra en undergruppe av pasienter med NSCLC. To gener ble belyst,
EphA2 Hotell og
PTGS2
, som fremmet clonogenicity av
EGFR
-mutant NSCLC celler, som er av spesiell interesse fra et klinisk ståsted fordi de kan hemmes farmakologisk.
Gener innenfor mutant
EGFR
genuttrykk signatur koder for proteiner med et mangfoldig sett av cellulære funksjoner. Påvirkningen av EGFR på denne signaturen ble demonstrert av sin overlapper med at av EGFR-transfektert MCF-7 celler og tilstedeværelsen av kjente EGFR transkripsjons mål, inkludert
PTGS2, etter ErbB ligander
EREG
og
AREG, etter og
Met
, en reseptor tyrosin kinase som nylig ble rapportert å være aktivert i
EGFR
-mutant NSCLC celler og for å fremme TKI motstand i disse cellene [ ,,,0],8, 27-29]. Her viste vi at genproduktet av
PTGS2
, cyklooksygenase-2, har en viktig rolle, fremme forankrings-uavhengig vekst. Denne signaturen inneholdt mange gener som ikke tidligere er kjent for å være sterkt uttrykt i
EGFR
-mutant NSCLC, inkludert
LY96 Hotell og
CX3CL1
, som har kjent immunmodulerende funksjoner.
LY96
koder MD2, et tilbehør molekyl som kreves for aktivering av toll-lignende reseptor-4, som fremmer celleoverlevelse og induserer sekresjon av immunundertrykkende molekyler som fremmer tumorflukt fra immunovervåkning [30].
CX3CL1
koder for et utskilt protein kalt fractalkine som rekrutterer CX3CR1-uttrykke natural killer og T-lymfocytter til svulsten mikromiljøet, og dermed fremme natural killer avhengig antitumor responser
in vivo product: [31]. På den annen side har også demonstrert fractalkine pro-metastatiske egenskaper på grunnlag av bevis for at den fremmer tumorcellemigrering og forbedrer adhesjon av tumorceller til endotelceller [32, 33].
For å identifisere genene regulert på en EGFR -avhengig måte, behandlet vi
EGFR
-mutant NSCLC celler med gefitinib. To av de genene som er identifisert ved denne tilnærmingen,
EphA2 Hotell og dens ligand
EFNA1
, ble regulert i en gjensidig måte. Potensielt mediere denne effekten av gefitinib, mitogen-aktivert protein kinase, en nedstrøms effektor av EGFR, inhiberer
EFNA1
uttrykk, for derved å avlaste EFNA1-indusert undertrykkelse av
EphA2
uttrykk [25]. Videre fant vi at EphA2 /EFNA1 interaksjoner ble nødvendig for forankringsuavhengig vekst av HCC827 celler, noe som bekrefter funn fra en tidligere studie som viser at v-ErbB avhengig cellulær transformasjon svekkes av EphA2 ligand-bindende [25]. Andre gener vi har funnet for å være regulert av gefitinib i TKI-sensitive celler inkluderer
CCNG2, CDKN1B, ID2, og KNTC2
, som er komponenter av cellesyklusregulerende veier. Gitt at deres uttrykk endret før noen biokjemiske tegn på proliferativ arrest eller apoptose, kan disse genene være en del av en anti-proliferative signal programmet aktiveres av gefitinib. Til slutt, to av de genene som redusert i overflod med gefitinib behandling (
CEACAM-6 Hotell og
DUSP6
) ble også sterkt til uttrykk i
EGFR
-mutant celler, noe som tyder på at disse genene er potensielt viktig EGFR transkripsjons mål i disse cellene.
i sammendraget, har vi identifisert et transkriptomet hos NSCLC celler som belyser mutant
EGFR
indusert genuttrykk endringer og gir en transkripsjonen grunnlag for de biologiske forskjellene observert i NSCLC med de to mest vanlig forekommende typer av
EGFR
mutasjoner. Videre analyse av disse genene kan informere oss om biologiske prosesser som kan brukes til å identifisere intracellulære mål av potensiell terapeutisk nytte for pasienter med denne sykdommen.
Materialer og metoder
Reagenser
Gefitinib (Astra Zeneca Pharmaceuticals, Wilmington, DE) og erlotinib (OSI Pharmaceuticals, Melville, New York) var gaver. Vi kjøpte en rekombinant muse EphA2-Fc chimera (R GIBCO-BRL, MD), supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, Utah).
Gene Expression Profilering
RNA ble isolert ved hjelp av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) og hybridisert til Affimetrix U133 + 2,0 genuttrykk chips ved MD Anderson Cancer Center Microarray Kjerne Facility (støttes delvis av tilskudd CA # 16672). dChip (https://www.dchip.org) (2005-versjonen) ble anvendt for å ekstrahere uttrykk verdier for hver sonde sett. Kontroll probe sett og probe sett med suffiksene «_s_at» og «_x_at» på deres ID ble ekskludert (fordi disse sondesett kan målrette mer enn en unik sekvens), forlater 39 114 av 54 675 originale probe sett for videre analyse.
Fastsettelse av forskjellig uttrykt gener
To-prøve
t
tester (ved hjelp av log-transformerte data) ble benyttet for å bestemme signifikante forskjeller i genuttrykk mellom
EGFR
-mutant og -wild-type NSCLC cellelinjer og mellom EGFR-transfektert og foreldre MCF-7 celler (
P
verdiene var tosidig). For analyse av gefitinib behandlingseffekter, ble en paret forskjell beregnet som log
2 (gefitinib behandlet /kjøretøy-behandlet).
GO berikelse analyse
funksjonelt gen grupper som er definert
