Abstract
Bakgrunn
urokinase plasminogen aktivator (uPA) og dens reseptor (uPAR /CD87) er viktige regulatorer av ekstracellulære matrise nedbrytning og er involvert i celle migrasjon og invasjon under fysiologiske og patologiske tilstander. UPA /uPAR-systemet har vært av stor interesse for kreftforskning fordi det er involvert i utviklingen av de fleste invasive kreft fenotyper og er en sterk prediktor for dårlig pasient overlevelse. Men lite er kjent om rollen uPA /uPAR i småcellet lungekreft (SCLC), den mest aggressive typen lungekreft. Vi har derfor bestemt om uPA og uPAR er involvert i produksjon av resistent SCLC cellefenotyp.
Metoder og funn
Vi skjermet seks humane SCLC cellelinjer for overflatemarkører for mulige stamceller og kreftceller. Vi brukte fluorescens-aktivert cellesortering (FACS), fluorescens mikroskopi og klonogene analyser for å demonstrere uPAR-ekspresjon i en subpopulasjon av celler avledet fra primære og metastatiske SCLC-cellelinjer. Cytotoksiske analyser ble benyttet for å bestemme sensitiviteten til uPAR-positive og uPAR-negative celler overfor kjemoterapeutiske midler. De uPAR-positive celler i alle SCLC linjer demonstrert multiresistens, høyt klonogene aktivitet og co-uttrykk for CD44 og MDR1, mulige kreftstamcellemarkører.
Konklusjoner
Disse dataene tyder på at uPAR-positive celler kan definere et funksjonelt viktig populasjon av kreftceller i SCLC, som er resistente mot tradisjonelle chemotherapies, og kan tjene som viktige mål for mer effektive terapeutiske intervensjoner i SCLC
Citation. Gutova M, Najbauer J , Gevorgyan A, Metz MZ, Weng Y, Shih CC, et al. (2007) Identifisering av uPAR-positive kjemoresistent Cells i småcellet lungekreft. PLoS ONE 2 (2): E243. doi: 10,1371 /journal.pone.0000243
Academic Redaktør: Christopher Arendt, Sanofi-Aventis, USA
mottatt: 15 januar 2007; Godkjent: 31 januar 2007; Publisert: 28 februar 2007
Copyright: © 2007 Gutova et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres.
Innledning
Småcellet lungekreft (SCLC) er den mest aggressive typen lungekreft og har et jevnt dårlig prognose. Metastaser utvikle seg raskt, primært for å benmarg og hjernen, og er vanligvis til stede på tidspunktet for diagnosen. I ubehandlede pasienter, er median overlevelse to måneder fra symptomdebut [1].
I flere typer svulster økte nivåer av urokinase plasminogen aktivator (uPA) og dens reseptor uPAR (CD87) sterkt korrelert med dårlig prognose og ugunstig klinisk utfall [2], [3], [4], [5], [6]. uPA og uPAR er medvirkende i kontrollerende membran-assosiert ekstracellulær proteolyse og transmembran-signalisering, noe som påvirker cellemigrering og invasjon under fysiologiske og patologiske tilstander [2], [7], [8], [9], [10]. uPAR over-ekspresjon i maligne celler resulterer fra aktivering av flere onkogene reaksjonsveier, inkludert MAPK, RTK, ERK2 og FAK [2], [7], [9]. Flere onkogene mutasjoner, inkludert p53 i kreftceller medføre ukontrollert ekspresjon av uPA /uPAR [11]. Inhibering av uPAR i en musemodell for ikke-småcellet lungekreft og andre tumorer hemmet tumorvekst, invasjon, angiogenese og metastase [12], [13], [14]. Økte nivåer av uPAR er korrelert med høyere dødelighet hos pasienter med plateepitelkarsinom og ikke-småcellet lungekreft [15], [16], men lite er kjent om rollen uPA /uPAR uttrykk i SCLC.
En fersk undersøkelse utført av Alfano
et al
understreker viktigheten av uPAR signalering i forebygging av apoptose ved motstand av kreftceller til anoikis (apoptose indusert ved tap av forankring). uPAR uttrykk fremmer celle overlevelse ved å aktivere anti-apoptose faktor BCL-xL transkripsjon gjennom MEK /ERK- og PI3K /Akt-avhengig trasé [17]. Derfor hypoteser vi at uPAR-ekspresjon kan være involvert i utvikling av medikamentresistent cancer fenotype i SCLC.
Vi rapporterer her nærvær av en sjelden populasjon av uPAR-positive celler i humane SCLC-cellelinjer som viser signifikant medikament resistens overfor tradisjonelle kjemoterapeutiske midler så som 5-fluoruracil (5-FU), cisplatin og etoposid. De uPAR-positive celler uttrykte stem- og kreftcellemarkører, inkludert CD44 og MDR1. Identifisering og målretting av uPAR-positive celler i SCLC kan gi verdifull innsikt i biologi av menneskelig lungekreft og kan etablere nye viktige mål for mer effektive anticancer behandling.
Metoder
Farging og flowcytometri analyse
Primary (lunge) småcellet karsinom (SCLC) cellelinjer (H1688, H1417, H69AR), benmarg (BM) metastatisk SCLC (H211, H1882) og hjernemetastatisk SCLC (H250) cellelinjer ble oppnådd fra human lunge primære og metastatiske vev (ATCC), dyrket i RPMI 1640-medium modifisert (ATCC, N: 30-2001) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). BM metastatisk cellelinje (H1882) ble dyrket i fullstendig Hites medium (D-MEM /F-12, N: 30-2006 supplert med insulin 5 ug /ml transferrin 10 ug /ml, natriumselenitt 30 nM, 10 nM hydrokortison , β-østradiol 10 nM, L-glutamin 2 mM, HEPES 10 mM, og 5% FBS). Cellene ble dyrket i to uker og ble analysert ved flowcytometri ved hjelp av følgende antistoffer: CD59 (CBL467P), CD109 (CBL585P), CD62E (CBL180F) fra Chemicon, CD87 (3936CJ) fra American Diagnostica, CXCR4 (FAB170F) fra R D Systems, CD24 (555 427), CD90 (555 596), CD38 (347 680), CD44 (555 478), CD45 (555 482), CD13 (555 394), CD49b (555 498), CD29 (555 443), CD3 (30104X) fra BD Pharmingen, ABCG2 /BCRP1 (10400) fra Stem Cell Technologies, CD133 /2 (klone 293C3) og CD133 /1 (klone AC133) fra Miltenyi Biotec, CD34 (347660) fra Becton Dickinson, CD105 (326-050) fra Alexis, MNF116 (F0859 ), Cyt18 (F7212) fra DACO, og CD166 (3 ft) fra RDI. For FACS-analyse hver cellelinje ble koblet ved trypsinering og re-suspendert i farging buffer (SB) (HBSS, Irvine Scientific, 9228) supplert med 2% FBS og 10 mM HEPES ved en tetthet på 5 x 10
6 celler /ml. Femti pl (2,5 x 10
4-celler) ble tilsatt til hver brønn i en 96-brønners V-formet plate. Antistoffer (FITC- eller PE-konjugert) ble tilsatt i konsentrasjoner som er anbefalt av produsenten (20 mL /10
6 celler). Antistoffer mot CD133, CD34, CD44, CD87 og MDR1 er individuelt titrert. 96-brønners plater ble plassert på is, og cellene ble farget med antistoffer i 30 minutter i mørke. Etter farging, 150 ul vaskebuffer (HBSS supplert med 15% FBS og 10 mM HEPES) /brønn ble tilsatt, og platene ble sentrifugert ved 500 x
g
i 5 min ved 4 ° C. Cellepelletene ble resuspendert i SB, supplert med propidiumjodid (PI) (1 pg /ml) for å utelukke ikke-levedyktige celler, etterfulgt av strømningscytometrisk analyse.
Cell Farging og sortering
SCLC-cellelinjer (H211, H69AR, H1417) ble dyrket i RPMI 1640 medium og 4 x 10
6-celler ble samlet opp og deretter resuspendert i 800 ul SB, etterfulgt av farging med uPAR (CD87) -FITC-konjugert -antistoff som beskrevet ovenfor. uPAR-positive og uPAR-negative celler ble sortert ved hjelp av FACS, etterfulgt av kultur i «base» metylcellulose media (Stem Cell Technologies, 04100) i 16 dager ved 37 ° C, 5% CO
2.
klonogene analyse av SCLC-cellelinjer
komplett RPMI 1640 ble tilsatt til MethoCult H4100 medium (40 ml) for å oppnå et sluttvolum på 100 ml. uPAR-positive og uPAR-negative celler avledet fra SCLC-cellelinjer (H211, H69AR, H1417) ble sådd ut i MethoCult medium i tre paralleller som inneholdt 3 x 10
3, 1 x 10
3, eller 1 x 10
2 celler /ml. Celler ble dyrket ved 37 ° C, 5% CO
2 i en fuktet inkubator i 16 dager. Kolonier ble tellet ved bruk av et invertert mikroskop lysfelt ved 4 x forstørrelse.
Cvtotoksisitetsmålinq
Celler avledet fra tre SCLC linjer ble immunfarget og sortert ved flow-cytometri-analyse (som beskrevet ovenfor). Cellelinjer (H211, H69AR, H1417) ble tellet og anbrakt i 96-brønners plater (4 x 10
3 celler /brønn, i tre paralleller) med endelig konsentrasjoner av narkotika 0, 3, 10, 100, 200 pg /ml . Etter inkubering i 72 timer, ble både levedyktige og døde celler tellet ved hjelp av Guava ViaCount analyse, og bare de levedyktige celler ble inkludert i dataanalysen. Den Guava ViaCount analysen diskriminerer mellom levedyktige og ikke-levedyktige celler på grunnlag av differensial permeabiliteten av DNA-bindende fargestoffer i ViaCount reagenset, og således fluorescens av fargestoffer som tillater kvantitativ vurdering av både levedyktige og ikke-levedyktige celler i suspensjon. Alternativt, ble ikke-sorterte cellene påføres på 48-brønners plater (1 x 10
4 celler /brønn) og behandlet med cisplatin, etoposid og deres kombinasjon i konsentrasjoner på 0, 3, 10, 100 ug /ml. De seeding densiteter per arealenhet (mm
2) var den samme for både 48- og 96-brønns plater (tetthet = 125 celler /mm
2). Etter 72 timers inkubasjon ble levedyktige celler farget med uPAR-FITC antistoffer og evaluert av flowcytometri.
dobbeltmerking for flowcytometri
Cellelinjer ble farget med CD44-PE og MDR1- PE, ble vasket og deretter farget med uPAR-FITC (1 x 10
5 celler /1 ug av antistoff). Iso-type matchet PE- eller FITC-konjugert antistoff ble brukt som kontroller. Fargede celler ble analysert ved flowcytometri.
Resultater
Flowcytometri analyse av SCLC cellelinjer
For å identifisere de mest invasive SCLC fenotyper, vi skjermet seks humane SCLC cellelinjer (H1688, H1417, H69AR avledet fra primærtumor nettstedet i lunge, H250 fra metastaser til hjernen, og H211, H1882 fra metastaser til benmarg) med et panel av antistoffer for overflate determinanter av tumorceller, inkludert uPAR, CD13, CD29, CD44 , CXCR4, CD105, CD109, CD166, og for stamcellemarkører CD34, CD90, CD133, ABCG2 /BCRP1. SCLC-cellelinjer vist heterogene fenotyper med hensyn til tumoroverflate determinanter. Alle seks SCLC cellelinjer var positive for CD29 (20-99%), CD44 (8-98%), CD105 (3-34%), CD166 (85-98%), og negativ for CD90, og CXCR4. uPAR (CD87) var den eneste celleoverflate-antigenet som uttrykkes på en liten sub-populasjon av celler (1-4%) i hver av de seks SCLC-cellelinjer, når det analyseres ved FACS ved bruk av anti-uPAR-FITC-antistoff (figur 1,
nedre paneler
).
Strømningscytometrisk analyse av uPAR ekspresjon i SCLC-avledede cellelinjer. (A, B, C) Lunge-avledet SCLC-cellelinjer (D, E) metastatisk benmarg og (F) med metastatisk hjernecellelinjer. Alle celler ble dyrket i RPMI 1640 medium, farget med uPAR-FITC-antistoff og analysert ved flowcytometri (
nedre paneler
). Kontroll farging ble utført ved hjelp av FITC-konjugert, isotype-matchet mus IgG (
øverste panelene
). En liten populasjon av uPAR-positive celler ble detektert i alle cellelinjene som ble undersøkt, og er angitt som prosent av R1-gated levedyktige celler. Resultatene som vises er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Kontrollprøver farget med isotype-matchet IgG-FITC var negative for uPAR uttrykk (Figur 1,
øverste panelene
). Den konsekvente nærvær av en liten uPAR-positive subpopulasjon av celler i alle primær (lunge, figur 1,
nedre paneler
A, B, C) og metastatisk (benmarg, figur 1,
nedre paneler
D, E og hjerne; F) SCLC-cellelinjer, i motsetning til andre markører, som varierte i overflod, antyder at uPAR-positive celler kan omfatte en funksjonelt unik undergruppe av celler
Chemoresistance av uPAR. -positive Cells
Vi antok at uPAR-uttrykke cellepopulasjon kan være motstandsdyktig mot kjemoterapeutiske midler. Vi utførte cytotoksisitetsanalyser på tre utvalgte cellelinjer ved hjelp av ikke-sortert (bulk) samt sortert uPAR-positive og uPAR-negative cellepopulasjoner. Økende konsentrasjoner av 5-fluorouracil (5-FU) (10, 100, 200 pg /ml) ble tilsatt til disse cellekulturer og inkubert i 72 timer, etterfulgt ved telling av både levedyktige og døde celler. Data ble normalisert til 100%, som tilkjennegitt antall uPAR-positive og uPAR-negative celler uten legemiddel ble tilsatt. En celle-drepende virkning ble påvist i alle de tre ikke-sorterte cellelinjer (H211, H69AR, H1417), hvor 40-80% av cellene ble drept etter 5-FU (figur 2A). Viktigere, uPAR-positive celler sortert fra disse tre cellelinjene som vises i betydelig grad øket motstand mot 5-FU, med bare 40-50% av celler blir drept i tilfelle av H211 og H1417 (figur 2B). Selv om H69AR cellelinjen viste også differensial avliving av uPAR-positive og uPAR-negative celler (for eksempel 10 pg /ml 5-FU drepte 30% av uPAR-positve celler versus 85% av uPAR-negative celler), ved høy konsentrasjon av 5-FU (200 ug /ml), den drepende effekt for begge populasjoner (H69AR) var den samme (~ 100%). Statistisk analyse (2-veis ANOVA) av uPAR (+) og uPAR (-) datasett viste signifikante forskjeller i overlevelse av uPAR (+) og uPAR (-) celler etter behandling med 5-FU (
P
= 0,0002, 0,0027, 0,0008 for H211, H69AR, H1417 celler, henholdsvis) (figur 2B).
cytotoksisk effekt av 5-FU på ikke-sortert og sortert (uPAR-positive og uPAR-negative populasjoner) avledet fra SCLC-cellelinjer. (A) 1 x 10
4 celler (H211, H69AR, H1417) ble plassert i brønner i en 48-brønners plate in triplo og inkuberes i 72 timer i nærvær av varierende konsentrasjoner av 5-FU. (B) SCLC-cellelinjer ble FACS-sortert etter farging med anti-uPAR-antistoffer og ble platet på samme seeding tetthet (4 x 10
3 /brønn av 96-brønns plate) og behandlet med 5-FU ved 0, 10 , 100, 200 ug /ml i 72 timer. Celle overlevelse ble evaluert etter tilsetting Guava ViaCount reagent og telle levedyktige og døde celler. Bare levedyktige celler ble inkludert i dataanalyse, og 100% levedyktighet ble definert som antall levedyktige celler dyrket i fravær av 5-FU. Statistisk analyse (2-veis ANOVA) av uPAR (+) og uPAR (-) datasett viste signifikante forskjeller mellom levedyktigheten til uPAR (+) og uPAR (-) celler (
P
= 0,0002, 0,0027, 0,0008 for H211, H69AR, H1417 celler, henholdsvis). Datapunktene representerer gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter.
Vi har undersøkt på samme måte den cytotoksiske effekten av cisplatin og etoposid, narkotika i dag brukes for behandling av pasienter med SCLC. Den ikke-sortert SCLC-cellelinjer (H211, H69AR, H1417) ble anvendt i cytotoksiske analyser med cisplatin og etoposid i
in vitro-studier
(3, 10, 100 ug /ml) (figur 3A). 60-80% av cellene ble drept av cisplatin og etoposid (brukt hver for seg eller i kombinasjon) i ikke-sortert linjer (figur 3a). Igjen, uPAR-positive celler sortert fra disse tre cellelinjene som vises i betydelig grad øket motstand mot cisplatin og etoposid, med bare 30-50% av cellene blir drept, sammenlignet med 60-80% dreping av uPAR-negative sorterte cellene (data ikke vist). Disse dataene antyder at uPAR-positive celle subpopulasjon i SCLC kan være ansvarlig for chemoresistance til 5-FU og andre tradisjonelle cellegifter som cisplatin og etoposid.
cytotoksiske effekten av cisplatin og etoposid på ikke-sortert celler avledet fra SCLC-cellelinjer. (A) SCLC-cellelinjer (ikke-sortert) ble behandlet med cisplatin, etoposid, ved konsentrasjoner 0, 3, 10, 100 ug /ml eller deres kombinasjoner (cisplatin og etoposid ved endelige konsentrasjoner på 10 ug /ml, 100 pg /ml) i 72 timer. Celle overlevelse ble evaluert etter tilsetting av Guava ViaCount reagent og telling av både overlevende og døde celler ved hjelp av Guava ViaCount programvare. Data ble normalisert til 100% levedyktighet av celler dyrket i fravær av narkotika. Feilfelt angir standardavvik tredoble kulturer (resultater av tre uavhengige forsøk). (B) Etter behandling med cisplatin og etoposid, var levedyktige adherente celler løsnet ved trypsinbehandling og ble farget med anti-uPAR-FITC-antistoff og prosentandelen av uPAR-positive celler ble bestemt ved FACS-analyse. Prøven med mus IgG isotypekontrollantistoff ble brukt til å sette verdien av FACS gate, som ble brukt på alle prøvene farget med uPAR-FITC.
For å bekrefte at uPAR uttrykk overfører svulst motstand mot cisplatin og etoposid, utførte vi cytotoksisitetsassayer på de samme ikke-sorterte SCLC cellelinjer, og så for anriking av uPAR-positive celler i overlevende cellepopulasjon. Faktisk har vi oppdaget at en betydelig anrikning av uPAR-positive celler (40-70%) blant overlevende celler, sammenlignet med bare 1-5% av uPAR-positive celler i kontrollkulturer dyrket i fravær av disse legemidler (figur 3B). Disse dataene støtter hypotesen om at uPAR uttrykk overfører chemoresistance i SCLC, og at uPAR-positive celler bør betraktes som en roman mål for mer effektiv behandling.
klonogene Aktivitet av uPAR-positive celler
For å vise at uPAR-positive celler besitter høy klonogene og selvfornyelse potensial, vi sortert primære lunge (H1417, H69AR), metastatisk benmarg (H211) cellelinjer ved FACS bruker anti-uPAR-FITC-konjugerte monoklonale antistoffer. Etter sortering (97% renhet), ble uPAR-positive og uPAR-negative celler sådd ut i metylcellulose media med en tetthet på 3000, 1000, 100 celler /brønn (6-brønn plate). uPAR-positive celler fra disse primære og metastatiske SCLC linjer dannet flere distinkte kolonier (Figur 4A). Vi beregnet at ca. ~ 10% av uPAR-positive celler (lunge, H1417, benmarg, H211) dannet kolonier (figur 4B). Derimot er uPAR-negative celler fra den primære lunge (H1417) celler ikke danner kolonier, og fra metastatisk benmarg (H211) og lunge (H69AR) dannet bare noen få kolonier (figur 4B). Etter uPAR-positive celler ble tillatt å danne kolonier på 16 dager i kultur metylcellulose, ble 20 kolonier isolert og analysert for uPAR-ekspresjon ved strømningscytometri. Vi fant både uPAR-positive og uPAR-negative celler i hver koloni analyseres (H1417), med 30-50% av cellene viser uPAR positivitet i hver koloni, etter 18 dager med inkubasjon (figur 4C). Dette tyder på at uPAR-positive celler kan gi opphav til både uPAR-positive og uPAR-negative celler. uPAR-ekspresjon ble også analysert i koloniene avledet fra H211 og H69AR cellelinjer. I alle koloniene avledet fra sorterte uPAR-positive celler vi har oppdaget både uPAR-positive og uPAR-negative celler (~ 50% hverandre etter 16 dager i kultur metylcellulose) (data ikke vist). Analyse av koloniene avledet fra uPAR-negative celler (f.eks H211 cellelinje) viste en liten andel av uPAR-positive celler i disse koloniene (mindre enn 1%). Grunnen til dette kan være mulig forurensning i løpet av sortering. Alternativt kan uPAR-negative kreftceller erverve uPAR-ekspresjon under visse dyrkningsbetingelser. Flere uPAR-positive kolonier har blitt plukket og dyrket videre i 2 uker i RPMI dyrkingsmedium, etterfulgt av FACS sortering og klonogene analysen. Interessant, vi har oppdaget en tilsvarende andel av uPAR-positive og uPAR-negative celler (1-5% og 95-99%, henholdsvis) i disse kulturene, noe som tyder på at uPAR-positive kolonier kan rekapitulere foreldre cellefenotyp. I kulturer som stammer fra uPAR-negative kolonier på den annen side, vi oppdaget at lavere nivåer (0,1-0,8%) av uPAR-positive celler, og dårlig generell vekst (data ikke vist).
kolonidannende aktivitet av uPAR-positive og uPAR-negative celler avledet fra SCLC-cellelinjer. (A) H1417- avledet, uPAR-positive sorterte cellene dannet av flere kolonier i metylcellulose media, mens uPAR-negative celler fra samme slags viste lite eller ingen aktivitet klonogene. (B) Grafisk fremstilling av kolonidannende evne uPAR-positive og uPAR-negative celler ved forskjellige plette tettheter 3000, 1000, 100 celler /6-brønns plate (H1417, H69AR, H211). (C) Fordeling av uPAR-positive celler i koloniene avledet fra sortert uPAR-positive celler dyrket i media metylcellulose. Totalt 20 cellekolonier fra H1417 cellelinjen ble analysert.
Co-uttrykk for uPAR med CD44 og MDR1
Vi videre en hypotese om at dersom uPAR-positive celler representerer narkotika motstandsdyktig og klonogene befolkning i SCLC, kan de uttrykker CD44 og MDR1 (ABCB1) gener som er involvert i utvikling av kreft stamcelle-fenotypen og multimedikamentresistens. For ytterligere å karakterisere uPAR-positive populasjon, utførte vi dobbeltmerkeforsøk med uPAR-FITC, og CD44-PE samt MDR1-PE på H211, H69AR, H1417 cellelinjer. uPAR-positive celler avledet fra SCLC-cellelinjer (H211, H69AR, H1417) uttrykte CD44 på 50-80%, mens MDR1 på 10-40% av celler (figur 5A). Ekspresjon av de ovenfor angitte markørene ble også bekreftet ved bruk av fluorescerende mikroskopi (figur 5B). De uPAR-negative celler som uttrykte CD44 (~70% for H211 og H69AR celler; -10% for H1417) og MDR1 (1-10% for alle cellelinjer) (figur 5A.). Disse dataene antyder en berikelse av CD44 uttrykk på H1417 celler, mens MDR-1 viste økt uttrykk på uPAR-positive celler avledet fra alle tre cellelinjer i forhold til uPAR-negative celler (fig. 5A).
Uttrykk for CD44 og MDR1 på uPAR-positive og uPAR-negative celler. (A) FACS-analyse av, H211, H69AR og H1417 SCLC-cellelinjer dobbeltmerket med FITC-uPAR og CD44-PE, MDR1-PE. Prosentandelene av celler som uttrykker CD44 og MDR1 ble beregnet separat for uPAR-positive og uPAR-negative celler. (B) Fluorescent mikroskopisk analyse av dobbel-merket og FACS-sorterte cellene. Eksempler på uPAR-FITC /CD44-PE dobbel merking (a, b, c) og uPAR-FITC /MDR1-PE dobbel merking (d, e, f). (Bf-innfelt) H1417 cellelinje farget med mus IgG isotypekontrollantistoff-PE (rød), isotypekontrollantistoff-FITC (grønn) og DAPI (blå).
Diskusjoner
hoved~~POS=TRUNC i denne studien er identifisering av en sjelden undergruppe uPAR-positive celler i SCLC cellelinjer avledet fra lunge og metastaser til benmarg og hjernen. Det er godt dokumentert at uPAR over-ekspresjon i forskjellige ondartede svulster er sterkt korrelert med de invasive kreft fenotyper og dårlig prognose [2], [4], [15], [18].
Flere studier tyder på at nærvær av en sjelden populasjon av celler i faste tumorer og leukemi som innehar evnen til å regenerere og forplante tumoren [19], [20], [21], [22], [23]. Disse cellene kan også være ansvarlig for å holde svulsten ondartet potensial og tjene som den underliggende årsaken til tumorresidiv [24], [25]. Nåværende behandlingsstrategier kan mislykkes i å målrette medikamentet bestandige undergruppe, og kan forklare den første terapeutiske respons til flertallet av tumorceller, som er etterfulgt av en senere gjentagelse.
Vi fant at uPAR-positive celler var mer resistente mot behandling med det cytotoksiske middel 5-FU, mens uPAR-negative celler ble drept mye mer effektivt. Den cytotoksiske virkning av 5-FU har blitt tilskrevet misincorporation av fluoronucleotides inn i RNA og DNA, og til hemming av den syntetiske nukleotid-enzymet tymidylatsyntase, som i hovedsak er rettet mot de hurtig delende celler [26]. Vi undersøkte også cisplatin og etoposid, kjemoterapeutiske legemidler for tiden benyttes i behandling av SCLC pasienter. Viktigere, dyrking av SCLC-celler i nærvær av cisplatin og etoposid resulterte i selektiv dreping av uPAR-negative celler som samtidig anrikning av uPAR-positive cellepopulasjon.
uPAR-positive celler isolert fra tre SCLC linjer var i stand å spre seg og danne flere kolonier i metylcellulose media, mens uPAR-negative celler viste liten eller ingen klonogene potensial. Vi viste også co-uttrykk for uPAR med CD44 og MDR1, noe som kan forklare sammenhengen mellom fremskreden kreft og narkotika motstand. Flere studier har undersøkt individuelt rolle uPAR, CD44 og MDR1 i forskjellige maligniteter [5], [13], [14], [17], [19], 24,27,28,29,30,31,32, men dette er den første studien som gir bevis for uttrykk av CD44 og MDR1 på uPAR-positive celler i SCLC til vår kunnskap. Vi har også oppdaget CD44 og MDR1 uttrykk på uPAR-negative celler, de funksjonelle konsekvensene av som gjenstår å fastslå.
ATP-bindende kassett (ABC) narkotika transportører har vist seg å beskytte kreft stamceller fra kjemoterapeutika 33 . En stor transportør av ABC-familien er P-glykoprotein, er produktet av MDR1-genet, som er produsert av hematopoetiske stamceller (HSC) 32. MDR1 genet blir nedregulert på HSC på celledifferensiering 32. P-glykoprotein og CD44 er blitt karakterisert og er kjent for å være faktorer som bestemmer multilegemiddelresistens i cancerceller, som blir mediert av fysiske og genetiske interaksjoner mellom CD44 og MDR1 30. Aktivering av CD44 skjer gjennom heterodimerisering av CD44 med vekstfaktorreseptorer (for eksempel EGFR, FGFR, HGFR, VEGFR, TGF-βR), noe som fører til aktivering av MAP-kinase og PI3K-AKT signalveier 34. CD44 stimulering av dets ligand hyaluronan opp-regulerer ekspresjonen av uPA og uPAR mRNA, ved aktivering av MAPK-reaksjonsveien Ras , mens PI3K aktivering stimulerer MDR1 ekspresjon og funksjon 34. PI3K også fungerer som en positiv tilbakekoplingssløyfe for å stimulere produksjon hyaluronan, som aktiverer CD44 35,36. Den CD44-MAPK-PI3K signalering fører til ukontrollert ekspresjon av uPA /uPAR og MDR1, som fremmer invasiv og multimedikamentresistent cancer celle-fenotype. I tillegg til det CD44-MAPK-PI3K-signalering, kan uPAR over-ekspresjon induserer celleoverlevelse ved å aktivere anti-apoptose faktor Bcl-xL transkripsjon 17.
fremtidige studier i dyremodeller vil ta for hvorvidt den uPAR-positive cellene er ansvarlige for primær tumorvekst og dannelse av fjernmetastaser i SCLC. Oppsummert har vi identifisert uPAR-positive subpopulasjon av SCLC-celler som besitter høy multi-medikamentresistens og klonogene aktivitet, mens uPAR-negative celler som er følsomme overfor kjemoterapeutiske medikamenter og viser liten eller ingen klonogene aktivitet. Vi tilbyr også bevis for foreningen av uPAR, CD44 og MDR1 uttrykk på SCLC celler. Videre undersøkelser er garantert å finne ut om målretting av denne cellen befolkningen vil være avgjørende for terapeutisk suksess.
Takk
Vi takker Dr. Kristine A. Justus for ekspert redigering av manuskriptet, Lucy Brown for hjelpe med flowcytometri målinger og Sofia Loera for hjelp med immunhistokjemiske teknikker. Vi takker Dr. Kemp Kernstine for å gi cisplatin og etoposid. Dette arbeidet er dedikert til kjærlig minne om Hrach Shahmanyan.
