Abstract
Økt lipogenese er et kjennetegn på et bredt spekter av kreftformer og er under intens etterforskning som potensielle antineoplastiske mål. Selv om rask lipogenese er observert i nærvær av eksogene lipider, er bevis for montering på at disse lipider kan ha negativ innvirkning på effekten av inhibitorer av lipogenic veier. Derfor, for å fullt ut utnytte den terapeutiske potensialet av lipid-syntesehemmere, en bedre forståelse av forholdet mellom
de novo
lipidsyntese og eksogene lipider og deres respektive rolle i kreftcelleformering og terapeutisk respons av lipogenese-inhibitorer er av kritisk betydning. Her viser vi at spredning av forskjellige kreftcellelinjer (PC3M, HepG2, HOP62 og T24) dempes når de dyrkes i lipid-reduserte betingelser på en cellelinje avhengig måte, med PC3M betyr minst påvirket. Interessant, alle cellelinjer – lipogenic (PC3M, HepG2, HOP62) så vel som ikke-lipogenic (T24) – hevet sin lipogenic aktivitet i disse forholdene, om enn i en annen grad. Celler som oppnådde høyest lipogenic aktivitet under disse forholdene var best i stand til å takle lipid reduksjon på sikt av proliferativ kapasitet. Supplering av mediet med lipoproteiner med svært lav densitet, frie fettsyrer og kolesterol reverserte denne aktivering, noe som indikerer at bare mangel på lipider er tilstrekkelig for å aktivere
de novo-lipogenese
i kreftceller. Derfor kreftceller dyrket i lipid-redusert forholdene ble mer avhengig av
de novo
lipid syntese stier og var mer følsomme for hemmere av lipogenic trasé, som Soraphen A og Simvastatin. Til sammen indikerer disse data at begrensning av tilgang til eksogene lipider, som kan forekomme i intakte tumorer, aktiverer
de novo-lipogenese
er kreft celler, hjelper dem å trives under disse betingelser og gjør dem mer utsatt for lipogenese-inhibitorer. Disse observasjonene har viktige implikasjoner for design av nye antineoplastiske strategier rettet mot kreftcelle lipidmetabolismen
Citation. Daniëls VW, Smans K, Royaux I, Chypre M, Swinnen JV, Zaidi N (2014) Kreftceller forskjellig Aktiver og trives på
De Novo
fettsyntese Pathways i en lav-Lipid Environment. PLoS ONE ni (9): e106913. doi: 10,1371 /journal.pone.0106913
Redaktør: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, Frankrike
mottatt: 11 april 2014; Godkjent: 03.08.2014; Publisert: 12. september 2014
Copyright: © 2014 Daniëls et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra: Scientific Research Foundation-Flandern (FWO, https://www.fwo.be/en/) G.0691.12 (JVS), KU Leuven felles forskning handlinger (GOA, https://www.kuleuven.be/onderzoek/kernprojecten/goa.htm) GOA /11/2009 (JVS), og Interuniversity Attraksjon polakker – belgiske Federal Science Regler kontor (IAP Belspo, https://www.belspo.be/belspo/index_en.stm) IAP7-32 (JVS). VWD er vitenskapelig assistent av Scientific Research Foundation-Flandern (FWO) og den flamske League mot Kreft (VLK, https://www.tegenkanker.be/home). Medforfattere KS, IR, MC, og NZ er ansatt av Janssen Pharmaceutica NV. Janssen Pharmaceutica NV gitt støtte i form av lønn for forfattere KS, IR, MC og NZ. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser:. Medforfattere Karine Smans, Ines Royaux, Melanie chypre og Nousheen Zaidi er ansatt av Janssen Pharmaceutica NV. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Raskt voksende kreftceller krever en konstant tilførsel av lipider for membran BIOGENESIS og protein modifikasjoner. Flere studier har vist at for å takle disse økte krav, kreftceller enten å øke deres opptak av lipider eller aktivere
de novo
lipidsyntese [1] – [5]. Forbedret fettsyrer er funnet i 20% til 90% av tumorer i mange forskjellige typer, og er reflektert i opp-regulering av nøkkelenzymer som er involvert i denne veien [1]. Disse inkluderer fettsyre syntase (FASN), acetyl-CoA karboksylase alfa (ACACA) og ATP-citrate lyase (ACLY). Utallige rapporter tyder på at aktivering av disse enzymene skjer nedstrøms av vekstfaktor signalisering og andre onkogene arrangement, uavhengig av tilstedeværelsen av ekstracellulære lipider [1], [6] – [12]. Også kolesterolsyntesen, gjennom mevalonat reaksjonsveien, er aktiv i mange kreftceller. Viktigere, hemming av fettsyrer eller kolesterol syntese pathways av RNA interferens eller kjemiske hemmere fører vekst arrestasjonen av lipogenic tumorceller, både
in vitro Hotell og
in vivo
, rendering disse enzymene interessante mål for antineoplastisk terapi [1], [13] – [19]. Dessverre er de cytotoksiske effektene indusert ved inhibering av
de novo
lipid synteseveier synes å være avverget ved nærvær av eksogene lipider eller intermediære metabolitter [13], [20], [21]. Disse observasjonene tyder på at det er avhengigheten av
de novo
lipid syntese som bestemmer svaret av kreftceller til hemming av disse banene, og at ekstracellulære lipider kan kompromittere de terapeutiske fordelene med disse hemmere.
her, for å få mer innsikt i det komplekse samspillet mellom eksogene lipider og
de novo
lipid syntese veier i kreftceller og å utforske hvordan dette samspillet kan påvirke effekten av lipid-targeting antineoplastiske midler, undersøkte vi effekten av lipid deprivasjon på celleproliferasjon og responsen på lipogenic inhibering i en rekke vel etablerte lipogenic og mindre lipogenic kreftcellelinje modeller. Interessant, fant vi at en lipid-redusert vekst miljø ulikt påvirker veksten av kreftcellelinjer og er tilstrekkelig til å slå på
de novo
lipogenese veier selv i kreftcellelinjer som anses som ikke-lipogenic. Denne aktiveringen hjelper til kreftcellene for å opprettholde deres formeringshastigheten i et lavt-lipid miljø og gjør dem mer følsomme for lipogenese-inhibitorer. Disse data understreker på heterogenitet av kreftceller i forhold til deres metabolske krav, understreker de viktigheten av ekstracellulære betingelser og har viktige implikasjoner for den forbedrede utforming av terapeutiske strategier basert på manipulering av lipid kravene til tumorceller.
Materialer og metoder
Cell kultur og behandlinger
Alle cellelinjer ble hentet fra American Type Culture Collection (ATCC). Cellekultur reagenser ble anskaffet fra Invitrogen, med mindre annet er angitt. Den PC3M-cellelinjen ble dyrket i HyClone MEM /EBSS medium (Thermo Scientific) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 mM natriumpyruvat, 10 mM ikke-essensielle aminosyrer, 2 mM L-glutamin, 50 ug /ml Gentamicin og 1X BME vitaminer (Sigma). HOP62 celler ble dyrket i RPMI 1640 supplementert med 10% FBS, 2 mM L-glutamin og 50 ug /ml gentamicin. HepG2-celler ble dyrket i MEM supplert med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 50 ug /ml gentamicin, 100 mM natriumpyruvat, 0,37 g /l natriumbikarbonat, 10 mM ikke-essensielle aminosyrer. T24-cellelinjen ble dyrket i DMEM-medium, supplert med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 50 ug /ml gentamicin. Alle cellelinjer ble dyrket i atmosfære av 5% CO
2 og 37 ° C. For lipid-redusert forhold media ble supplert med 10% HyClone lipid-redusert FBS (Thermo Scientific). Forskjeller i lipider og relaterte komponenter i normal versus fettredusert FBS er oppført i Tilleggs Tabell S1. Simvastatin ble kjøpt fra Merck Sharp. Soraphen A ble mottatt fra Dr. R. Jansen, Helmholtz-Zentrum f. Infektionsforschung, Mikrobielle Wirkstoffe, Braunschweig, Tyskland [22], [23]. Vannløselig kolesterol, glyceryl trilinoleate og glyceryl trilinolenate ble kjøpt fra Sigma. density lipoproteiner med svært lav-(VLDL) ble oppnådd fra Merck Millipore. For dyrking av cellene i nærvær av forskjellige fettsyrer blandinger, palmitinsyre (16:00), oljesyre (18:01), linolsyre (18:02), α-linolensyre (18:03), arakidonsyre (20:04) og dokosaheksaensyre (22:06) syre (Sigma) ble kompleksbundet til fettsyre-fri BSA (Sigma) som beskrevet tidligere [18], før tilsetning til kulturmediet. Triglycerider ble inkubert i normal eller lipid-redusert FBS i 30 minutter ved 37 ° C før tilsetning til kulturmediet.
Immunoblotting analyse
Like mengder proteiner ble fylt på prefabrikerte geler (NuPAGE, Invitrogen), overført til PVDF membraner og inkubert med antistoffer mot ACLY (monoklonalt kanin, ab40793, Abcam), FASN (monoklonalt kanin, 3180, Cell Signaling) og β-aktin (monoklonalt mus, Sigma). Membranene ble vasket og probet med geite-anti-kanin konjugert med Alexa Fluor 680 (Invitrogen) sekundære antistoffer. Fluorescerende signal ble deretter målt ved bruk av Licor Odyssey system (LI-COR Biosciences).
proliferasjonsanalyse
PC3M og HOP62 celler ble sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
4 celler ml
-1 i 24-brønners vevskulturplater (Nunc). T24-celler ble sådd ut ved 2 x 10
4 celler ml
-1 i en 24-brønners vevkulturplate. HepG2 celler ble sådd på 2,5 × 10
4 celler ml
-1 i Poly-D-lysin 96-brønners mikroplater, svart /klar (BD Biovitenskap). Cellene ble sådd ut i normal eller lipid-redusert medium. Vekstkurver ble konstruert av bildeplater ved hjelp av
Incucyte system plakater (Essen Instruments), hvor vekstkurver ble bygget fra Confluence målinger ervervet i løpet round-the-clock kinetic bildebehandling. For bestemmelse av cellene telle cellene som flyter i kulturmediet ble slått sammen med de adherente celler etter trypsinering. Cellen ble farget med trypanblått og telles ved hjelp av grevinne automatisert celleteller (Invitrogen).
RNA isolering og Real-time kvantitativ PCR (qPCR)
Total RNA fra dyrkede celler ble ekstrahert og DNaseI behandlet bruker RNeasy Mini kit (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner. 3 mikrogram av total RNA tjente som templat for cDNA-syntese ved anvendelse av oligo dT primere og Superscript III revers transkriptase i et volum på 20 ul i løpet av en time ved 50 ° C. Dette ble etterfulgt av inaktivering av enzymet ved 70 ° C i 15 minutter, i henhold til produsentens anbefalinger (Invitrogen, Carlsbad, CA). Kvantitativ PCR (qPCR) ble utført på en ABI Prism 7900-HT Sequence Detection System (Applied Biosystems) under anvendelse av en qPCR kjerne kit w /o dUTP (Eurogentec). De termiske sykluser Betingelsene var 10 min ved 95 ° C, etterfulgt av 45 sykluser på 15 sek ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C. Validerte pre-designet Taqman genekspresjon Analyser (Applied Biosystems) som tilsvarer husholdningsgener TFRC (Hs00951083_m1) og PGK1 (Hs00943178_g1) ble brukt til å generere standardkurver på serielle fortynninger av cDNA. Det relative standardkurve metoden ble brukt for å beregne uttrykket verdier. Etter normalisering av TFRC eller PGK1 de relative uttrykk verdiene ble beregnet. De andre Taqman genuttrykk analyser brukt i denne studien er: ACLY (Hs00982738_m1), ACSS2 (Hs00218766_m1), FASN (Hs01005622_m1), ACACA (Hs01046047_m1), HMGCR (Hs00168352_m1)
Total RNA fra T24 celler ble utarbeidet. bruker PureLink RNA Mini Kit (Ambion). Renheten og konsentrasjonen av RNA ble vurdert ved hjelp av en Nanodrop DM-1000 spektrofotometer (Nanodrop Technologies). 3 ug av RNA for hver prøve ble benyttet som templat for cDNA-syntese ved bruk av tilfeldige heksamerprimere og Superscript II revers transkriptase, i henhold til produsentens protokoll (Invitrogen). Primere ble utformet med Primer-BLAST programvare fra NCBI, der det er mulig primere som spenner over et ekson-exon krysset ble valgt. Spesifisiteten av primerne ble undersøkt ved sekvensanalyse i Primer-BLAST programvare og smelte kurve analyse. Kvantitative PCR ble utført på en 7500 Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems) ved hjelp av Fast SYBR Grønn Master Mix (Applied Biosystems). De termiske sykkelforholdene var 20 sekunder ved 95 ° C, etterfulgt av 40 sykluser på 3 sekunder ved 95 ° C og 30 sekunder ved 60 ° C. De oppnådde Ct-verdier ble normalisert ved hjelp av 18S som husholdningsgenet.
apoptose analysen
Celler ble sådd i normale eller lipid-redusert vekstvilkår og ble inkubert og behandlet i 72 timer med Soraphen A eller Simvastatin. Apoptose ble vurdert ved hjelp av
Guava nexin
kit og
Guava PCA system plakater (Guava Techinnologies). Den Guava nexin-analysen benytter to flekker (annexin V og 7-amino-actinomycin D [7-AAD]) for å kvantifisere prosentandel av apoptotiske celler. Celler som flekker positive for begge fargestoffer er i de senere stadier av apoptose, før celledød. Den nexin Analysen ble utført i henhold til produsentens protokoll. Dataene ble samlet inn og analysert av en Guava personlig celle analyse (PCA) flowcytometer med bruk av CytoSoft programvare (Guava Technologies). Omtrent 2000 celler ble analysert.
3D-cellekultur
HepG2-celler ble sådd i ultra-low feste 96-brønners plater (Corning Costar) med en tetthet på 750 celler /brønn /200 ul medium . Celler ble sådd ut og opprettholdt i normal eller lipid-redusert vekstmedium og overvåket i 20 dager. Etter spheroid formasjon, ble 50% medium volum skiftes hver 3-4 dager. Kulene ble analysert ved hjelp av
I Cell Analyzer plakater (GE Healthcare).
ATP analysen
Livskraftig av celler som omfatter de kulene ble bestemt ved måling av celle ATP innhold ved hjelp CellTiter- Glo Selvlysende celleviabilitet Assay (Promega) i henhold til produsentens protokoll. I korte trekk ble 100 ul «CellTiterGlo-reagens» tilsatt til brønnene som inneholdt kuler. Før tilsetning av CellTiterGlo-reagensen 100 ul medium ble fjernet fra hver brønn. Sfæroidene blir lysert ved å riste i 10 minutter fulgt av pipettering. 100 ul av cellesuspensjonen fra hver brønn ble overført til en hvit Optiplate 96 (Perkin Eimer). Luminescensen målt.
Lipid syntese
Cellene ble dyrket i 24-brønners plater i normal eller lipid-redusert medium. Etter 72 timer [
14C] -merket acetat (56 mCi /mmol, 0,2 uCi /brønn, Amersham Biosciences) ble tilsatt til cellene. Etter 4 timers inkubering ble cellene oppsamlet ved trypsinering og pelletert ved sentrifugering. Lipidene ble ekstrahert ved anvendelse av en modifisert Bligh Dyer metoden, som tidligere beskrevet [19].
14C-inkorporering i cellulære lipider ble kvantitert ved hjelp av scintillasjonstelling under anvendelse av en Packard 1600CA
Tri-Carb væskescintillasjonsteller plakater (Packard instrument Company). De oppnådde tellinger ble normalisert for prøve-DNA-innhold, for å ta hensyn til forskjellene i antallet celler etter 72 timer i lipid-reduserte mellom betingelser.
Nanofluidic proteomikk analyse
ekspresjon av forløperen og den aktive formen av SREBP1 og SREBP2 ble undersøkt ved en størrelse basert Simple Western immunologisk analyse under anvendelse av en Peggy Nanopro anordning (Protein Simple). Den totale proteinkonsentrasjonen i prøvene ble bestemt ved bruk av en BCA proteinanalyse (Pierce). Lik mengde av prøve ble fremstilt i et enkelt Vest-fortynningsbuffer, redusert og denaturert før lasting på platen. Platene ble fremstilt i henhold til fremstillings prosedyre, ved hjelp av alle reagenser fra Protein Simple. SREBP1 og SREBP2 antistoffer (Active Motif, # 39939 og # 39941) ble brukt på 1:25 fortynning, ble α-tubulin antistoff (Cell Signaling, # 2125) som brukes på en 1:500 fortynning. Data ble analysert ved hjelp av Simple Western Compass programvare. Protein uttrykk (arealet under kurven, AUC) ble korrigert for alpha-tubulin lastekontroll (AUC SREBP /AUC alpha-tubulin).
Statistisk analyse
Resultatene ble analysert ved Students’t -test (Excel) eller enveis ANOVA etterfulgt av Tukey multippel sammenligningstest (GraphPad Prism programvare), der det er aktuelt. P-verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. De data som er gitt representerer middelverdier ± S.D. som angitt i det tilsvarende tallet legender.
Resultater
Lipid-redusert vekstvilkår forskjellig dempe spredning frekvensen av tumorcellelinjer
For å studere effekten av lipid reduksjon på spredning og overlevelse av kreft celler vi valgt PC3M, HOP62, HepG2 og T24 cellelinjer. De tre første cellelinjene er rapportert å ha en lipogenic fenotype i standard cellekulturbetingelser med fullstendig serum. Vi observerte i vår tidligere studie at disse cellelinjene ble påvirket av miljø lipider [24]. Dette var uventet, siden lipogenic cellelinjer er antatt å være i hovedsak avhengig av
de novo-lipogenese
for å oppfylle deres fettsyrer krav. De T24 celler viser en lav-lipogenic fenotype under disse betingelser og ble inkorporert som en kontrollcellelinje [14], [24] – [26]. Alle disse cellelinjer ble dyrket under normale betingelser i medium med 10% fullført serum eller med 10% fett-reduserte serum. Incucyte sanntids avbildning og trypanblått eksklusjons analyser avslørte at dyrking i lipid-reduserte betingelser svekkede celleformering av de forskjellige cellelinjer til en annen grad. HOP62 viste en dramatisk reduksjon i vekstrater når dyrkes under lipid-redusert vekstbetingelser, etterfulgt av HepG2 (figur 1a-b). T24 celler var mye mindre berørt og PC3M celler ble ikke påvirket i det hele tatt (Figur 1a-b). Men den lave lipid miljø ikke induserer apoptose i PC3M og HepG2 cellelinjer (Supplerende Figur S1).
(a) Formerinasanalyse kurver for PC3M, HOP62, HepG2 og T24 celler. Celler ble sådd ut og dyrket i normal eller lipid-redusert medium og celle-proliferasjon ble overvåket ved
Incucyte sanntids billeddannelse.
Panelene på høyre side av hver kurve som viser spredning av fasekontrastrikt bilde av den tilsvarende cellelinjen i begge forhold. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (B) Antallet levende celler ble tellet ved bruk av en trypan blått fargestoff utelukkelse metode, etter 72 timers dyrkning i normal (N) eller LR medium. * Signifikant forskjellig (* p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001), N.S. ikke signifikant (p 0,05).
For HepG2, som tidligere har blitt vist å danne kompakte 3D-kuler i 3D cellekultursystemer [27] – [30], vi også studert virkninger av lipid-reduserte betingelser på en tre-dimensjonal (3D) cellekultursystem som etterligner naturlige vev og organer tettere enn to-dimensjonale (2D) cellekultursystem. I normale vekstbetingelser ble det observert en tidsavhengig økning i størrelsen av kulene (figur 2a). Men i lipid-redusert forhold HepG2-spheroid vekst ble fullstendig arrestert (figur 2a). På dag 20, ble 5-ganger større sfæroider observert i normale vekstbetingelser i forhold til lipid-redusert vekstbetingelser (figur 2a). Dette ble også gjenspeiles i antall levedyktige celler som avslørt av ATP målinger [31] (figur 2b).
(a) fasekontrastmikroskop viser HepG2-spheroid formasjon. HepG2-celler ble sådd i normal og LR medium i ultra-lav festeplater ved en tetthet på 750 celler /brønn og klyngedannelse ble overvåket i løpet av tyve dager som angitt. Kulene ble analysert ved hjelp av en
I Cell Analyzer 2000
instrument. Omkrets av kuler ble målt ved hjelp av
I Cell Analyzer 2000 programvare.
(B) Livskraftig av celler omfattende kulene ble bestemt ved måling av celle ATP innhold ved hjelp av luminescens analysen.
Kreftceller skru på
de novo
lipid syntese-veier i lipid-redusert vekstbetingelser
celle proliferasjon i lipid-reduserte betingelser forventes å avhenge av evnen av kreftceller for å syntetisere de ønskede lipidene
de novo
. Men vår nevnte spredning data ikke matche lipogenic aktivitet av kreftcellelinjer dyrket under standardbetingelser, som veksten av lav-lipogenic T24 celler var mindre påvirket enn de av lipogenic HOP62 og HepG2 celler. Derfor, vurderte vi muligheten av cellelinjene for å aktivere denne bane i lipid-reduserte betingelser. Først sjekket vi effekten av normale og lipid-redusert vekstvilkår på mRNA uttrykk profiler av store gener i
de novo
lipogenese pathways: ATP-citrate lyase (ACLY), en cytosoliske enzym som katalyserer dannelsen av acetyl -CoA for både fettsyrer og kolesterol syntese, acyl-CoA-syntetase kortkjedede familiemedlem 2 (ACSS2), som katalyserer syntesen av acetyl-CoA fra acetat, fettsyre syntase (FASN), nøkkelenzymet som er involvert i syntesen av fettsyrer og hydroksymetyl glutaryl-CoA-reduktase (HMGCR), det hastighetsbegrensende enzym i kolesterolsyntesen. Ct-verdier av de testede genene er angitt i Tilleggs Tabell S2. Interessant nok var ekspresjonen av disse enzymene økte i alle cellelinjer, inkludert den ikke-lipogenic-cellelinjen T24, men i en noe forskjellig grad, med HepG2 betyr minst responsive (figur 3a-d). Western blot-analyse av FASN og ACLY viste at disse enzymene var mest dramatisk oppregulert i lipid-redusert medium i PC3M og minst i HepG2 (figur 3e). I tråd med disse funnene, sterol regulatorisk bindende protein 1 (SREBP1) og SREBP2, som er de viktigste regulatorer av uttrykket av gener i syntesen av fettsyrer og mevalonat sti henholdsvis viste også en økt uttrykk (Supplementary figur S2) og var ytterligere aktivert på proteinnivået i lipid-redusert forholdene i HOP62, PC3M og T24 celler, men ikke i HepG2 (figur 4 annonsen og Supplerende Figur S3). Karbohydrat-responsive element bindende protein (ChREBP), en annen viktig regulator av ekspresjonen av lipogenic gener [32], ble bare uttrykt i detekterbare nivåer i HepG2-celler (leverkreft cellelinje) (Supplementary figur S4a) og i denne cellelinjen vi kunne ikke observere en aktiverings og kjernefysisk translokasjon av transkripsjonsfaktoren, når dyrket i lav-lipid forhold (Supplerende Figur S4B). I PC3M, den HOP62 og T24 cellelinjer, prostata, lunge og nyre kreft cellelinjer henholdsvis, kunne vi ikke påvise ChREBP totalt cellulære ekstrakter eller i de kjernefysiske fraksjoner, når cellene ble dyrket i lipid-redusert vekstvilkår (Supplementary figur S4B). Disse observasjonene tyder på at ChREBP ikke spiller en sentral rolle i den økte lipogenic genuttrykk i lipid-redusert forhold.
Gene uttrykk for FASN, ACLY, ACSS2 og HMGCR ble analysert ved qPCR analyse i (a) HOP62 ( b) HepG2 (c) PC3M (d) T24 celler. Celler ble dyrket i normal eller LR medium i 48 timer. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D av triplikate prøver, normalisert til TFRC for HOP62, HepG2 og PC3M eller til 18S for T24. * Signifikant forskjellig (* p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001), N.S. ikke signifikant (p 0,05). (E) FASN og ACLY ekspresjon på proteinnivå, ble analysert ved Western blot-analyse i HOP62, HepG2, PC3M og T24 cellene dyrket i henhold til normal (N) eller LR medium i 72 timer. Beta-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
(a) Representative virtuell blot av Enkel Western-analyse av forløperen og aktiv SREBP1 uttrykk i HepG2, PC3M, HOP62 og T24-celler etter 72 timers dyrking i normal (N) eller LR medium betingelser. Alfa-tubulin anvendes som en lastekontroll. Forskjellige eksponeringer av forløperen og aktiv SREBP1 er vist for å få en nøyaktig eksponering for begge formene. For opprinnelige dataene se Utfyllende Figur S3a-d. (B) Kvantitativ analyse av Simple Western. data, uttrykt som arealet under kurven (AUC). Uttrykk for SREBP1 ble korrigert for lasting kontroll alpha-tubulin. Diagrammet representerer gjennomsnitt ± standardavvik (N = 2-3). (C) Representant virtuell blot av Simple Western analyse av forløperen og aktiv SREBP2 uttrykk i HepG2, PC3M, HOP62 og T24 celler etter 72 timer dyrking i normal (N) eller LR middels forhold. Alfa-tubulin anvendes som en lastekontroll. Forskjellige eksponeringer av forløperen og aktiv SREBP2 er vist for å få en nøyaktig eksponering for begge formene. For opprinnelige dataene se Utfyllende Figur S3e-h. (D) Quantificative analyse av Simple Western. data, uttrykt som arealet under kurven (AUC). Uttrykk for SREBP2 ble korrigert for lasting kontroll alpha-tubulin. Diagrammet representerer gjennomsnitt ± standardavvik (N = 2-3).
For å underbygge våre funn på økt uttrykk av lipogenic gener i lipid-redusert forhold, ble lipid syntese bestemmes ved å måle inkorporering av radiomerket acetat i cellulære lipider. I tråd med våre andre observasjoner, ble
14C-acetetate innlemmelse betydelig økt i PC3M, HOP62 og T24 celler, da de ble dyrket i en lav-lipid miljø (Figur 5). HepG2-celler, som allerede viser en høy basal lipogenic aktivitet, ikke viser betydelig oppregulering av deres lipid-syntese når de dyrkes i lipid-redusert vekstmedium. Selv om HOP62 og T24 kan opp-regulere
de novo
lipogenese, kunne de bare nå det samme nivået av lipogenic aktivitet som HepG2 celler. I motsetning til dette kunne PC3M celler opp-regulerer deres lipogenic aktivitet til et mye høyere nivå enn de andre cellelinjer. Dette gir en indikasjon på hvorfor disse senere cellene kunne holde en normal vekst i lipid-redusert forhold og de andre tre cellelinjene ikke kunne. Disse funnene tyder på at i lipid-belastede tilstander kreft celler, uavhengig av om de er lipogenic eller ikke-lipogenic i standard kulturbetingelser, har evnen til å opp-regulerer
de novo-lipogenese
veier, det være seg til en annen utstrekning. I hvilken grad cellene oppregulerer deres lipogenic banen i en lipid redusert miljø bestemmer deres evne til å holde formerende under disse betingelser.
HepG2, PC3M, HOP62 og T24 cellene vokser i normal eller LR medium for 72 timer, ble inkubert i de siste 4 timene med
14C-acetat. Cellulære lipider ble ekstrahert og inkorporering av
14C i de cellulære lipider ble bestemt ved scintillasjonstelling. Scintillasjonsmetoder teller var normalisert for prøve-DNA innhold. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. * Signifikant forskjellig (* p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001), N.S. ikke signifikant (p 0,05).
Up-regulering av
de novo
lipid syntese indusert av lav-lipid miljø kan reverseres ved VLDL og kan tilskrives en mangel på fettsyrer og kolesterol
Deretter søkte vi om å bekrefte at induksjon av
de novo
lipogenese i henhold lipid-redusert forholdene skyldes spesifikk uttømming av lipider fra vekstmediet. Som lipid-reduserte serum fremstilles ved fjernelse av lipoproteiner så som lipoproteiner med meget-lav tetthet (VLDL) [33], som er en rik kilde av triglyserider og kolesterol, forklarer den sterke reduksjon av disse to lipider i vårt lipid-redusert FBS ( Tilsetnings tabell S1), T24-celler ble dyrket i lipid-reduserte betingelser, og mediet ble supplert med VLDL. Tilsetting av VLDL redusert uttrykk for SREBP1a, SREBP1c og SREBP2 (Supplementary figur S5a). Følgelig uttrykk for FASN, ACACA, ACLY, ACSS2 og HMGCR ble også betydelig redusert (figur 6a). Denne reduksjon i ekspresjon av de lipogenic genene ble ledsaget av en redusert aktivitet i lipogenic vei, som bestemt ved
14C-acetat-inkorporering analysen (figur 6d). For å definere om triglyserider eller kolesterol tilstede i VLDL partikkel forårsaket denne lipogenese-hemmende effekt, supplert vi cellene med triglyserider eller kolesterol alene. Tilsetting av triglyserider kan ikke reversere forhøyet lipogenese observert i T24 dyrket i lav-lipid vekstvilkår (Supplementary figur S6). Frie fettsyrer, imidlertid, resulterte i en betydelig redning. Forskjellige blandinger av mettede, mono- og flerumettede fettsyrer redusert uttrykk for SREBP1a, SREBP1c og SREBP2 (Supplementary figur S5b). Følgelig er uttrykket av FASN, ACACA, ACLY, ACSS2 og HMGCR ble også signifikant redusert etter fettsyre tilsetning (figur 6b) og ble ledsaget av en redusert aktivitet i lipogenic vei, som bestemt ved
14C-acetat-inkorporering assay ( Figur 6e). Disse resultatene viser tydelig at eksogene fettsyrer kan påvirke reguleringen av
de novo
lipogenese også i kreftceller. I motsetning til fettsyren tillegg fikk tilskudd av lipid-redusert vekstmedium med kolesterol ikke føre til redusert mRNA nivåer av SREBP1a, SREBP1c eller SREBP2 (Supplementary figur S5c), men likevel påvirket mRNA nivåene av nedstrøms lipogenic gener, FASN, ACLY, ACSS2 og HMGCR (figur 6c). Dette er i samsvar med tidligere rapporter som viser kolesterol for å regulere SREBP aktivitet ved den post-translasjonelle nivå, i stedet for på det translasjonelle nivå [34]. Den kolesterol-indusert reduksjon i ekspresjonen av lipogenic enzymer ble ledsaget av en redusert aktivitet i lipogenic pathway (figur 6f), som indikerer at også eksogene kolesterol påvirker aktiviteten av lipogenese reaksjonsveien i kreftceller.
Genekspresjon av FASN, ACLY, HMGCR og ACSS2 ble analysert ved qPCR i T24-celler ble dyrket i 48 timer i normal (N) eller LR vekstbetingelser i nærvær eller fravær av VLDL (a), forskjellige fettsyreblandinger (b) og forskjellige konsentrasjoner kolesterol (c). VLDL ble tilsatt i en konsentrasjon på 607 ug triglyserider /ml serum (tilsvarende til konsentrasjons triglyserider i normal FBS). Fettsyre (FA) blandinger var som følger, FA Bland 1: 20 uM linolensyre (18:02), 20 uM α-linolensyre (18:03), 5 uM arakidonsyre (20:04), 5 uM dokosaheksaensyre (22: 6), FA Mix 2: 10 mm 18:02, 15 um 18:03, 10 mikrometer 20:04, 15 um 22:06 og FA Mix 3: 20 mikrometer 18:02, 20 um 18:03, 5 um 20 :4, 5 uM 22:06, 30 uM oljesyre, 30 mM palmitinsyre. Ulike kolesterol (CH) konsentrasjoner er som indikert på figurene (25 mikrometer, 50 M eller 100 mm). Dataene er normalisert til 18S og representert som gjennomsnitt ± S.D. (Triplo for hvert forsøk, og n = 3). Signifikans ble bestemt ved en-veis ANOVA, etterfulgt av Tukey multiple sammenligningstest. * Signifikant forskjellig (* p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001; **** p≤0,0001) fra normal medium kontroll.
#Significantly forskjellige (
# p≤0,05;
## p≤0,01;
### p≤0,001;
#### p≤0,0001 ) fra LR kontroll. (D, e, f)
14C-inkorporering i cellulære lipider ble bestemt i T24-celler, dyrket i 48 timer i normal (N) eller LR vekstbetingelser i nærvær eller fravær av VLDL (d), forskjellige fettsyreblandinger Beta-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
